(Luận văn) ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ HIỆP lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI THÀNH THỤC VÀ NỒNG ĐỘ TINH TỚI KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH TIỀN NHÂN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHƠI LỢN THU TINH ỐNG NGHIỆM ll u nf va an lu oi m z at nh z Chuyên ngành: Động vật học m co l gm @ http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN an Lu Hà Nội - 2014 ac th si LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hiện, số liệu luận văn trung thực xác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn đầy đủ, thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn lu an n va tn to p ie gh Nguyễn Thị Hiệp d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si LỜI CẢM ƠN! Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Việt Linh, chủ nhiệm đề tài, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Bùi Xuân Nguyên, TS Nguyễn Thị Ƣớc, ngƣời thầy tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn lu an công việc chuyên môn nhƣ kinh nghiệm sống n va Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán nghiên cứu tn to Phịng Cơng nghệ Phôi đặc biệt TS Nguyễn Văn Hạnh, Ths Nguyễn Thị ie gh Hồng, Ths Nguyễn Thị Nhung, CN Nguyễn Văn Lâm nhiệt tình giúp đỡ, p ủng hộ góp ý để tơi hồn thành luận văn nl w Luận văn đƣợc hoàn thành với tài trợ Quỹ Phát triển khoa học d oa công nghệ quốc gia khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng giọt an lu noãn bào chất đơn tính lên hoạt hóa trứng phát triển phôi” mã số u nf va 106.12-2012.93 TS Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện ll oi m thủ tục hành để tơi bảo vệ luận văn z at nh Cuối xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, ngƣời ln sát cánh, ủng hộ tơi suốt q trình học tập thực luận văn z 11 tháng l Hà Nội, ngày gm @ Xin chân thành cảm ơn! 11 năm 2014 m co Học viên an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si Nguyễn Thị Hiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .v lu DANH MỤC HÌNH …vi an DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii n va tn to PHẦN I MỞ ĐẦU ie gh 1.1 Đặt vấn đề p 1.2 Mục đích oa nl w 1.3 Ý nghĩa d PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU lu Sự hình thành phát triển tế bào trứng lợn va an 2.1 ll u nf 2.1.1 Sự hình thành phát triển nang trứng oi m 2.1.2 Sự hình thành phát triển tế bào trứng z at nh 2.1.3 Sự thành thục tế bào trứng z 2.2 Thụ tinh ống nghiệm lợn 10 @ gm 2.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm giai đoạn trình thụ tinh m co l 10 2.2.2 Sự thành thục tế bào trứng lợn ống nghiệm 13 an Lu 2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết thụ tinh ống nghiệm lợn 20 http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 2.3 Tình hình nghiên cứu ni thành thục, thụ tinh ống nghiệm (IVM/IVF) Việt Nam 26 PHẦN III ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 29 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 29 3.3 Nội dung nghiên cứu tiêu theo dõi 29 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 lu 3.4.1 Chuẩn bị môi trƣờng thu rửa buồng trứng 32 an n va 3.4.2 Phƣơng pháp thu, bảo quản vận chuyển buồng trứng 33 3.4.5 Phƣơng pháp đánh giá thành thục sau nuôi 37 ie gh tn to 3.4.4 Phƣơng pháp phân loại chất lƣợng trứng 35 p 3.4.6 Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF) 38 oa nl w 3.4.7 Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng phôi nang 42 d 3.4.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 43 an lu va PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 ll u nf 4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi tới thành thục tế bào trứng lợn 44 m oi 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thụ tinh tế bào trứng lợn 48 z at nh 4.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới phát triển phôi lợn z thụ tinh ống nghiệm 50 @ m co l 54 gm 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới kết thụ tinh ống nghiệm lợn 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ tinh phát triển chất lƣợng phôi lợn 63 an Lu PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si 5.1 Kết luận 70 5.2 Đề nghị 71 DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới khả 43 thành thục tế bào trứng lợn Bảng 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới khả lu 47 an hình thành tiền nhân đực tế bào trứng lợn n va Bảng 4.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới phát 49 tn to triển tế bào trứng lợn gh Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh 53 p ie tinh trùng với trứng loại A Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh w 56 oa nl tinh trùng với trứng loại B1 d Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh lu 57 va an tinh trùng với trứng loại B2 u nf Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển 61 ll phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A m oi Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển z at nh 62 phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B1 z Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển @ 63 m co l gm phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2 an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang lu Hình 2.1 Sự hình thành phát triển nang trứng lợn Hình 2.2 Cấu tạo tế bào trứng an 33 Hình 3.2 Trứng lợn loại A, B1, B2 35 Hình 4.1 Trứng lợn giai đoạn GV (a) giai đoạn MI 44 n va Hình Buồng trứng lợn lai kinh tế p ie gh tn to Hình 4.2 Trứng lợn giai đoạn thành thục w 45 Hình 4.3-a Tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng, 4.3-b Tế bào trứng d lợn đa thụ tinh oa nl 55 an lu Hình 4.4 Phơi giai đoạn tế bào (a) giai đoạn phôi dâu (b) u nf va 65 Hình 4.4 Phơi nang (Blastocyst) 66 ll m 67 oi Hình 4.5 Số tế bào/phơi nang z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si DANH MỤC BIỂU ĐỒ Tên biểu đồ Trang lu Biểu đồ 4.1 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả xâm nhập 58 an n va tinh trùng Biểu đồ 4.2 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả hình thành tn to 59 ie gh tiền nhân Biểu đồ Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả thụ tinh p 60 nl w bình thƣờng tế bào trứng lợn Biểu đồ 4.4 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả phân chia d oa 64 an lu tế bào trứng lợn Biểu đồ 4.5 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả hình thành ll phơi nang u nf va 65 m Biểu đồ 4.6 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới chất lƣợng phôi nang oi 66 z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Tiếng Anh lu DMSO Dimethyl Sulfoxide Chất bảo quản lạnh an Equine Chorionic Gonadotropin thai ngựa Gonadotropin n va ECG tn to Yếu tố thúc đẩy tăng trƣởng Epidermal growth factor biểu mô FBS p ie gh EGF Huyết bào thai bê Fertilization medium Môi trƣờng thụ tinh oa nl w FM Fetal bovine serum Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng d FSH lu Glutathione GV Germinal vesicle Giai đoạn bóng mầm GVBD Germinal Vesicle Break Down Giai đoạn tan bóng mầm ll u nf va an GSH Human Chorionic oi m Gonadotropin IVM In vitro muaturation Luteinsing Stimulating http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN Hormone thể vàng an Lu hormone Thành thục ống nghiệm m co LH Thụ tinh ống nghiệm l In vitro fertilization gm IVF Nuôi phôi @ In vitro Culture z IVC Gonadotropin thai ngƣời z at nh HCG ac th si MI Metaphase I Trung kỳ I MII Metaphase II Trung kỳ II MPN Male pronuclear Tiền nhân đực North Carolina State NCSU 23 Môi trƣờng nuôi trứng, phôi University 23 North california state NCSU 37 Môi trƣờng nuôi trứng, phôi university 37 NST Nhiễm sắc thể pFF Porcine follicle fluid Dịch nang trứng lợn lu an Pregnant mare’s serum Huyết ngựa chửa gonadotropin n va PMSG Môi trƣờng nuôi cấy Tissue Culture Medium tn to TCM Thí nghiệm ie gh TN Thụ tinh ống nghiệm nl w Và cộng d oa Zona pellucide Màng suốt ll u nf va an lu ZP TTON vcs Tinh trùng/ml p tt/ml oi m z at nh z m co l gm @ an Lu http://www.lrc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN ac th si phôi lên 61,5 ± 2,8% 54,1 ± 3,2% Khơng có khác biệt tỷ lệ chia hai nhóm nồng độ (P>0,05) Tỷ lệ phôi nang mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml đạt 7,46 ± 1,0% Khi tăng nồng độ tinh lên 0,1 triệu tt/ml, tỷ lệ hình thành phơi nang tăng lên 14,8 ± 1,5% (P0,05 nhóm triệu tt/ml với nhóm 0,05 triệu tt/ml (P>0,05) Với trứng loại B1, nồng độ tinh không ảnh hƣởng tới chất lƣợng phơi nang Số tế bào trung bình/phơi nang mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, 0,1 triệu tt/ml, triệu tt/ml tƣơng ứng 25,0 ± 1; 23,4 ± 1,2; 21,8 ± 0,8 Sự lu an khác biệt số lƣợng tế bào/phơi nang khơng có ý nghĩa thống kê (P>0,05) n va Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn to gh tn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2 Số trứng p ie Nồng độ tinh 117 (%) nang 27 (23,0 ± 2,1)b 00,00 ± 0,00 - 49(43,2 ± 1,4)a (5,25 ± 0,7) 16,4 ±0,5 122 52 (42,5 ± 1,3)a (2,51 ± 1,0) 16,3 ± 0,7 u nf va an triệu 113 lu 0,1 triệu d oa nl w 0,05 triệu Số tế bào/phôi TN (tt/ml) Tỷ lệ phôi nang Tỷ lệ chia (%) Thí nghiệm lặp lại lần., TN:thí nghiệm ll m oi Trong cột, chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa z at nh thống kê, P0,05 Với nồng độ tinh triệu tt/ml, trứng loại B2 có hình thành phơi nang nhƣng tỷ lệ thấp, có phơi nang hình thành tổng số 122 trứng thí nghiệm chiếm tỷ lệ 2,51 ± 1,0% Trong đó, trứng loại A, B1 cho tỷ lệ hình thành phơi nang cao (P0,05 Ở nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, trứng loại A cho tỷ lệ hình thành phôi nang lu cao đến trứng B1, B2 lầ lƣợt (24,41 ± 1,1%, 14,8 ± 1,5%, 5,25 ± an 0,7%), khác biệt có ý nghĩa thống kê với P