Nghiên cứu phân loại chi bình vôi (stephania lour ) trong họ tiết dê (menispermaceae juss ) ởviệt nam

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, số liệu kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Hà Nội, ngày 12 tháng, 06 năm 2019 Tác giả Trịnh Thị Phúc ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận hướng dẫn khoa học NCVC TS Vũ Tiến Chính giúp đỡ tơi suốt trình học tập thực luận văn Tơi xin bầy tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giúp đỡ Tơi xin trân trọng cảm ơn cán phòng sinh học phân tử, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình tơi thực luận văn Để hoàn thành luận văn, bên cạnh nỗ lực cố gắng thân tơi cịn nhận nhiều giúp đỡ thầy cơ, gia đình đồng nghiệp Qua tơi xin chân thành cảm ơn Cơ sở đào tạo sau Đại học Hồng Đức, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình đào tạo Thạc sỹ Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc Gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-NN.99-2015.26, cấp kinh phí tài trợ để hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới toàn thể gia đình bạn bè ln quan tâm, cổ vũ, động viên tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2019 Tác giả Trịnh Thị Phúc iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nghiên cứu phân loại học 1.1.1.Trên giới 1.1.2 Các công trình nghiên cứu hệ thống phân loại họTiết dê số nước lân cận với Việt Nam 1.1.3 Các cơng trình nghiên cứu hệ thống phân loại họTiết dê 1.2 Nghiên cứu sinh học phân tử 10 1.2.1 Trên giới 10 1.2 Ở Việt Nam 11 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2 Nội dung nghiên cứu 13 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu định loại thực vật 14 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử 14 2.3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 14 2.3.2.2 Phản ứng PCR nhân vùng gen đích 14 2.3.2.3 Xác định trình tự nucleotide 15 2.3.2.4 Phân tích số liệu 15 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1 Nghiên cứu phân loại chi Bình vôi Stephania Lour., họ Tiết dê (Menispermaceae Juss.) Việt Nam 17 3.2 Mơ tả đặc điểm lồi chi Stephania Lour họ Tiết dê (Menispermaceae Juss.) Việt Nam 21 3.2.4 Phân tích, so sánh trình tự nucleotide vùng gen rbcL lồi Bình vơi nghiên cứu 54 3.2 4.1 Mức độ đa dạng nucleotide 54 iv 3.2.4.2 Vị trí mang thơng tin tiến hóa lồi Bình vơi nghiên cứu 56 Ghi chú: m: Số lồi; C: Vị trí bảo thủ; V: vị trí biến đổi; Pi: Vị trí mang thơng tin tiến hóa; S: Vị trí singleton; π: mức độ đa dạng nucleotide 56 3.2.4.3 Thành phần nucleotide vùng gen rbcL lồi Bình vơi nghiên cứu 56 3.2.4.4 Vị trí phân loại lồi Bình vơi nghiên cứu sở phân tích vùng gen rbcL 57 3.2.4.5 Phân tích, so sánh trình tự nucleotide vùng gen rbcL lồi Bình vơi nghiên cứu với lồi cơng bố ngân hàng Genbank 58 3.2.4.5 So sánh trình tự nucleotide lồi 58 3.2.4.5 So sánh với trình tự nucleotide loài chi 59 3.2.4.6 Cây phát sinh chủng loại lồi Bình vơi nghiên cứu với lồi cơng bố ngân hàng Genbank 60 3.3 Lồi nghi ngờ ghi nhận có phân bố Việt Nam 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC I P1 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU BTTNVN: Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam BM : bảo tàng CNSH: Công nghệ sinh học cpDNA : gen lục lạp DNA : Axit đề oxi ribônucleic HNU: Đại học Khoa học Tự nhiên HN:Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật NXB: Nhà xuất PCR: Phản ứng chuỗi polymerase ITS : gen nhân VQG : Vườn Quốc gia VNMN: Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam VU: Sẽ nguy cấp Synonym: tên đồng nghĩa Herbarium code A: Herbarium of the Amold Arboretum, Harvard University BM: Natural History Museum CPNP: Cuc Phương National Park HN: National center for national Sciences and Technology, Hanoi HNU: National University, Hanoi IBSC: South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences K: Royal Botanical Garden, Kew KUN: Kunming Botanical Garden, CAS L: National Herbarium Nederlands, the Leiden University branch P: Museum National d’Histoire Naturelle PE: Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences vi Common Words and taxonomic icons or terms alt: altitude auct: Of authors comb.nov: combinaton nova: new combination et: and ex: validly published by HT: holotype IT: isotype LT: lectotype nov: novus: new pt: paratype sn: sine numero (without number) sp: species sp.nov: new species spp: species plural syn: synonymo: synonym var: varietas: variety vii DANH MỤC BẢNG TT BẢNG Bảng 1.1: Số loài chi Stephania Lour.trong họ TRANG Menispermaceae theo Phạm Hoàng Hộ (1999) Nguyễn Tiến Bân (2003) Vũ Tiến Chính, Trịnh Thị Phúc (2019) Bảng 2.1 : Ký hiệu nguồn gốc mẫu dùng 13 nghiên cứu Bảng 2.2 Trình tự nucleotide, nhiệt độ bắt cặp kích thước lý 15 thuyết cặp mồi sử dụng nghiên cứu Bảng 3.1 Mức độ đa dạng nucleotide lồi Bình vơi nghiên 54 cứu phân tích với vùng gen rbcL Bảng 3.2 Thống kê mức độ biến đổi mức độ đa dạng nucleotide 56 vùng gen rbcL so sánh lồi Bình vơi nghiên cứu Bảng 3.3 Thành phần nucleotide vùng gen rbcL lồi Bình vơi nghiên cứu 56 viii DANH MỤC HÌNH TT HÌNH TRANG Hình 1: Phân bố chi Stephania Lour họ Tiết dê Menispermaceae Hình 3.1: Một số hình ảnh chi Bình vơi Stephania Lour 17 Hình 3.2: Một số hình ảnh dạng chi Bình vơi Stephania 18 Lour Hình 3.3: Một số hình ảnh cụm hoa chi Bình vơi Stephania 19 Lour Hình 3.4: Một số hình ảnh chi Bình vơi Stephania Lour 20 Hình 3.5: Một số hình ảnh hạt chi Bình vơi Stephania Lour 20 Hình 3.6: Số lồi chi Stephania Lour thuộc họ 21 Menispermaceae Việt Nam Hình 3.7: Stephania brachyandra Diels 26 Hình 3.8: Stephania brevipes Crail.; a Thân có quả; b Cành mang 27 lá; c Hoa được; d Đài; e Cánh hoa; h Hạt 10 Hình 3.9: Stephania brevipes Crail.; a Dạng sống; b Cụm hoa; c 28 Lá; d Hoa; e,g Hoa đực; f Đài; h Cành mang quả; i Quả; j Hạt 11 Hình 3.10: Stephania cambodica Gagnep 29 12 Hình 3.11: Stephania cephalantha Hayata 31 13 Hình 3.12: Stephania cephalantha Hayata 31 14 Hình 3.13: Stephania dielsiana Y.C Wu- 33 15 Hình 3.14: Stephania japonica (Thunb.) Miers 35 16 Hình 3.15: Stephania japonica (Thunb.) Miers var discolos 37 (Blume) 17 Hình 3.16: Stephania kwangsiensis Lo H.S.Forman 39 18 Hình 3.17: Stephania pierrei Diels 42 19 Hình 3.18: Stephania polygona N.H Xia & V.T Chinh, sp nova 45 20 Hình 3.19: Stephania rotundaLour 46 21 Hình 3.20: Stephania sinica Diels 48 ix 22 Hình 3.21: Stephania subpenltata H S.Lo 50 23 Hình 3.22: Stephania venosa (Blume) Spreng 51 24 Hình 3.23: Kết kiểm tra DNA tổng số mẫu Bình vơi 52 gel agarose 0,9% 25 Hình 3.24: Sản phẩm PCR sau tinh mẫu Bình vơi 53 phân tích với vùng gen rbcL gel agarose 1,5% 26 Hình 3.25 Kết giải mã trình tự nucleotide vùng gen rbcL 55 mẫu S japonica var discolor đại diện cho mẫu nghiên cứu 27 Hình 3.26: Cây phát sinh chủng loại lồi Bình vơi nghiên cứu 57 phần mềm MEGA 4.0 (phương pháp Neighbor-Joining) sở phân tích vùng gen rbcL 28 Hình 3.27: Kết so sánh trình tự nucleotide vùng gen rbcL loài S 58 japonica nghiên cứu với trình tự nucleotide tương ứng ngân hàng Genbank 29 Hình 3.28: Cây phát sinh chủng loại lồi Bình vơi nghiên cứu với lồi thuộc chi Stephania Genbank phần mềm MEGA 4.0 sở phân tích vùng gen rbc L 61 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam xem 16 nước có tính đa dạng sinh học giới, có diện tích rừng tự nhiên lớn vùng Đông Nam Á, hệ sinh thái rừng phong phú đa dạng Trong năm gần đây, diện tích rừng tự nhiên bị suy giảm mạnh chủ yếu việc khai thác rừng, với biến đổi khí hậu xây dựng cơng trình thủy điện khai thác bất hợp pháp, làm giảm độ đa dạng sinh học Chi Stephania Lour họ Tiết dê (Menispermaceae Juss.) chi có số lượng lồi lớn họ đa dạng nguồn gen loài chi có giá trị sử dụng cao Các hợp chất sinh học chúng có chứa hợp chất bisbenzylisoquinoline alkaloids Các lồi họ Tiết dê (Menispermaceae) có giá trị sử dụng rộng rãi toàn giới Họ có khoảng 70 chi 520 lồi phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, số lồi có phân bố độ cao lên đến 2100m loài Cyclea fansipanensis Ở Việt Nam, họ Tiết dê (Menispermaceae) cịn tài liệu nghiên cứu phân loại đọc trình tự chi Stephania Lour., họ Tiết dê Menispermaceae có giá trị lớn dược liệu, gần tất loài họ chứa hợp chất alkaloid quan trọng Rất nhiều loài họ sử dụng rộng rãi thuốc dân gian như: Stephania rotunda Lour Chi Stephania chi Lour mô tả từ năm 1753 với loài Stephania rotunda Lour.và S longa Lour lần chúng phát Việt Nam Stephania rotunda Lour lồi có hoạt tính dược liệu q có nhiều cơng trình nghiên cứu lồi dược liệu q Tuy nhiên, gần số nội dung quan trọng chưa thực cách có hệ thống, chưa có cơng trình nghiên cứu phát sinh lồi chi Việt Nam chưa có tài liệu nghiên cứu tổng thể hệ thống lồi chi nói chung lồi nhóm khơng có củ nói riêng Từ nghiên 69 52 Kenneth R Markham, Carolyn Sheppard and hansgeige (1987), 13C-NMR studies of some naturally occurring amentoflavone and hinokiflavone biflavonoids, Phyloclbnictry Vol 26, No 12: pp 3335-3337 53 Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Lee A, Janzen DH, 2005 Use of DNA barcodes to identify flowering plants Proc Natl Acad Sci USA, 102(23): 8369-8374 54 Kress WJ, Erickson DL, 2007 A two-locus global DNA barcode for land plants: The coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region PloS ONE, 2: e508 55 Lie, C.L 2000, Cytotoxin bioflavonoids from Selaginella delicatula, J Nat Prod 63: pp 627-630 56 Loureiro, 1790 Fl Cochinchinesis 2: 608 57 Luo, X.R Chen T Gilbert, M.G (2008), Flora of China In: Wu, Z Y Raven, P H (Ed.), Vol Beijing: Science Press & St Louis: Missouri Botanical garden Press, pp 1-31 58 Luhata Lokadi Pierre, Munkombwe Namboole Moses (2015), solation and Characterisation of Stigmasterol and Β -Sitosterol from Odontonema Strictum (Acanthaceae), Luhata Lokadi Pierre et al, JIPBS, Vol (1), 8895 59 Ma YM, 2004 Research progress on chemical constituents of Stephania plants Journal of Northwest Forestry University19, 125–130 60 M-l Lohombo-Ekomba (2004), Antibacterial, antifungal, antiplasmodial and cytotoxic activities of Albertisia villosa, Journal of Ethnopharmacology, volume 93, Isues 2-3: pp 311-335 61 Miers, J (1851), A few remarks on the Menispermaceae Annals and Magazine of Natural History, series II 7: pp 33-45 62 Miers, J (1864), On the Menispermaceae, The Annals and Magazine of Natural History, series III 13: pp 1-15, 49-53, 97-103, 252-274 70 63 Mort ME, Levsen N, Randle RP, Jaarseld EV, Palmer A, 2005 Phylogenetics and versification of Cotyledon (Crassulaceae) inferred from nuclear and chloroplast DN sequences data American Journal of Botany, 92(7): 1170-1176 64 Mort ME, Soltis DE, Soltis PS, Francisco-Ortega J, Santos-Guerra A, 2001 Phylogenetic relationships and evolution of Crassulaceae inferred from matK sequence data American Journal of Botany,88: 76-91 65 Manu Arora, A N Kalia (2013), Solation and charaterrization of stigmasterol and β- Sitoterol-D-Glycoside from ethanolic extract of the stems of salvadora persica Linn nt J Pharm Pharm Sci, Vol 5, Suppl 1, 245-249 66 Ortiz R.D., 2012 Seed Diversity in Menisprermaceae: Developmental Anatomy and Insights into the Origin of the Condyle International Journal of Plant Sciences 173(4): 344-346 67 Page DM, Holmes HC, 2000 Molecular Evolution A Phylogenetic Approach Blackwell Science 68 Phan, K.L (1998), On the systematic structure of the Vietnam flora proc IFCD “Floristic characterictics and Diversity of East Asian Plants”, Chep & Springer, pp 120-129 69 Shapcott A, Forster PI, Guymer GP, McDonald WJF, Faith DP, Erickson D, et al, 2015 Mapping Biodiversity and Setting Conservation Priorities for SE Queensland’s Rainforests Using DNA Barcoding PLoS ONE, 10(3): e0122164 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0122164 70 Semwal, D.K., Badoni, R Semwal et al (2010), The genus Stephania (Menispermaceae): Chemical and pharmacological perspectives Elsevier, Journal of Ethnopharmacology, 132: pp 369-383 71 Vu Tien Chinh, Tran The Bach (2007), Species relationship of genus Cyclea (Menispermaceae Juss.) in Vietnam Proceeding of the 2nd 71 National Scientific Conferrence on Ecology and Biological Resources, pp 42-44 72 Vu Tien Chinh, XIA Nia He (2012), Pachygone valida Diels (Menispermaceae) A newly recorded species from Vietnam Journal of tropical and Subtropical Botany, Vol 207(3): pp 236-238 73 Vu Tien Chinh, Bui Hong Quang, Tran The Bach, Tran Thi Phuong Anh, Xia Nia He, Tran Van Khanh (2013), The Conservation of Menispermaceae Species for Flora of Vietnam Proceedings of the th National Scientific Conference on Ecology and Biological Resources Hanoi, Agricultural Publishing House: pp 978-604-60-0730-2 74 Vu Tien Chinh (2014), Taxonomic Revision of the Family Menispermaceae in Vietnam, University of Chine Academy of Sciences, Doctor of Science, pp 1- 306 75 Vu Tien Chinh, Bui Hong Quang, Ritesh Kumar Choudhary, Nian He Xia and Joongku Lee (2016), Stephania subpeltata H S Lo (Menispermaceae): A new record for the Flora of Vietnam, Korean J Pl Taxon 46(3): pp 288-294 76 VU Tien Chinh, Trinh Thi Phuc, TONG Yi Hua, XIA Nian He, 2019 Stephania brevipes Craib, (Menispermaceae): A New Record for Flora of Vietnam, Joulnal of Tropical and Subtropical Botany, 27(3): 323- 326 77 Xie DA, He JA, Huang JA, Xie HA, Wang YA, Kang YAC, Jabbour FB , Guo JA, 2015 Molecular phylogeny of Chinese Stephania (Menispermaceae) and reassessment of the subgeneric and sectional classifications Australian Systematic Botany, 28: 246–255 http://dx.doi.org/10.1071/SB14023 78 Zheng XZ, 1986 Pharmacognosy People’s Medical Pubilshing House: Beijing 79 Zhu ZY, Feng YX, Ho LY, Wang YC, 1983 Utilization of medicinal plant 72 resources of the genus Stephania of the family Menispermaceae in China Acta Pharmacologica Sinica18, 460-467 Tiếng Pháp 80 Gagnepain, F (1908), Menispermaceae In Lecomte H., Flore Générale de l’Indo- Chine, Paris 1: pp 124 153 81 Lo, H.S (1996), Menispermaceae In Liu & Luo (ed.) Flora Reipublicae Popularis Sinicae Science Press, Beijing 30(1): pp 1-81 82 Pierre, L (1883), Flore Forestière de la Cochinchine, Paris, pp 109-112 Tài liệu tiếng La Tinh 83 Linnaeus, C (1753), Species Plantarum, London Vol I: pp 341-342 P1 PHỤ LỤC I Bảng tra cứu tên khoa học Tên taxon in đậm tên khoa học thức số trang tương ứng taxon (số đậm taxon có đẫn liệu kèm theo); tên taxon khơng in đậm tên synoym (viết nghiêng) tên khoa học khác đề cập đến luận án số trang tương ứng Ageratum connyzoides 44 Anomospemeae 4, 5, 6, 10 Berberidaceae Burasaia 10 Cissampelideae Cissampelinae Cissampelos glabra 45 Cissampelos hernandifolia 36 Cissampelydeae Clypea 22, 19 Clypea corymbosa 45 Clypea discolor 36 Clypea glabra 45 Clypea rotund 45 Clypea venosa 51 Cocculeae 6, Cocculineae Cocculus finlaysoniaus 46 P2 Coscinieae 4, Cyclea 19 Cyclea fansipanensis Cyclea polypetala 44 Cyclea tonkinensis 44 Dendrotrophe frutescens 44 Fibraureae 5, 10 Fibraureeae Ficus aurata44 Heteroclineae 4, Hyperbaeneae5, Hypserpa4 Hypserpeae 4, Hyspereae Lardizabalaceae Lasianthus cupreus 44 Lasianthus kerrii 44 Leptogoneae4, Leptogoneae Macaranga denticulata 44 Menispermaceae 1, 2, 3, 5, 8, 10, 13, 14, 23, 62, 44 Menispermeae 5, 6, 7, 10, 17, 19, 20, 21 Menisperminae Menispermum 3, 21 Menispermum japonicum34 Menispermum roxburghii46 Pachygoneae 4, 5, 6, 10 P3 Peniantheae 5, Pericampylus glaucus44 Pinus kesiya44 Platygoneae 4, Ranunculaceae Ranunculales Ranunculineae Stephania corymbosa60 Stephania hernandiifolia Sargentodoxaceae Stephania 1, 2, 3, 4,5, 8, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,41, 47, 52, 58, 59, 60, 61, 62 Stephania brachyandra9,17, 18, 19, 24, 26, 2560 Stephania brevipes 13 Stephania brevipes9, 13, 17, 18, 19, 20, 23, 26, 27, 28, 54, 56, 58 Stephania cambodica 9, 17, 19, 24, 29 Stephaniacephalantha 9, 17, 19, 24,30, 60 Stephania delavayi 60 Stephania dielsiana 9, 17, 18, 19,20, 24, 32 Stephania disciflora30 Stephania erecta42 Stephania glabra 60 Stephania hernandifolia36, 37 Stephania hispidula40 Stephania japonica9,13,18, 19, 23, 34, 35, 54, 56, 57, 58, 59, 60 Stephania kwangsiensis9, 17, 18, 19, 24 Stephania longa1, 4, 9, 18, 19, 23, 47, 60 Stephania pierrei9, 17, 18, 24 Stephania pierrei Diels 42, 41 P4 Stephania polygona13,18, 19, 24, 45, 44, 43, 54, 56, 57, 60 Stephania prapatensis51 Stephania renifolia 60 Stephania rotunda1, 4, 9, 13, 14, 17, 18, 19, 23, 25, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 54, 56, 59, 60 Stephania sinica9, 17, 18, 19, 25, 48 Stephania sp 13, 54, 62, 57 Stephania subpeltata9, 18, 24, 50, 49 Stephania tetrandra9, 60 Stephania tetrandra var glabra30 Stephania venosa9, 17, 18, 24,51, 50, 60 Stephania virdiflaves60 Stephaniinae Tiliacoreae 4, 5, 7, 10 Tinosporeae4, 5, 6, 7, 10 Triclisieae6 Tuberiphania11 Uraria campanulata44 P5 PHỤ LỤC II Một số hình ảnh nghiên cứu phịng tiêu Một số hình ảnh nghiên cứu phịng thí nghiệm P6 P7 PHỤ LỤC III Một số hình ảnh nghiên cứu thực địa Máy đo tọa độ Vườn Quốc gia Cúc Phương Thu mẫu Khai thác bảo tồn P8 PHỤ LỤC IV Một số hình ảnh mẫu Types Isotypes, Syntypes chi Binh vôi Stephania Lour Việt Nam A Stephania brachyandra Diels, Henry 10776,US, syntype B Stephania brevipes Crail., Kerr 3255, BM, Syntype C Stephania brevipes Crail., Kerr 3255,K, Syntype D Stephania cambodica Gagnep., sn,P, Holotype P9 A Stephania cambodica Gagnep., sn,P, Isotype B Stephania japonica (Thunb.) Miers, Forster sn,GOET, Syntype C Stephania pierrei Diels, Pierrel 755, P, Holotype D Stephania pierrei Diels, Pierrel 755, K, Isotype P10 A Stephania rotunda Lour., Loureiro sn,BM, Syntype B Stephania erecta Craib., Kerr 5689, K, Holotype.[Stephania pierrei Diels] C Stephania rotunda Lour., Loureiro sn,BM, Syntype D Stephania erecta Craib., Kerr 5689, K, Holotype.[Stephania pierrei Diels] P11 A Stephania sinicaDiels, Hanry 6662, K, Holotype B Stephania sinicaDiels, Hanry 6662,P, Holotype C Stephania subpenltata H.S Lo, Ching 25511,KUN, Isotype