ký thuật thực hành vi sinh vật cơ bản

ký thuật thực hành vi sinh vật cơ bản PHẦN A: GIỚI THIỆU VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP1.1.Giới thiệu chungi1.2.Chức năng Nhiệm vụii1.3.Cơ cấu tổ chứciii1.4.Giới thiệu về phòng vi sinh vật họciiiPHẦN B: NỘI DUNG THỰC TẬPCHƯƠNG I : CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT1Những qui đinh chung:1CHƯƠNG II : THỰC HÀNH CÁC TRANG THIẾT BỊ DỤNG CỤ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG22.1. TRANG THIẾT BỊ DỤNG CỤ.22.1.1. Một số trang thiết bị, dụng cụ thông dụng.22.1.2. Dụng cụ82.1.2.1. Thủy tinh:82.1.2.2. Các dụng cụ khác:82.2. THỰC HÀNH CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG.8CHƯƠNG III: THỰC HÀNH PHA CHẾ MÔI TRƯỜNGDINH DƯỠNG93.1.CHUẨN BỊ DỤNG CỤ93.1.1. Các dụng cụ thường được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật9phải được vô trùng).93.1.2. Cách xử lý dụng cụ trước khi rửa93.1.3. Cách rửa dụng cụ93.1.4. Chuẩn bị dụng cụ để khử trùng103.1.5. Khử trùng các dụng cụ thuỷ tinh113.2. THỰC HÀNH PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG113.2.1. Đổ môi trường MPA 300ml113.2.2. Đổ môi trường Sammo 300ml123.2.3.Đổ môi trường Czapek 300ml133.2.4. Đổ môi trường tinh bột ( Starch medium ) 500 ml133.2.5. Đổ môi trường Gauzer I 500ml143.2.6. Đổ môi trường Hansens 500ml153.2.7. Đổ môi trường EC (Enrichmen coli) 500ml16CHƯƠNG IV : THỰC HÀNH PHƯƠNG PHÁP TẠO KHUẨN LẠC ĐƠN TỪ MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP SINH VẬT174.1.Tạo khuẩn lạc đơn đối với vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật ria.174.2. Tạo khuẩn lạc đơn đối với vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật hộp trải.18PHỤ LỤC20A. HÓA CHẤT.20B. THUỐC THỬ VÀ CHỈ THỊ MÀU:20C. MÔI TRƯỜNG.21

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

PHẦN A: GIỚI THIỆU VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP 1.1.Giới thiệu chung

Viện Công nghệ môi trường (Institute of Environmental Technology, IET) thuộc ViệnHàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Vietnam Academy of Science andTechnology, VAST) được thành lập theo Quyết định số 148/2002/QĐ-TTg ngày30/10/2002 của Thủ tướng Chính phủ của Chính phủ Nước Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩaViệt Nam

1.1.1 Các đơn vị nghiên cứu trực thuộc VN

01 phòng Quản lý tổng hợp; 10 phòng nghiên cứu; 01 Trung tâm Công nghệ môi trườngtại Thành phố Hồ Chí Minh; 01 Trung tâm Công nghệ môi trường tại Thành phố

Đà Nẵng, 01 Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ môi trường, 01 Trung tâmPhát triển công nghệ cao, Trung tâm hợp tác Khoa học và Công nghệ Việt - Nga;

1.1.2 Đội ngũ cán bộ

Tổng số cán bộ là 171 người, trong đó có 01 GS.TS; 4 PGS.TS; 16 TS; 40 ThS; 90 cửnhân và kỹ sư, 20 kỹ thuật viên và công nhân kỹ thuật

1.1.3 Một số thành tự nổi bật

a Nghiên cứu khoa học

Đã và đang thực thực hiện thành công 05 đề tài, nhiệm vụ KHCN cấp nhà nước, 4 nhiệm

vụ KHCN theo nghị định thư, 5 nhiệm vụ thuộc chương trình mục tiêu Quốc gia, 30 đề tàinghiên cứu KHCN cấp Bộ, 15 đề tài NCCB;

b Triển khai ứng dụng

Nhiều công trình nghiên cứu của Viện đã được ứng dụng vào thực tiễn phục vụ sản xuất

và đời sống mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội - được nhiều cơ quan, đơn vị và địaphương trong cả nước quan tâm và đánh giá cao Ví dụ: hệ thống xử lý nước thải, lò đốtrác y tế …;

c Công tác đào tạo

Đã tham gia phối hợp đào tạo đại học và sau đại học với các Viện nghiên cứu, các trườngĐại học như: Đại học Bách khoa Hà Nội, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học PhươngĐông ;

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Tính đến nay, Viện đã và đang hướng dẫn cho 10 nghiên cứu sinh, 46 học viên cao học,

110 sinh viên đại học trong và ngoài nước, đào tạo 140 cán bộ ngắn hạn cho các tỉnh,thành phố trực thuộc Trung ương Trao đổi hợp tác khoa học trong khuôn khổ của các dự

án quốc tế, Viện đã thực hiện 60 chuyến đi công tác nước ngoài với mục đích tham dự hộinghị và trao đổi khoa học; cử 90 cán bộ tham gia các khoá đào tạo ngắn hạn;

d Hợp tác quốc tế

Đã xây dựng, duy trì và phát triển các mối quan hệ hợp tác quốc tế về nghiên cứu, triểnkhai và đào tạo với nhiều nước và các tổ chức quốc tế Viện thường xuyên cử các cán bộkhoa học đi nghiên cứu, thực tập và đào tạo sau đại học tại các nước như: Nhật Bản, HànQuốc, Nga, Canada, Úc, Đức, Pháp, Mỹ, Bỉ,…

e Cơ sở làm việc

Trụ sở chính của Viện: Nhà A30, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội;

Trung tâm Công nghệ môi trường tại Thành phố Hồ Chí Minh: Số 1 Mạc Đĩnh Chi, TP

Hồ Chí Minh;

f Trang thiết bị nghiên cứu

Viện Công nghệ môi trường đã tiếp nhận thiết bị nghiên cứu khoa học từ các dự án, đặcbiệt là dự án JICA - Nhật Bản: "Tăng cường năng lực của Viện Khoa học và Công nghệViệt Nam trong lĩnh vực bảo vệ môi trường nước" và Dự án KOICA - Hàn Quốc: “Tăngcường năng lực bảo vệ môi trường cho một số ngành công nghiệp trọng điểm ở ViệtNam” Với hệ thống thiết bị hiện đại và tương đối đồng bộ hiện có, cộng với những thiết

bị đầu tay được trang bị tới từng Phòng thí nghiệm, bước đầu Viện Công nghệ môi trường

đã nâng cao được chất lượng và hiệu quả của các đề tài nghiên cứu khoa học, mở rộngquan hệ hợp tác với các Viện nghiên cứu, các Trường đại học trong nước và quốc tế, gópphần đào tạo đội ngũ cán bộ khoa học trẻ

1.2.Chức năng - Nhiệm vụ

Viện Công nghệ môi trường đã được Thủ tướng Chính phủ giao các Chức năng - Nhiệm

vụ như sau:

1.2.1 Chức năng của Viện Công nghệ môi trường

Nghiên cứu những vấn đề Khoa học - Công nghệ thuộc lĩnh vực môi trường

1.2.2 Nhiệm vụ của Viện Công nghệ môi trường

a) Nghiên cứu các vấn đề cơ bản và các vấn đề liên quan nhằm xây dựng cơ sở phát triểncho ngành khoa học môi trường

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

b) Nghiên cứu công nghệ mới, công nghệ tiên tiến trong lĩnh vực ngăn ngừa xử lý ônhiễm môi trường, phục vụ phát triển bền vững ở Việt Nam

c) Nghiên cứu sản xuất các vật liệu, thiết bị đo đạc, thiết bị xử lý, nhằm phục vụ côngtác bảo vệ môi trường

d) Dịch vụ Khoa học - Công nghệ trong lĩnh vực bảo vệ môi trường:

e) Hỗ trợ trong công tác quản lý môi trường: tham gia xây dựng cơ sở dữ liệu môi trường,xây dựng và thực hiện các chiến lược, các chương trình hành động bảo vệ môi trườngvùng và quốc gia

f) Tư vấn cho các cơ quan quản lý Nhà nước, các tổ chức, các doanh nghiệp trong việcbảo vệ môi trường, ứng dụng các công nghệ tiên tiến vào sản xuất

1.3.Cơ cấu tổ chức

1.4.Giới thiệu về phòng vi sinh vật học

Phòng Vi sinh vật môi trường được thành lập theo quyết định số 17/QĐ-VCNMT ngày12/2/2007 của Viện Công nghệ môi trường:

Chức năng, nhiệm vụ:

Phòng vi sinh vật môi trường nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực vi sinh vật học ứngdụng trong công tác bảo vệ môi trường

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

d Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong đấu tranh sinh học và phát triển nông nghiệpbền vững

e Nghiên cứu cơ bản các đối tượng vi sinh vật chỉ thị (Hình thái, Sinh thái, Sinh lý, )

f Triển khai áp dụng vào thực tiễn những đối tượng vi sinh vật chỉ thị phù hợp với điềukiện Việt Nam

g Xây dựng các chỉ tiêu sinh học trong sinh quan trắc

h Tham gia Mạng lưới quốc gia về quan trắc Môi trường Xúc tiến dịch vụ tư vấn khoahọc kỹ thuật trong lĩnh vực sinh quan trắc

i Hợp tác quốc tế trong nghiên cứu khoa học và đào tạo cán bộ trong lĩnh vực liên quan

j Đào tạo và tham gia đào tạo đại học và sau đại học về Công nghệ Sinh học Môi trường.k.Tham gia đào tạo và tư vấn trong các lĩnh vực liên quan

 Những qui đinh chung:

- Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm

- Khi vào phòng thí nghiệm vào mặc áo Blose

- Mang khẩu trang , găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất

- Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép , giấy ghi chép.Tất

cả các vật dụng cá nhân , áo khoác , túi sách , sách vở ,…phải để đúng nơi quy định

- Trước và sau kết thúc thí nghiệm , phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sáttrùng đã chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh

- Cần ghi chú tên chủng , ngày tháng thí nghiệm, người làm thí nghiệm lên tất cảcác hộp petri, ống nghiệm ,…

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen Tắt ngọn lửa khi chưa cónhu

cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác

- Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng quitrình và sắp xếp vào đúng nơi qui định

CHƯƠNG II : THỰC HÀNH CÁC TRANG THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - CÁC

PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG

2.1 TRANG THIẾT BỊ - DỤNG CỤ.

2.1.1 Một số trang thiết bị, dụng cụ thông dụng.

2.1.1.1 Tủ sấy (vacuum oven)

xếp các thứ vào trong tủ rồi đóng kín cửa và đóng các lỗ thông khí

- Bật công tắc điện, đặt chế độ làm việc cho tủ (điều chỉnh nhiệt độ và thời giangiống

như với tủ định ôn) Thông thường dụng cụ nuôi cấy và phân tích vi sinh vật đượckhử trùng ở 160-180oC trong 2 h Với các dụng cụ, như: pipét, xi lanh,… khôngđược sấy quá 60oC vì nhiệt độ cao làm giãn nở thuỷ tinh dẫn đến mất độ chính xáccủa dụng cụ

- Sau khi ngắt mạch điện, chờ nhiệt độ hạ dần xuống bằng nhiệt độ phòng thì mớiđuợc mở cửa tủ để lấy dụng cụ sấy ra

Hình 1.Tủ sấy

2.1.1.2 Tủ ấm (incubator or etuve )

a) Cấu tạo

Cấu tạo vỏ tủ nuôi cấy có 2 lớp: lớp trong là kim loại dẫn nhiệt để giữ nhiệt độ bêntrong của tủ, lớp ngoài là kim loại dày hơn và được bọc phía trong bởi một chất cáchnhiệt (amiant) Giữa lớp trong và lớp ngoài là khoảng trống để giữ cho nhiệt độ trong

tủ ít bị biến đổi

b) Cách sử dụng

-Đóng mạch điện, bấm nút mở công tắc tủ (có thể giữ vài giây đến khi xuất hiện đènbáo trên bảng điện tử) Sau đó bấm nút đặt nhiệt độ và thời gian (set up) theo yêu cầunuôi cấy, điều chỉnh nhiệt độ và thời gian bằng ấn nút tương ứng mũi tên lên hoặcxuống Nhiệt độ trong tủ ấm tăng dần và đạt tới nhiệt độ đã xác định

- Nhiệt độ sẽ được duy trì trong suốt thời gian nuôi cấy đã định sẵn Trên bảng điện tửluôn xuất hiện chỉ số báo nhiệt độ thực tế trong tủ Khi đủ thời gian nuôi cấy, tủ sẽphát ra tiếng báo hiệu và rơ le tự ngắt để tự động tắt chế độ làm việc

-Nếu muốn nuôi cấy liên tục lâu dài có thể không cần đặt chế độ thời gian, chỉ đặtnhiệt độ Khi nào muốn kết thúc thì bấm nút tắt công tắc nguồn

- Khi sử dụng máy cần chú ý những điểm sau đây :

+ Hiệu chỉnh thiết bị trước khi sử dụng

+ Phải nối tủ với dây đất và kiểm tra điện thế của máy với điện thế ở nơi đặt máy xem

có giống nhau không, trường hợp không giống nhau phải dùng biến thế

+ Khi sử dụng tủ ấm lần đầu, phải kiểm tra bộ phận điều chỉnh nhiệt độ xem có chínhxác không, nhiệt độ trong tủ có đều không

+ Cửa tủ luôn luôn phải đóng kín, trừ khi lấy hoặc cho nguyên liệu vào nuôi cấy nhưngcũng không được mở cửa tủ rộng và lâu

+ Luôn luôn phải đảm bảo cho tủ ấm được khô ráo, sạch sẽ, phải cho tủ hoạt độngthường xuyên nhất là những hôm trời ẩm Khi làm đổ các chất dịch nuôi cấy hoặc làmbẩn trong tủ, phải lau chùi và sát trùng ngay

+ Nên đặt trong tủ 1 cốc nước vô trùng trong quá trình nuôi cấy để giúp cho quạt gióhoạt động tốt

+ Khi không dùng, tắt công tắc điện và rút phích cắm điện ra

2.1.1.3 Tủ lạnh hay tủ mát ( freezer )

- Dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi khuẩn, các chế phẩm sinh học(vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh,…), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt

độ thường

- Tủ lạnh 00- 40 C dùng để giữ giống vi khuẩn

- Tủ lạnh -150 C đến -300 C dùng để giữ giống virus

2.1.1.4 Nồi hấp ướt ( Autoclave )

- Khi đạt tới thời gian cần thiết thì ngắt điện (ấn nút off) hoặc rút hết nhiên liệu ra vàđợi cho áp lực hạ dần xuống 00 C, nhiệt độ trong nồi giảm hẳn rồi mới được mở nắplấy dụng

cụ đã khử trùng ra

- Các dụng cụ lấy ra không được để ở nền gạch men, nền đá, nền xi măng (vì dụng cụđang nóng gặp lạnh sẽ vỡ, nứt) và đảm bào tính vô trùng cho dụn

Hình 2 : Nồi hấp

2.1.1.5 Cân phân tích điện tử (analytical balance)

Trọng lượng từ 100µg – 200g Độ chính xác 10-4g Cân kỹ thuật (technical

balance)-độ chính xác 10-2g Dùng cân hóa chất, môi trường

A BHình 3 : A- cân phân tích, B- cân kỹ thuật

2.1.1.6 Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (UV) (flux laminar )

Có không gian vô trùng được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèntửngoại và bộ phận thổi khí vô trùng

Hình 4: tủ cấy

2.1.1.7 Máy ly tâm (centrifuge)

Máy ly tâm có công dụng:

- Tập trung ở đáy ống các phần tử cần nghiên cứu chứa trong một bệnh phẩm hay chấtmang

- Tập trung vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng để tách riêng vi khuẩn

- Làm trong một chất lỏng chứa nhiều phần tử đặc vẩn đục

- Tách hồng cầu riêng với huyết tương…

Hình 5: máy ly tâm

2.1.1.8 Máy lắc (shaker):

Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi cấy theocác chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòatan

trong môi trường

Hình 6: máy lắc

2.1.1.9 Máy đo pH (pH meter)

đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy,…

A BHình 7: A- máy đo pH để bàn, B- máy đo pH cầm tay

2.1.1.10 Máy cất nước (single/ double water stills)

Dùng để cất nước

Hình 8: máy cất nước 1 lần

2.1.1.11 Nồi lên men (fermenter): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật.

Hình 9: Nồi lên men

2.1.1.12 Các thiết bị khác

Máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đông khô,…

2.1.2 Dụng cụ

2.1.2.1 Thủy tinh:

- Có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ống nghiệm, đĩapetri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bìnhđịnh mức,… yêucầu phải sạch, trong, trung tính Trước khi dùng đựng môi trường phải được sấy khô,làm nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô

- Đối với dụng cụ mới: cần ngâm nước hoặc dung dịch H2SO4 loãng trong 24giờ

Sau đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính

- Đối với dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khửtrùng

rồi mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô

sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây nhựa hoặc thun

 Đối vớicác đĩa petriđược bao gói kỹ, đối với các bình và ống môi trường có nútbông phải bọc bằng giấy dầu sao đó cho vào nồi khử bẩn.ở áp suất cao

CHƯƠNG III: THỰC HÀNH PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

DINH DƯỠNG

3.1.CHUẨN BỊ DỤNG CỤ

3.1.1 Các dụng cụ thường được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật

- Đĩa petri (hộp lồng)

- ống nghiệm, bình tam giác, bình cầu, chai thuỷ tinh

- Pipét, xi lanh, que gạt, que cấy

- Lam kính, lamen

 Yêu cầu:Các dụng cụ phải sạch về mặt hoá học và vi sinh vật học (các dụngcụ

phải được vô trùng).

3.1.2 Cách xử lý dụng cụ trước khi rửa

- Đối với dụng cụ thuỷ tinh chưa sử dụng, cần ngâm nước máy hoặc dung dịch

H2SO4 loãng 24 giờ Rửa lại bằng xà phòng và nước nhiều lần cho tới khi dung dịchrửa có pH trung tính

- Các dụng cụ đã qua sử dụng, nhất là các VSV gây bệnh trước khi rửa phải đượckhử trùng bằng hơi nước áp lực để giết chết các tế bào, đảm bảo an toàn cho ngườirửa,không cho mầm bệnh cũ nhiễm vào môi trường mới

- Với các pipet dùng để hút dịch VSV: sau khi sử dụng cần ngâm ngay vàoốngnước sát trùng, khều bỏ nút bông, ngâm tiếp vào dung dịch tẩy rửa 1 ngày rồi chuyểnsang bình rửa pipet tự động qua đêm Tráng nước cất, hong khô Nếu rửa trực tiếpdưới vòi nước, cần điều chỉnh sao cho dòng nước chảy qua bên trong pipet

- Với các pipet dùng cho các phản ứng hoá học, không cần ngâm nước sát trùng,đặt

pipet dưới vòi nước chảy để xả bớt hoá chất bám dính bên trong, ngâm vào ống nước

xà phòng một ngày, rửa sạch rồi tráng nước cất Pipet chỉ nên hong khô ở nhiệt độphòng Nếu sấy ở nhiệt độ cao, thuỷ tinh giãn nở làm sai lệnh thể tích

hút bằng miệng được đút nút bằng một ít bông, nút bông cần vừa phải, nếu chặt quá

sẽ khó hút dịch và khó lấy ra khi rửa Pipét được gói bắt đầu từ phía đầunhỏ giọt,quận giấy dần dần vào theo kiểu xoáy trôn ốc cho đến khi hết ở phía đầu có nút bông.Phải quận giấy cho sát khít vào pipet Sau khi quận giấy, ta phải giữ cho khỏi bẩn vàkhỏi rách bằng cách buộc thành từng bó cùng kích cỡ hoặc cho vào ống đựng pipetlàm bằng kim loại hay bằng bìa cứng

- Các que gạt cũng được gói riêng từng cái và sau đó cũng bó lại như pipét

- Các đĩa Petri được gói thành từng chồng, mỗi chồng khoảng 4-5 bộ

- Các chai lọ, ống nghiệm dùng để nuôi cấy vi sinh vật nhất thiếtphảiđược đậy nút(nút nhựa hoặc kim loại hay cao su nhân tạo chịu nhiệt hoặc bằng nút bông) Nếu làmnút bông phải dùng bông không thấm nước

- Nút bông cần làm đúng kiểu cách để thuận tiện khi thao tác thí nghiệm, có thể làmnút bông trần hoặc nút bông có bọc vải màn Lấy bông theo lớp, tuỳ vào kích cỡmiệng bình, chai lọ và ống nghiệm ñể lấy lượng bông phù hợp Có 2 cách làm nútbông thông dụng:

+ Nhồi bông vào giữa, dàn đều ra xung quanh thành hình tròn, lấy đầu một ngón tayđặt vào giữa, các ngón của bàn tay kia giữ đều phía ngoài rồi đẩy sát lên ngón tay đặtgiữa tạo thành nút bông

+ Đặt miếng bông vừa lấy (theo hình chữ nhật) trên mặt bàn sạch, cuộn tròn lại theochiều dài đến hết, rồi gấp làm đôi tạo thành nút bông

Xoay đều nút vừa tạo ra vào miệng ống hoặc bình, sâu khoảng 2-3 cm, điều chỉnhsao cho không tạo thành rãnh trên nút bông để ngăn chặn sự tạp nhiễm từ không khí,vuốt đều phần còn lại bên ngoài rồi bện chặt lại như hình ngọn lửa Nút bông đạt yêucầu cần vừa phải, không chặt quá, cũng không lỏng quá, dễ dàng lấy ra khi thực hiệncác thao tác nuôi cấy VSV