Nồi hấp - Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao hơi bão hòa ở áp suất cao - Dùng để hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm... Dụng cụ lọc vi kh
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
LỚP 42 CNSH
-o0o -BÁO CÁO
THỰC HÀNH VI SINH VẬT
Họ và tên : Bïi ThÞ Thu Hoµi
Mã sinh viên : DTN1053150018 Lớp : 42CNSH
Trang 2PHẦN I : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT
BÀI 1 : CÁC QUY TẮC AN TOÀN – THIẾT BỊ DỤNG CỤ
VÀ HÓA CHẤT CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
I CÁC QUY TẮC CHUNG CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM
I.1 Quy định chung
1 Nắm vững nguyên tắc
2 Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo blouse, cài khuy kín, cột tóc gọn gang
3 Không nói chuyện riêng ồn ào Giữ gìn trật tự Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm
4 Không tự ý thay đổi các bố trí phòng thí nghiệm
5 Không ra vào tự do phòng thí nghiệm
6 Không mang đồ ăn, nước uống vào phòng thí nghiệm, không bảo quản thức ăn trong tử lạnh đựng mẫu và hóa chất
7 Không được đi chân trần trong phòng thí nghiệm ( do có thể có các mảnh vỡ thủy tinh, hóa chất, trên nền nhà
8 Khi tiếp xúc với các tác nhân độc ( hóa chất, vi sinh vật gây bệnh, các thiết bị phóng xạ ,…) phải mặc trang phục bảo hộ ( quần áo bảo hộ, kính, khẩu trang, gang tay, mặt nạ phòng độc, mũ,…) và tuân thủ nghiêm ngặt và tuân thủ nghiêm ngặt các quy định riêng với các tác nhân đối với tác nhân độc
9 Không nếm thử hóa chất trong phòng thí nghiệm, không được dùng miệng hút trực tiếp mà phải dùng quả hút cao su Lưu ý ko để miệng chạm vào bất cứ vật nào phòng thí nghiệm
10 Không đưa mũi ngửi trực tiếp
11 Không nhìn trực tiếp theo góc thẳng mà phải nhìn từ phía cạnh
12 Khi làm với các dung môi có múi hoặc dễ bay hơi ( phenol, chloroform, acetic acid, ) phải làm trong tủ hood
13 Hóa chất phải được gắn nhãn đầy đủ các thông tin
14 Trước khi sử dụng hóa chất đọc kỹ các nhãn mác trên vỏ chai lọ hóa chất
15 Khi chuẩn bị dung dịch hóa chất phải tuân thủ quy trình pha ( không được đổ nước vào dung dịch acid đậm đặc mà phải cho từ từ acid vào nước)
Trang 316 Chất thải trong phòng thí nghiệm phải được phân loại, được cho vào túi bong buộc chặt lại trước khi đưa ra ngoài môi trường
17 Cần ghi chú tên chủng, ngày thángthí nghiệm, người làm thí nghiệm lên tất cả các hộp peptri, ống nghiệm
18 Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dây lên quần
áo, sách vở, dụng cụ cá nhân Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo, sách vở và dụng cụ cá nhân Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da quần áo khỏi
bị hóa chấy và thuốc nhuộm dính vào
19 Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn Tắt đèn cồn khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi sử dụng xong Tuyệt đối không được dùng đèn cồn để mồi đèn cồn
20 Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ trong thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn cụ thể Sử dụng theo hướng dẫn, hết sức thận trọng, tránh làm
đổ vỡ và hư hỏng
21 Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo quy trình và sắp xếp vào đúng nơi quy định
II NHỮNG TRANG THIẾT BỊ CƠ BẢN ĐƯỢC DÙNG TRONG PHÒNG THÍ
NGHIỆM VI SINH VẬT
1 Tủ sấy
- Nhiệt độ từ 60oC – 200oC
- Dùng để sấy khô, khử trùng các loại dụng cụ chịu được sức nóng khô, chú
ý là dụng cụ thủy tinh, kim loại Tùy thuộc vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy
ở chế độ nhiệt độ và thời gian khác nhau
2 Thủ lạnh và tụ mát
- Dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi khuẩn, các chế phẩm sinh học (vacxin, huyết thanh, kháng sinh,…) hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường
3 Nồi hấp
- Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao ( hơi bão hòa ở áp suất cao)
- Dùng để hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm
Trang 4- Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất thích hợp, thường dùng ở 121oC / 1 atm / 15 phút
4 Cân phân tích điện tử
- Trọng lượng từ 100µg – 200g
- Độ chính xác 10-4g
- Dùng cân hóa chất, môi trường
5 Tủ ấm
- Nhiệt độ từ 20oC – 60oC, có chế độ ổn định nhiệt độ
- Sử dụng nuôi cấy vi sinh vật tại n hiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng, tùy từng đối tượng nuôi cấy mà ủ ở nhiệt độ khác nhau để
vi sinh vật có thể phát triển tốt
6 Kính hiển vi
- Vai trò quan trọng nghiên cứu vi sinh vật
- Dùng nghiên cứu, quan sát đặc điểm hình thái, sinh lý của tế bào ci sinh vật nhờ vào khả năng phóng đại của kính
7 Dụng cụ lọc vi khuẩn
- Dùng để khử trùng các loại môi trường không chịu được nhiệt và áp suất cao
8 Tủ cấy vi trùng
- Có không gian vô trùng
- Dùng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô trùng
9 Máy lắc
- Dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau ( lắc vòng hay lắc ngang) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường
10.Các thiết bị khác
- Máy cất nước
- Bể ổn nhiệt
- Nồi lên men
11.Dụng cụ
- Lá kính(lamen): đậy vế bôi trên tiêu bản giúp quan sát dễ dàng
- Phiến kính( lam kính) dùng làm tiêu bản cho nghiên cứu hình thái, sinh lí
tế bào
- Phiến kính lõm : giúp nghiên cứu có khả năng di chuyển, sự hình thành bào tử
và đặc điểm sinh sản tế bào
- Phiến kính có khung đếm Goriaep: dùng kiểm tra số lượng tế bào có kích thước lớn
Trang 5- Micropipet: Đây là ống hút chính xác nhất cho phép hút những lượng chất chính xác
- Đĩa petri: dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy và phân lập
tế bào vi sinh vật
- Bình tam giác: Dùng để nuôi cấy, nhân giống, chứa các lpaij môi trường Có nhiều loại : 100 ml, 150ml; 250 ml; 500ml; 1000 ml thường sử dụng là 250 ml
- Que gạt ( que trang) : để phân lập, tuyển chọn tế bào
- Que cấy : gồm que đầu tròn, que đầu nhọn, que cấy đầu hình thước thợ
- Công dụng chủ yếu là lấy giống, cấy truyền và làm tiêu bản vsv
12.Hóa chất
BÀI 2: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ NUÔI CẤY
XỬ LÝ TRUNG TÍNH DỤNG CỤ
1 Phương pháp trung tính dụng cụ
- Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH = 7
- Hấp dụng cụ ở 12oC trong 30 phút
- Lấy dụng cụ ra để nguội khoảng 30 oC rử kỹ bằng nước nhiều lần
- Kiểm tra lại pH trong dụng cụ
- Nếu nước có pH kiềm thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2% cho đến khi kiểm tra lại thấy nước có pH bằng 7 thì thôi
- Và tiếp tục rử lại nước nhiều lần là được
2 Rửa dụng cụ
Phiến kính
- Bước 1 : Chùi sạch mỡ hay vazowlin trên phiến kính bằng vải tẩm xylem hay ngâm tieu bản vào dung dịch sunphobicromat trong 48 giờ
- Bước 2: Rửa lại bằng xà phòng và để ráo nước
- Bước 3 : Lau khô chúng bằng vải mịn rồi sấy khô ở 37o C
Lưu ý : nhỏ dầu vào môi trường lam kính để đồng nhất một môi trường vì khi 2 môi
trường ánh sang sẽ bị khúc xạ
Trang 6Ống nghiệm :
- Dùng chổi để rử sạch mỡ trong ống nghiệm
- Với ống nghiệm cũ đã bị nhiễm khuẩn
- Bước 1 : Hấp khử trùng ở 120oC trong 30 phút
- Bước 2 : Lấy ra và đổ các vật phẩm trong ống nghiệm đi
- Bước 3: ngâm nước nghiệm trong nước ấm
- Bước 4: Rửa ống nghiệm
Đĩa petri
- Bước 1 : Đặt ngửa đĩa petri trong lòng bàn tay trái
- Bước 2 : Tay phải dùng giẻ chấm xà phòng xát vào 2 mặt của đĩa , các khe ở chân đĩa và thành đĩa
- Bước 3 : Rửa nước 2-3 lần
- bước 4 : úp nghiêng các đĩa trong giỏ nhựa cho khô
Dụng cụ thủy tinh : phễu, chai, lọ, bình cầu, bình tam giác
- Bước 1 : Dùng giẻ với nước xà phòng cọ rửa phần ngoài dụng cụ
- Bước 2: Dùng chổi rửa sạch phần bên trong bằng xà phòng
- Bước 3: Sau tráng với nước 3-4 lần
- Bước 4: Úp ngược các dụng cụ đó cho khô
Nút và ống cao su
- Bước 1: Phân loại nút theo kích thước to nhỏ, xấu, sạch, bẩn
Trang 7- Bước 2 : Cọ rửa kỹ trong nước xà phòng
- Bước 3 : Rửa nước sạch thật nhiều
- Bước 4: Phơi nắng 2- 3 giờ rồi cấy đi dùng dần
Lưu ý phơi ở nắng yếu
BAO GÓI DỤNG CỤ
Cách làm nút bông
Bước 1 Cắt một mảnh vải màn tùy theo dụng cụ ống nghiệm hay bình tam giác hay chai lọ, đặt lên trên
- Bước 2: Cho bông mỡ vào vải, nhồi chặt cho phù hợp với từng loại dụng cụ
Bước 3: Túm vải lại dùng chỉ buộc chặt bông lại
Lưu ý: khi nào có tiếng bóc là nút bông đã thành công
Cách bao gói cụng cụ
Sử dụng: giấy báo hay giấy dầu vì nếu hấp khử trùng nút bông sẽ bị ướt nên vô
trùng không tốt
Cách làm:
- Bước 1: Cắt các băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ bao gói
- Bước 2: Quấn băng giấy quanh đầu của bút bông
- Bước 3: Gấp nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào bên trong
Lưu ý
Phần giấy bao ngoài phải chặt và kín , bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt, giấy báo với dụng cụ hấp khô
KHỬ TRÙNG DỤNG CỤ
Khử trùng bằng tủ sấy
- Bước 1: Các dụng cụ được gói cẩn thạn và xếp gọn vào tủ sấy
- Bước 2: bật công tắc để tủ hoạt động
- Bước 3: Điều chỉnh thời gian phù hợp ( thướng 120 oC trong 2 giờ hoặc 180 oC trong 30 phút
- Bước 4: Tắt tủ cấy để nguội tới 60oC mới mở tủ lấy dụng cụ
Lưu ý giấy bào có màu hơi vàng là đạt yêu cầu
Khử trùng bằng đốt qua lửa nung đỏ
-Dụng cụ : ống hút, que cấy, đầu các ống nghiệm, que cấy, đầu các ống nghiệm, miệng các bình tam giác sau khi lấy nút bông ra
Cách thức:
Trang 8- Bước 1: Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại 3-4 lần với các đầu que cấy bằng kim loại phải nung thật đỏ
- Bước 2: Đợi cho dụng cụ nguội mới được dùng tránh vỡ dụng vụ và chết mẫu I sinh vật Cũng có thể nhúng dụng cụ vào cồn 90oC rồi đốt để khử trùng
Đun sôi trong nước
Dụng cụ: kim tiêm, kéo, kẹp, cốc thủy tinh,……
Cách thực hiện:
- Bước 1: Dùng nước máy sạch đổ ngập dụng cụ
- Bước 2: Đun sôi liên tục trong 30 phút đến 1 giờ
Lưu ý : chiir tiêu diệt được tế bào sinh dưỡng mà không tiêu diệt được bào tử vi
sinh vật để khắc phục người ta cho thêm acid phenic 5%
Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp ( phương pháp khử trùng Pasteur)
Các thực phẩm dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao như : bia, rượu, sữa,…
Cách thực hiện : Đun nóng môi trường lên 60 – 70 oC trong 15 – 30 phút hoặc là
80OC trong 10 – 15 phút
Hấp cách quãng ở 100 O C ( phương pháp Tuyndal)
Dùng khử trùng một số môi trường như men bánh mì, mốc làm nước chấm… Các thực hiện :
- Bước 1: Hấp môi trường ở 100OC từ 30 – 40 phút
- Bước 2: Lấy ra để trong tủ ấm trong 24 giờ cho các bào tử vi sinh vật nảy mầm
- Bước 3: Hấp môi trường lần thứ hai ở 100OC trong 30 – 40 phút để diệt bào tử vừa nảy mầm
- Bước 4 : Lặp lại quá trình này từ 3 -4 lần
Khử trùng bằng hơi nước bão hòa
Thiết bị : bằng kim laoij, chịu được nhiệt độ và áp suất cao có khả năng tự động
điều chỉnh áp suất và thời gian khử trùng theo yêu cầu người sử dụng
Các thực hiện:
- Bước 1: Chuẩn bị các dụng cụ, nguyên liệu càn khử trùng
- Bước 2: Kiểm tra và điều chỉnh lượng nước cho phù hợp sap cho lượng nước bên trong nồi hấp phải ngập thanh đốt
- Bước 3: Xếp các dụng cụ và nguyên liệu vào nồi hấp
Trang 9- Bước 4: Đóng chặt nồi hấp và các phan xả
- Bước 5 : cắm phích điện
- Bước 6: Bật công tắc khử trùng của nồi
- Bước 7 : Điều chỉnh nhiêt độ và thời gian cho phù hợp
- Bước 8: Chờ áp suất về 0atm mới được mở nắp lấy dụng cụ và nguyên liệu ra
Lưu ý: Kiểm tra nồi hấp trước khi dùng, tránh cu cấp điện đột ngột sẽ gây vỡ thiết bị hay gây nổ rất nguy hiểm, phải kiểm tra định kì đồng hồ áp kế và van an toàn
Khử trùng bằng cách lọc
Khử trùng các loại môi trường không thích ứng với nhiệt độ cao ( như môi
trường huyết thanh, dung dịch anbumin, và môi trường thường) và tách các vi sinh vật với các sản phẩm trao đổi chất
Các tiến hành:
- Bước 1: Hấp khử trùng ống lọc, bình chứa dịch lọc và các phụ tùn kèm theo ở áp suất 1 atm, 120 OC trong 30 phút
- Bước 2: Đặt màng lọc vào giữa ống lọc và bình dung dịch lọc rồi cố định
3 bộ phận này bằng các ốc vít
- Bước 3: Đổ dịch lọc vào ống lọc
- Bước 4: Nối bình đựng dịch lọc với bình tam giác được gắn liền với bình hút chân không Trong đoạn vòi nối có bông để hạn chế sự nhiễm trùng dịch lọc
- Bước 5: Cho máy hút chân không hoạt động để đưa độ chênh lệch áp suất lên từ từ và dịch lọc chảy thành giọt áp suất không quá 30 -45 cm thủy ngân
- Bước 6: Thời gian lọc không được quá 30 phút
- Bước 7: Lọc xong lấy một ít dịch lọc cấy vào môi trường sạch – nước thịt peptone để trong tủ ấm 37 độ C kiểm tra độ vô trùng của dịch đã lọc
- Bước 8: Bỏ màng lọc đi vì màng lọc này chỉ được sử dụng một lần
Khử trùng bằng tủ cấy vô trùng
Thiết bị : phối môi trường vào dụng cụ cấy truyền nghiên cứu phân lập tuyển
chọn vi sinh vật
Các thực hiện : Bầu không khí bên trong tủ cấy luôn được đảm bảo vô trùng
hay ít nhất cũng đảm bảo hạn chế tối đa sự tồn tại của vi sinh vật không mong muốn cũng như bào tử của chúng
BÀI 3: PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG
( NUÔI CẤY NẤM MEN BÁNH MÌ)
Trang 10I HÓA CHẤT
- Đường
- Pepton
- KH2PO4
- MgSO4.7H2O
- Nước
- Agar
II DỤNG CỤ
- Đĩa petri
- Bình tam giác
- Cốc thủy tinh 250ml
- Pipet
- Cân
- Micropipet
- Đũa thủy tinh
- Que chang
- Giấy bạc
- Cân
- Máy khuấy
- Bánh mì
- Cối chày sứ
III CÁCH THỰC HIỆN
Lấy hóa chất:
Dùng cân để cân hóa chất :
- Đường : 6g
- Pepton: 1g
- KH2PO4: 0.6g
- MgSO4.7H2O: 0.6g
- Nước : tới 250ml
- Aga : 3g
Pha dung dịch
- Cho các chất Đường, Pepton, KH2PO4, MgSO4.7H2O, cho nước tới 250ml vào trong bình đong khuấy cho được hòa tan các chất
Điều chỉnh pH của môi trường
Trang 11- Ta dùng kẹp kẹp mẩu sứ của máy khuấy cho vào bình đong 250ml đặt dung dịch lên máy khuấy
- Bật công tắc máy khuấy để dung dịch được khuấy đều
- Cho máy chuẩn độ pH sao cho pH 5,4 tới 5.8
- Ta dùng micropipette để điều chỉnh pH , cho từ từ dung dịch thích hợp vào bình
Nếu pH cao thì mình cho thêm acid HCl vào Nếu PH thấp ta cho NaOH thêm
Lưu ý không cho nhiều lần pH nếu không sẽ ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy
Đưa ra dụng cụ và khử trùng môi trường
- Ta đưa từ bình chứa vào bình tam giác
- Cho aga vào
- Dùng giấy bạc bọc miệng bình tam giác
- Khử trùng ở 1,5atm trong 20 -30 phút
Đổ thạch ra đĩa petri
- Dùng tay trái cầm đĩa petri mở một góc 45 độ
- Đưa trước ngọn lửa đèn cồn
- Đổ một lượng môi trường vào đĩa peptri cho phù hợp
- Đợi môi trường đông lại
BÀI 4: BẢO QUẢN
MỚI
Đối tượng áp dụng: tất cả các loài vi sinh vật
- Với nấm men, vi khuẩn cẩy truyền trong 1 -2 tháng
- Với nấm mốc cấy truyền 3 – 6 tháng
Ưu điểm
- Đơn giản
- Dễ làm
Nhược điểm:
- Tốn môi trường, công sức, thời gian
- Phẩm chất ban đầu có thể bị thay đổi
Trang 12II. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ
- Phương pháp này làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do
- Giảm thậm chí ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật
- Có thể chịu được nhiều tác động của ngoại cảnh
- Phương pháp này chỉ dùng trong sản xuất
- Thời gian bảo quản tới vài chục năm
III. NUÔI CẤY NẤM MEN BÁNH MÌ
Chuẩn bị :
- Bánh mì
- Chày, cối sứ
- Nước cất
- Cân
- Que chang
- Đèn cồn
Tiến hành
- Bước 1: Lấy bánh mì đi cân lấy ra 1g bánh mì
- Bước 2: Dùng chày sứ, cối sứ nghiền nhỏ bánh mì
- Bước 3: Lấy 99 ml nước cất và 1g bánh mì đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giác lắc đều ta thu được nồng độ là 10-12
- Bước 4: Lấy 1 ml trong bình tam giác vào ống van côn của micropipette nồng
độ pha loãng 10-4
- Bước 5: Lấy cho dung dịch vào trong đĩa petri ( lưu ý thực hiện trên vùng diệt khuẩn của đèn cồn)
- Bước 6: Cho vào tủ cấy
BÀI 5 : PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI SINH VẬT
I NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ
- Thuốc nhuộm màu xanh metylen 0.001%
Trang 13- Nước cất
- Nam kính
- Lamen
- Que cấy
- Đĩa petri chứa men bánh mì
- Kính hiển vi, dầu soi
- Pipet
II CÁCH TIẾN HÀNH
Lấy giống làm tiêu bản:
- Bước 1 : Đốt đèn cồn
- Bước 2: Lấy lam kính nhỏ một giọt nước cất lên trên lam kính
- Bước 3 : Lấy mẫu
Đặt đĩa petri trên lòng bàn tay trái
Dùng que cấy lấy giống nhẹ nhàng lấy mẫu nấm men
Nhuộm màu tiêu bản
- Bước 1: Nhỏ một giọt xanh metyllen lên vết bôi
- Bước 2: Đậy lamen
Lưu ý là để lamen nghiêng 45 độ rồi hạ từ từ lamen xuống tránh hình thành bọt khí
Làm khô tiên bản
Khi ta đã có tiêu bản trên lament là tới giai đoạn làm khô tiêu bản bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khi khô tiêu bản
Quan sát tiêu bản
- Bước 1: Cố định tiêu bản trên giá
- Bước 2: Điều chỉnh mắt kính
Ta điều chỉnh soi ở mắt kính 10 tới khi thấy lờ mờ thì soi ở mắt kính 40
III KẾT QUẢ QUAN SÁT:
- Ta quan sát thấy quần thể nấm men bánh mì, có hình cầu nắm thành từng đám