Nghiên cứu đặc điểm phân tử vùng gen s1 của virus ibv gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà tại việt nam năm 2021

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÙNG GEN S1 CỦA VIRUS IBV GÂY BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ TẠI VIỆT NAM NĂM 2021” HÀ NỘI, 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÙNG GEN S1 CỦA VIRUS IBV GÂY BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ TẠI VIỆT NAM NĂM 2021” Sinh viên : Đỗ Thị Thạch Thảo Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Đồn Thị Thanh Hương Viện Cơng nghệ Sinh học TS Nguyễn Hữu Đức Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Hà Nội, tháng năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận hồn tồn hồn thiện tìm hiểu nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Đức môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa công nghệ sinh học – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam TS Đồn Thị Thanh Hương phịng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam.Tất số liệu, hình ảnh, kết trình bày khóa luận hồn tồn trung thực, khơng chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác mà không ghi rõ nguồn tham khảo Những nội dung khóa luận có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí website liệt kê danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng Học viện Hà Nội, ngày 05 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Đỗ Thị Thạch Thảo i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn Hữu Đức – môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa công nghệ sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam quan tâm sát sao, hướng dẫn dạy tận tình cho tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Tơi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Đoàn Thị Thanh Hương, tồn thể cán phịng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian thực khóa luận Tiếp theo, tơi muốn gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam ln tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ suốt bốn năm đại học Cuối cùng, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, người thân gia đình tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên đồng hành năm tháng giảng đường đại học Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Đỗ Thị Thạch Thảo ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh viêm phế quản truyền nhiễm 1.1.1 Lịch sử bệnh viêm phế quản truyền nhiễm 1.1.2 Triệu chứng lâm sàng 1.1.3 Bệnh tích 1.2 Tổng quan virus IBV 1.2.1 Cách gọi tên phân loại 1.2.2 Đặc điểm sinh học virus IBV 1.3 Các phương pháp chẩn đoán phân loại IBV 10 1.3.1 Chẩn đoán huyết học 10 1.3.2 Chẩn đoán virus IBV phương pháp RT-PCR 10 1.3.3 Chẩn đoán phân loại virus IBV phản ứng PCR giải trình tự gen 10 1.4 Tầm quan trọng việc nghiên cứu đặc điểm phân tử vùng gen S1 virus IBV Việt Nam 11 1.4.1 Giới thiệu gen S1 virus IBV 11 1.4.2 Mối quan hệ vùng gen S1 phát sinh loài virus IBV 11 1.4.3 Vai trò việc nghiên cứu vùng gen S1 việc kiểm soát ngăn ngừa bệnh IB 12 1.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu virus IB gen S1 12 1.5.1 Trên giới 12 1.5.2 Tại Việt Nam 15 iii Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm thực nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng 19 2.1.2 Thời gian 19 2.1.3 Địa điểm 19 2.2 Các bước tiến hành 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.1 Vật liệu 20 2.3.2 Dụng cụ, hóa chất 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Xử lý mẫu 22 2.4.2 Phương Pháp tách chiết RNA tổng số 22 2.4.3 Phương pháp tạo cDNA 23 2.4.4 Phương pháp thiết kế mồi 24 2.4.5 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 25 2.4.6 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 27 2.4.7 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 29 2.4.8 Phương pháp giải trình tự 29 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết phát IBV kỹ thuật PCR 31 3.2 Kết thu nhận vùng gen S1 mẫu nghiên cứu 32 3.3 Kết xác định genotype phả hệ nguồn gốc chủng IBV nghiên cứu 36 3.4 So sánh tỷ lệ đồng nucleotide amino acid vùng gen S1 mẫu IBV nghiên cứu 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách loại vaccine IBV sử dụng Việt Nam 17 Bảng 2.1 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm 20 Bảng 2.2 Các dung dịch sử dụng 21 Bảng 2.3 Các cặp mồi dùng nghiên cứu 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 26 Bảng 3.1 Danh sách mẫu IBV nghi nghiễm thu nhận 31 Bảng 3.2 Danh sách chủng IBV sử dụng nghiên cứu so sánh phân tích nguồn gốc phả hệ 34 Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đường chéo) amino acid (dưới đường chéo) vùng gen S1 41 chủng IBV 41 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc virus viêm phế quản truyền nhiễm Hình 1.2 Hình ảnh hiển vi điện tử virus viêm phế quản truyền nhiễm nhuộm âm tính với axit phosphotungstic.Các mũi tên gai bề mặt virion Thanh = 100 nm Hình 1.3 Sơ đồ tổ chức hệ gen IBV Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen N (khoảng 0.4 kb) mẫu nghiên cứu 32 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen S1 (khoảng 0.5 kb) mẫu IBV nghiên cứu 33 Hình 3.3 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng IBV Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự nucleotide gen S, sử dụng phương pháp kết nối liền kề (Neighbour-joining method) với hệ số tin cậy bootstrap 1000 (Tamura cs., 2013) 39 Hình 3.4 So sánh vị trí amino acid chủng virus IBV thuộc genotype khác 42 vi MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Từ viết tắt A Adenin bp Base pair (Cặp base) C Cytosine cDNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic acid E Envelop F Forward primer (Mồi xuôi) G Guanine HI Hemagglutination inhibition reaction IBV Infectiuos bronchitis virus kb Kilobase kDa Kilodalton M Membrane ml Milliliter nm Nanometer mRNA Messenger RNA N Nucleocapsid nt Nucleotide ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi) RNA Acid ribonucleic RT-PCR Realtime PCR R Reverse primer (Mồi ngược) S Spike T Thymine µl Microliter vii TÓM TẮT Virus viêm phế quản truyền nhiễm (Infectiuos bronchitis virus - IBV) nguyên nhân hàng đầu gây thiệt hại kinh tế ngành chăn nuôi gia cầm, ảnh hưởng đến suất gia cầm thịt gà đẻ trứng Hiện nay, virus lưu hành toàn giới với mức độ biến đổi phức tạp chủng lưu hành Vùng gen S1 thuộc gen S (Spike) virus IBV vùng định kháng nguyên, có nhiều biến đổi có vai trị định xuất biến thể Tuy nhiên năm gần có nghiên cứu đặc điểm phân tử vùng gen S1 nước Chính nghiên cứu đặc điểm phân tử vùng gen S1 cần thiết để tạo sở liệu tham chiếu phụ trợ cho nghiên cứu virus IB Việt Nam Đề tài nhằm mục đích giải trình tự vùng gen S1 chủng virus IBV gây bệnh gà Việt Nam phân tích đặc điểm phân tử để xác định genotype lưu hành Kết nghiên cứu phân tích phả hệ nguồn gốc xác định mẫu IBV thu nhận gà bệnh tỉnh miền bắc Việt Nam thuộc genotype gồm Massachusetts QX-like Kết so sánh tỉ lệ tương đồng nucleotide amino acid cho thấy chủng nghiên cứu có tỷ lệ đồng cao với chủng vaccine H52 sử dụng Việt Nam viii XCE2R: 5’- CCTCTATAAACACCCTTACA – 3’ (20nt) Với cặp mồi trên, sản phẩm PCR dự kiến thu có kích thước khoảng 0,5 kb Bằng cặp mồi nêu trên, tiến hành thu nhận vùng gen S1 mẫu IBV dương tính thu nhận (Hình 3.2) MK MK kb 0.5kb 500 bp 750 bp 500 bp 250 bp 0.5 kb 250 bp A B Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen S1 (khoảng 0.5 kb) mẫu IBV nghiên cứu Ghi chú: giếng M: thang DNA chuẩn (GeneRuler kb DNA Ladder - Thermo Fisher Scientific); giếng lại sản phẩm PCR mẫu IBV nghiên cứu: giếng 1: mẫu IBAT1; giếng 2: mẫu IBAT4; giếng 3: IBTT1; giếng 4: IBBG Sản phẩm PCR mẫu IBAT1, IBAT4 IBTT1 thu đơn băng có chất lượng tốt, tinh sinh phẩm GeneJET™ PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) gửi giải trình trình tự Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam theo phương pháp Sanger Sản phẩm PCR mẫu IBBG2 có thêm băng phụ, elute sinh phẩm Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) gửi giải trình trình tự Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam 33 Kết thu nhận trình tự nucleotide amino acid vùng gen S1 chủng IBV nghiên cứu Các chuỗi gen S1 thu nhận so sánh phân tích phả hệ nguồn gốc với chủng IBV giới Ngân hàng gen (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Danh sách chủng IBV sử dụng nghiên cứu so sánh phân tích nguồn gốc phả hệ STT Kí hiệu mẫu Nguồn gốc/ quốc gia Số ngân Ghi hàng gen IBAT1 Vĩnh Phúc/Vietnam Nghiên cứu IBAT1 Vĩnh Phúc/Vietnam Nghiên cứu IBTT1 Hà Nội/Vietnam Nghiên cứu IBBG2 Bắc Giang/Vietnam Nghiên cứu Mass-1009-13A Pakistan KY588135 Massachusetts/2015 CK-CH-TJ1904 China MW815494 Chưa có genotype CK-CH-FJ-202005 China MW791835 VI Ck/CH/IBTZ2012 China KF663559 LX4 or genotype KM91 Korea JQ977698 K-II SNU8067 Korea JQ977697 K-I CK-CH-LJL- China KP868573 Massachusetts 130908 CH-LSD-121228 China KJ435285 Massachusetts CK-CH-IBYZ China KF663561 QX-like 10 CK-CH-LSD- China KX236011 QX-like China KX259248 QX-like 091203 11 CK-CH-LHN101211 12 3575-08 Taiwan KX266757 Taiwan 13 1171-92 Taiwan DQ646406 Taiwan 34 new 14 B17 India KT203557 Massachusetts 15 1123 Korea JQ920386 KM91-like 16 11041 Korea JQ920402 KM91-like 17 KM91 Korea JQ977698 KM91-like 18 Q1 China AF286302 Q1-like 19 J2 China AF286303 Q1-like 20 CK-Italy-I2022-13 Italy KP780179 Q1-like 21 A2 China EU526388 A2 22 SAIBK China DQ288927 A2 23 CK-CH-LDL- China JF828981 Masschusetts China KJ425492 Masschusetts 101212 24 CK-CH-LHB120403 25 CH-LHN-090909 China KJ425508 Massachusetts 26 CH-LSD-110726 China KJ425512 Massachusetts 27 CH-LSD-121228 China KJ435285 Massachusetts 28 CH-LSD-1112150 China KJ435286 Massachusetts 29 CK-CH-SD09-005 China KF668605 TC07-like 30 CK-CH-QL1403 China KU361188 TC07-like 31 CK-CH-IBTZ China KF663559 TC07-like 32 TC07-2 China GQ265948 TC07-like 33 gammaCoV-Ck- Italy KP780179 Q1-like Poland KT886454 Early Polish Poland KY047602 Var2-like Italy-I2022-13 34 gammaCoV-CkPoland-74 35 gammaCoV-CkPoland-G052 36 Gray USA GU393334 Massachusetts 40 H52 China EU817497 Massachusetts 41 H120 Netherlands FJ888351 Massachusetts 35 42 IBVUkr27-11 Ukraine KJ135013 43 TN92-03 India KR902510 Mass41 44 Iowa97 USA GU393337 Massachusetts 45 JMK USA GU393338 Massachusetts 49 H52 China AF352315 Massachusetts 50 M41 Iran FJ445216 Massachusetts 51 TC07-2 China GQ265948 TC07-like 52 VNUA8-VN-2018 Thái Nguyên/Vietnam KY992864 QX-like 53 VNUA3-VN-2018 Hà Nội/Vietnam KY992863 Q1-like 54 VNUA11-VN-2018 Hải Phòng/Vietnam KY992865 TC07-like 3.3 Kết xác định genotype phả hệ nguồn gốc chủng IBV nghiên cứu Kết phân tích phả hệ nguồn gốc cho thấy, bốn mẫu IBV thu nhận gà bệnh ba tỉnh miền Bắc bao gồm thành phố Hà Nội, Vĩnh Phúc Bắc Giang thuộc hai nhóm genotype khác nhau, gồm QX-like Massachusetts (Hình 3.3) Nhóm genotype Massachusetts gồm chủng IBV nhiều nước giới bao gồm chủ yếu Mỹ, Úc, Ý, Netherlands, Trung Quốc, Ấn Độ Việt Nam Đây genotype công bố giới phổ biến Các chủng Việt Nam thuộc genotype gồm hai chủng IBAT1 IBAT4 thu nhận Vĩnh Phúc năm 2021 Chủng vaccine IB-H52 sử dụng Việt Nam thuộc genotype Massachusetts, có quan hệ gần gũi với hai chủng IBAT1 IBAT4 nghiên cứu Nhóm chủng thuộc genotype QX-like gồm chủng nhiều nước khác nhau: Trung Quốc, Việt Nam, Ba Lan, Thụy Điển Bắc Phi Kết phân tích hoàn toàn phù hợp với báo cáo trước giới Genotype QX-like có độc lực cao, xuất phát từ Trung Quốc năm 1996 (Wang cộng sự, 36 1998); từ chủng virus IBV QX-like lan rộng khắp Trung Quốc (Han cộng sự, 2011) Genotype QX-like sau báo cáo nhiều nước giới Đông Nam Á, Trung Đông, Châu Âu, Châu Phi (Monne cộng sự, 2008; Jackwood, 2012; Ganapathy cộng sự, 2015) gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành công nghiệp gà đẻ gà thịt (Worthington & Jones, 2006; Worthington cộng sự, 2008) Tại Việt Nam chủng virus IBV thuộc genotype QX-like công bố năm 2019 phân lập virus gây bệnh gà năm 2015 Thái Nguyên (Le cộng năm 2019) Trong nghiên cứu xác định lưu hành genotype QX-like hai tỉnh thành Hà Nội (chủng IBTT1) Bắc Giang (IBBG2) Nhóm genotype KM-91 gồm phần lớn chủng phân lập Hàn Quốc chủng Trung Quốc Trong nghiên cứu chủng thu nhận khơng có chủng thuộc genotype Cho đến genotype phổ biến Hàn Quốc (Mo cộng sự, 2012) Nhóm genotype Taiwan gồm chủng Đài Loan Nhóm genotype Q1-like gồm chủng Trung Quốc, Ý Ba Lan Chủng virus IBV Q1-like phân lập Trung Quốc năm 1995 (Yu cộng sự, 2001) Tiếp virus nhanh chóng lây lan nhiều nước giới Tại Việt Nam, genotype Q1-like xác định mẫu gà bệnh Hà Nội Thái Nguyên năm 2014 (Nguyễn Thị Loan cộng sự, 2017; Le cộng sự, 2019) Tuy nhiên nghiên cứu không phát genotype ba tỉnh Hà Nội, Vĩnh Phúc Bắc Giang Genotype TC07-like gồm chủng Trung Quốc chủng VNUA11VN-2015 phân lập năm 2015 Việt Nam (Số Genbank KY992865) Cho đến nghiên cứu sinh học phân tử IBV Việt Nam hạn chế Theo công bố tác giả Nguyễn Thị Loan cộng năm 2017, Ba Vì, Hà Nội có lưu hành genotype Q1-like Nghiên cứu Trần Ngọc Bích (2017) thấy có lưu hành ba genotype 793B, QX-like 37 chủng thể thận Malaysia Tuy nhiên nghiên cứu chưa có liệu cơng bố Ngân hàng gen Trong nghiên cứu ba tỉnh Hà Nội, Vĩnh Phúc Bắc Giang năm 2021 không phát thấy genotype Q1, phát có lưu hành hai genotype QX-like Massachusetts Cùng nghiên cứu chủng IBV miền Bắc, công bố Le cộng năm 2019 phát 01 chủng virus thuộc genotype QX-like phân lập năm 2015 gà thuộc tỉnh Thái Nguyên; 01 chủng virus thuộc genotype Q1-like phân lập năm 2015 gà thuộc Hà Nội 01 chủng virus thuộc genotype TC07like phân lập năm 2015 gà thuộc tỉnh Thái Nguyên (Le cộng sự, 2019) Theo số ghi nhận bác sĩ thú y, IBV thể thận 4/91 nhắc đến Việt Nam với mức độ nghiêm trọng cao Tuy nhiên nghiên cứu chưa phát lưu hành genotype Việt Nam Các kết nghiên cứu ghi nhận cho thấy chủng IBV lưu hành Việt Nam đa dạng chủng loại khác vùng địa lý Điều ngun nhân gây khó khăn cho cơng tác phòng bệnh vaccine Việt Nam Dựa nghiên cứu công bố Le cộng năm 2019 cho thấy chủng virus thuộc genotype QX-like dường chiếm ưu tỉnh miền Bắc Việt Nam Kết phù hợp với công bố tác giả nước ngồi Cho đến nay, khơng Việt Nam mà có nhiều nước gặp khó khăn việc đối phó với bệnh IBV 38 ck-CH-LSD-121228-CN-2012(KJ435285) H120-NL-1960(FJ888351) ck-CH-LSD-110726-CN-2011(KJ425512) ck-CH-LHN-090909-CN-2009(KJ425508) 91 ck-CH-LHB-120403-CN-2012(KJ425492) B17-IN-2012(KT203557) H52-CN-2005(AF352315) 57 IBAT1-VN IBAT4-VN 57 Mass-1009-13A-PK-2015(KY588135) H52-CN(EU817497) 99 M41-IR-2016(FJ445216) ck-CH-LSD-1112150-CN-2011(KJ435286) 60 70 TN92-03-IN-2003(KR902510) 3575-08-TW-2008(KX266757) 51 TW1171-92-TW(DQ646406) KM91-KR-1991(JQ977698) 95 1123-KR-2010(JQ920386) 99 11044-KR-2011(JQ920402) 76 99 Gray-USA-1960(GU393334) 89 JMK-USA-1964(GU393338) Iowa-97-USA-1956(GU393337) VNUA3-VN-2014(KY992863) 69 gammaCoV-Ck-Italy-I2022-13-IT-2013(KP780179) 99 Q1-CN(AF286302) 49 J2-CN(AF286303) IBVUkr27-11-UA-2011(KJ135013) 78 IBTT1-VN 58 58 ck-CH-IBYZ-CN-2011(KF663561) IBBG2-VN 99 VNUA8-VN-2015(KY992864)-QX-like 73 ck-CH-LHN-101211-CN-2010(KX259248) 62 ck-CH-LSD-091203-CN-2009(KX236011) 58 CK-CH-FJ-202005-CN-2020(MW791835) VNUA11-VN-2015(KY992865) 99 CK-CH-2014-QL1403-CN-2014(KU361188) 48 TC07-2-CN-2007(GQ265948) ck-CH-IBTZ-CN-2012(KF663559) 42 CK-CH-TJ1904-CN-2019(MW815494) Mass Taiwan KM-91 Q1-like QX-like TC07-like 0.05 Hình 3.3 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng IBV Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự nucleotide gen S, sử dụng phương pháp kết nối liền kề (Neighbour-joining method) với hệ số tin cậy bootstrap 1000 (Tamura cs., 2013) Ghi chú: Hình trám mũi tên kí hiệu chủng IBV Việt Nam nghiên cứu 39 3.4 So sánh tỷ lệ đồng nucleotide amino acid vùng gen S1 mẫu IBV nghiên cứu Trình tự vùng gen S1 chủng IBV thu nhận gà tỉnh Bắc Giang, Vĩnh Phúc Hà Nội sử dụng để so sánh với chủng tham chiếu Ngân hàng Gen Kết trình bày Bảng 3.3 hình 3.4 Kết so sánh cho thấy: - Trong nhóm genotype Massachusetts: chủng IBV genotype Massachusetts có tỷ lệ đồng cao từ 94.5% đến 100% nucleotide, tương đồng từ 93.4% đến 100% amino acid Trong đó, hai chủng IBAT1 IBAT4 có tỷ lệ đồng cao với chủng H52 (chủng vaccine sử dụng Việt Nam), từ 99.5% đến 100% - Trong nhóm genotype QX-like: chủng IBV genotype QX-like có tỷ lệ đồng từ 84.9% đến 98.3% nucleotide, tương đồng từ 90.7% đến 96% amino acid Nằm nhóm này, chủng Việt Nam có chủng IBTT1, chủng gây bệnh thành phố Hà Nội chủng BG2 gây bệnh Bắc Giang năm 2021 Hai chủng Việt Nam có tỷ lệ tương đồng với 84.9% nucleotide 90.7% amino acid; đồng từ 84.9% đến 95.7% nucleotide 90.7% đến 94.7% amino acid với chủng genotype QX-like - Trong nhóm genotype Q1-like: chủng IBV genotype Taiwan có tỷ lệ đồng từ 99.5% đến 100% nucleotide, tương đồng từ 98.6% đến 100% amino acid - Các chủng nhóm genotype TC07-like có tỷ lệ đồng từ 97.9% đến 99.5% nucleotide 96.1% đến 100% amino acid Trong chủng VNUA11-VN-2015 Việt Nam phân lập năm 2015 Hải Phịng (số Genbank KY992865) có tỷ lệ đồng cao với chủng CK-CH-TJ1904-CN2019 Trung Quốc phân lập năm 2019 (Số Genbank MW815494) - Giữa genotype khác nhau, tỷ lệ đồng nucleotide tỷ lệ tương đồng amino acid tương đối thấp, từ 61.2% đến 92.4% nucleotide, từ 55.8% đến 96.1% amino acid 40 Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đường chéo) amino acid (dưới đường chéo) vùng gen S1 chủng IBV STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 98.6 98.6 98.6 94.7 86.8 90.7 88.1 84.2 84.2 84.2 86.8 82.8 84.2 86.8 81.5 57.1 57.1 57.1 Massachusetts 99.5 99.5 99.5 100 100 100 100 100 100 93.4 93.4 93.4 86.8 86.8 86.8 90.7 90.7 90.7 86.8 86.8 86.8 84.2 84.2 84.2 84.2 84.2 84.2 84.2 84.2 84.2 86.8 86.8 86.8 82.8 82.8 82.8 84.2 84.2 84.2 86.8 86.8 86.8 81.5 81.5 81.5 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1 57.1 94.9 94.5 94.5 94.5 86.8 90.7 86.8 84.2 84.2 84.2 86.8 82.8 84.2 86.8 81.5 57.1 57.1 57.1 TW 80.1 80.1 80.1 80.1 79.7 86.8 82.8 81.5 81.5 81.5 88.1 86.8 86.8 86.8 86.8 58.4 58.4 58.4 KM91 83.5 83.5 83.5 83.5 81.8 81.4 80.2 82.8 82.8 82.8 90.7 84.2 88.1 86.8 85.5 58.4 58.4 58.4 92.4 91.9 91.9 91.9 89.4 78 79.7 81.5 81.5 80.2 88.1 86.8 85.5 88.1 86.8 55.8 55.8 55.8 Q1-like 10 11 82.2 82.2 81.8 81.8 81.8 81.8 81.8 81.8 80.1 80.1 76.3 76.3 79.7 79.7 79.3 78.9 100 99.5 100.0 99.5 98.6 98.6 82.8 82.8 81.5 80.2 80.2 78.9 84.2 84.2 82.8 81.5 81.5 80.2 82.8 82.8 81.5 58.4 58.4 57.1 58.4 58.4 57.1 58.4 58.4 57.1 82.2 81.8 81.8 81.8 80.1 76.3 79.7 79.3 12 79.8 79.8 79.8 79.8 79.8 80.6 86.1 80.2 78.5 78.5 78.1 90.7 90.7 94.7 90.7 59.7 59.7 59.7 13 77.3 77.3 77.3 77.3 74.3 75.2 77.7 78.5 75.6 75.6 75.2 84.9 90.7 92.1 93.4 58.4 58.4 58.4 QX-like 14 78.9 78.9 78.9 78.9 75.9 77.2 79.7 79.7 77.6 77.6 77.2 85.7 94.9 92.1 96.0 59.7 59.7 59.7 15 79.3 79.7 79.7 79.7 76.7 76.3 79.7 80.1 76.3 76.3 75.9 88.6 89 90.7 16 78.4 78.4 78.4 78.4 75.5 76.7 79.3 80.1 77.2 77.2 76.7 85.7 95.7 98.3 90.7 93.4 59.7 58.4 59.7 58.4 59.7 58.4 TC07-like 18 19 65 64.5 64.5 64.1 64.5 64.1 64.5 64.1 63.7 63.3 64.5 65 61.2 60.8 62.9 62.5 64.5 64.1 64.5 64.1 64.1 63.7 62.6 63 63.7 64.1 64.5 65 63.7 63.3 64.1 64.5 98.3 97.9 96.1 99.5 96.1 100 17 65.4 65 65 65 64.1 64.5 62 63.3 65 65 64.5 63.4 64.1 65 64.1 64.5 Ghi chú: 1.IBAT1-S1-577bp(A538); A541-IBAT4(S1)-564bp; H52-CN-2005(AF352315); ck-CH-LSD-121228-CN-2012(KJ435285); TN92-03-IN-2003(KR902510); 3575-08-TW-2008(KX266757); KM91-KR-1991(JQ977698); Gray-USA-1960(GU393334); VNUA3-VN-2018(KY992863); 10 gammaCoV-Ck-Italy-I2022-13-IT-2013(KP780179); 11 J2-CN(AF286303); 12 A598-IBTT1-(S1)(425bp); 13 IBBG2-VN; 14 VNUA8-VN-2018(KY992864); 15 ck-CH-IBYZ-CN-2011(KF663561); 16 ck-CH-LSD-091203-CN-2009(KX236011); 17 VNUA11VN-2018(KY992865); 18 CK-CH-2014-QL1403-CN-2014(KU361188); 19 CK-CH-TJ1904-CN-2019(MW815494) 41 Kết nghiên cứu cho thấy có lưu hành nhiều chủng virus IBV miền Bắc Việt Nam Mass QX-like Q1-like Taiwan KM91-like TC07-like Mass QX-like Q1-like Taiwan KM91-like TC07-like H120-NL-19 H52-CN-200 IBAT1-VN-2 IBAT4-VN-2 BG2-VN-202 IBTT1-VN-2 VNUA8-VN-2 ck-CH-IBYZ VNUA3-VN-2 Q1-CN(AF28 3575-08-TW TW1171-92KM91-KR-19 1123-KR-20 VNUA11-VNTC07-2-CN- : : : : : : : : : : : : : : : : * 20 * 40 * 60 * 80 NSSLVKQKFIVYRENSVNTTFTLHNFTFHNETGANPN PSGVQNIQTYQTQTAQSGYYNFNFSFLSSFVYKESNFMYGSYH . KC . T RE .S K LA.T T.VSN.Q SG NTFHL L Q A.D SRT R- .S LA.T T SN.Q SG NTFHL L R A.D T RD .S L T.Y S.VST.Q SG STFHL L Q D T RE .S K LA.T T.VSN.Q SG NTFHL L Q A.D ER S LV.T S.VSN.P TG HS.VLH R.V D ER S LV.T S.VSN.P TG HS.VLH R.V D R.V L T.Y N.Q SG YT.S K L Y .R L T.Y Y N.S SG HS.P .L .R S L T N.S SG NS.S .L .R S L T N.S SG NS.S .L V E.NET FEK.TET.ML N F.QS QL.QKEPSP S.FVY QIS.VP N .R T.LS.DY.S F V E.NET FEK.TET.ML N F.QS Q QKEPSP S.FVY QIS.VP N T.LS.DYTR F H120-NL-19 H52-CN-200 IBAT1-VN-2 IBAT4-VN-2 BG2-VN-202 IBTT1-VN-2 VNUA8-VN-2 ck-CH-IBYZ VNUA3-VN-2 Q1-CN(AF28 3575-08-TW TW1171-92KM91-KR-19 1123-KR-20 VNUA11-VNTC07-2-CN- : : : : : : : : : : : : : : : : * 100 * 120 * 140 PSCNFRLETINNGLWFNSLSVSIAYGPLEGGCKQSVFSGRATCC-YAYSYGGPLLCKGV Q .- Q .- S Q .- S P S L Q .- N IA .S P .L Q .S - N RA .S P R LT Q N.K - N RA .S P S L Q .- N IA .K.S LG Q NNM - S T K.S LG Q NNM - S T R.S P A L Q Q - N RM .A L Q .- Y RK I.L Q .SK - N RA D .I.L Q .SK - N RA .T P.D KNRR H I.LS RN AC.NT.SS CFM N.QP T P.D KNRR H I.LS RN AC.NT.SS CFM N.QP : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 80 80 80 80 80 79 80 80 80 80 80 80 80 80 84 84 138 138 138 138 138 137 138 138 138 138 138 138 138 138 143 143 Hình 3.4 So sánh vị trí amino acid chủng virus IBV thuộc genotype khác Sự sai khác nucleotide dẫn đến sai khác amino acid lớn vùng gen S1 (Hình 4.4) Từ dẫn đến sai lệch tính kháng nguyên- miễn dịch chủng thuộc genotype khác Đây nguyên nhân khiến tình hình bệnh viêm phế quản truyền nhiễm gà Việt Nam phức tạp khó khăn việc lựa chọn loại vaccine phòng bệnh Kết lý giải ngun nhân số trại sử dụng vaccine mà dịch bệnh xảy Trước tình hình thực tế này, theo đánh giá chúng tơi việc lựa chọn loại vaccine đa giá, gồm nhiều chủng virus IBV loại vaccine phù hợp cho hiệu cao Ngồi ra, virus IBV có khả biến chủng lớn nhanh chóng, nên năm, trang trại có biến chủng khác nhau, chí biến chủng Do việc xác định dịch tễ vùng thật cần thiết để đánh giá tình hình bệnh lựa chọn loại vaccine phù hợp để tiêm phòng 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau tiến hành nghiên cứu thực phân tích đặc điểm phân tử phân đoạn gen S1 chủng virus IBV thu nghiên cứu Xác định genotype chủng nghiên cứu gồm Massachusetts QX-like Phân tích phát sinh chủng loại IBV dựa trình tự nucleotide chủng nghiên cứu chủng IBV công bố Genbank cho thấy chủng virus IBV nghiên cứu có mối quan hệ gần gũi với chủng IBV Trung Quốc, đặc diệt hcurng H52 (chủng vaccine sử dụng Việt Nam) Dựa bảng so sánh tương đồng chủng nghiên cứu chủng IBV ngồi nước cơng bố ngân hàng gen đưa kết luận: Giữa chủng genotype có tỷ lệ tương đồng đạt 84,9% Tuy nhiên genotype khác nhau; tỷ lệ tương đồng thấp hơn, nucleotide amino acid (từ 61,2% đến 96,1%) Nghiên cứu chúng tơi góp phần tạo sở liệu đặc điểm phân tử vùng gen S1 chủng IBV lưu hành Việt Nam hỗ trợ cho nghiên cứu cần thông tin đặc điểm phân tử vùng gen S1 virus IBV Việt Nam Kiến nghị Hiện nay, biến đổi chủng virus IBV giới Việt Nam diễn vô phức tạp Do vậy, để mở rộng nguồn liệu phục vụ cho công tác nghiên cứu phòng dịch Việt Nam, nên mở rộng thu mẫu nghiên cứu vùng địa lý khác đặc biệt khu vực Miền Nam Việt Nam để tăng số lượng mẫu đưa vào phân tích 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hồ Đình Chúc (1983) Bước đầu xác định bệnh Marek Việt Nam Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y (1979 – 1984) Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội tr 21 – 28 Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh & Đỗ Ngọc Thúy (2012) Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y Nhà xuất Đại học Nông nghiệp Nguyễn Hồng Minh (2013) Nghiên cứu, sản xuất thử nghiệm Vaccine nhược độc đồng khơ đa giá phịng bệnh Newcastle, gumboro, viêm phế quản truyền nhiễm gà Nhà xuất Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Loan, Lê Đình Quyền, Dương Hồng Quân, Lê Huỳnh Thanh Phương, Nguyễn Bá Hiên & Lê Văn Phan (2016) Ứng dụng kỹ thuật RTPCR để chẩn đoán bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (infectious bronchitis) gà đẻ trứng số tỉnh phía Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 14: 1387-1394 Trần Thanh Vân (2000) Khảo sát ảnh hưởng biến chủng gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm tỷ lệ chết sản xuất trứng đàn gà bố mẹ giống thịt Hubbard High – Yield Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh 81 trang Võ Thị Trà An, Nguyễn Thị Kim Yến & Hồ Hoàng Dũng (2012) Phân lập, định serotype virus viêm phế quản truyền nhiễm từ gà thịt Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 19(3): 5-9 Võ Thị Trà An & Nguyễn Thị Kim Yến (2014) So sánh hiệu phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ba quy trình tiêm chủng vaccine gà Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 21(5): 21-25 44 TIẾNG ANH Ammayappan A., Upadhyay C & Vakharia V.N (2008) Complete genomic sequence analysis of infectious bronchitis virus Ark DPI strain and its evolution by recombination Virology journal 5:157 Bui Tran Anh Dao, Tripodi A., Carles M & Bodin, G (2001) Newcastle Disease, Gumboro Disease And Avian Infectious Bronchitis In Viet Nam Medical And Economic Interest Of The One Vaccinal Program Applied In Ho Chi Minh City Revue De Médecine Vétérinaire 152: 239-246 Cavanagh D (2007) Coronavirus avian infectious bronchitis virus Veterinary Research 38: 281-297 Cavanagh D., Davis P.J & Cook J.K (1992) Infectious bronchitis virus: Evidence for recombination within the Massachusetts serotype Avian Pathology 21: 401-408 Cavanagh D., Davis P.J & Adrian Mockett A.P (1988) Amino acids within hypervariable region of avian coronavirus IBV (Massachusetts serotype) spike glycoprotein are associated with neutralization epitopes Virus research 11(2): 141–150 Cavanagh D & Naqi S.A (2003) Viral diseases Infectious bronchitis Diseases of poultry Chacon J.L., Rodrigues J.N., Assayag J.M.S., Peloso C., Pedroso A.C & Ferreira A.J (2011) Epidemiological survey and molecular characterization of avian infectious bronchitis virus in Brazil between 2003 and 2009 Avian Pathology 40: 153–162 Cook J.K., Jackwood A.M & Jones R.C (2012) The long view: 40 years of infectious bronchitis research Avian Pathology 41: 239-250 Delmas B & Laude H (1990) Assembly of coronavirus spike protein into trimers and its role in epitope expression Journal of Virology 64(11): 5367–5375 45 10 Julius Fabricant (1998) The Early History of Infectious Bronchitis Avian Diseases 42: 648-650 11 Kuo L & Masters P.S (2002) Genetic evidence for a structural interaction between the carboxy termini of the membrane and nucleocapsid proteins of mouse hepatitis virus Journal of Virology 76(10): 4987-99 12 Kant A., Koch G., Roozelaar D.J.V., Kusters J.G., Poelwijk F.A & van der Zeijst B.A (1992) Location of antigenic sites defined by neutralizing monoclonal antibodies on the S1 avian infectious bronchitis virus glycopolypeptide Journal of General Virology 73: 591-596 13 Lian J., Wang Z., Xu Z., Chen T., Shao Z., Zhang X., Qin J., Xie Q & Lin W (2021) Distribution and molecular characterization of avian infectious bronchitis virus in southern China Poultry Science 100(7): 101169 14 Lewicki D.N & Gallagher T.M (2002) Quaternary Structure of Coronavirus Spikes in Complex with Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecule Cellular Receptors The Journal of biological chemistry 277(22): 19727–19734 15 Manswr B., Ball C., Forrester A., Chantrey J & Ganapathy K (2018) Evaluation of full S1 gene sequencing of classical and variant infectious bronchitis viruses extracted from allantoic fluid and FTA cards Avian Pathology 47(4): 418-426 16 Narayanan K., Chen C.J., Maeda J & Makino S (2003) Nucleocapsidindependent specific viral RNA packaging via viral envelope protein and viral RNA signal Journal of Virology 77(5): 2922-7 17 Promkuntod N., van Eijndhoven R.E.W., de Vrieze G., Gröne A & Verheije M.H (2014) Mapping of the receptor-binding domain and amino acids critical for attachment in the spike protein of avian coronavirus infectious bronchitis virus Virology 448: 26–32 18 Tran Ngoc Bich, Nguyen Phuc Khanh, Pham Hoang Dung & Nguyen Thi Cam Loan (2017) Molecular characterization of infectious bronchitis 46 virus (IBV) isolated from commercial chicken farms Can Tho University Journal of Science 6: 56-62 19 Valastro V., Holmes E.C., Britton P., Fusaro A., Jackwood M.W., Cattoli G., Monne I (2016) S1 gene-based phylogeny of infectious bronchitis virus: An attempt to harmonize virus classification Infect Genet Evol 39: 349– 364 20 Zhang Y., Wang H.N., Wang T., Fan W.Q., Zhang A.Y., Wei K., Tian G.B & Yang X (2010) Complete genome sequence and recombination analysis of infectious bronchitis virus attenuated vaccine strain H120 Virus Genes 41(3): 377-88 47