Giải mã và phân tích đặc điểm phân tử gen kháng nguyên meq của virus gahv 2 gây bệnh marek trên gà tại tỉnh vĩnh phúc năm 2021

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN KHÁNG NGUYÊN Meq CỦA VIRUS GaHV-2 GÂY BỆNH MAREK TRÊN GÀ TẠI TỈNH VĨNH PHÚC NĂM 2021 HÀ NỘI, 07/2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIẢI MÃ VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN KHÁNG NGUYÊN Meq CỦA VIRUS GaHV-2 GÂY BỆNH MAREK TRÊN GÀ TẠI TỈNH VĨNH PHÚC NĂM 2021 Ngƣời thực : NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG Khố : 63 Ngành : Cơng nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn :TS Đoàn Thị Thanh Hƣơng TS Trần Thị Bình Ngun HÀ NỘI, 07/2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng: Đây kết cơng trình nghiên cứu riêng thân Các số liệu, kết khoá luận trung thực nguyên gốc, không trùng lặp với công bố luận văn, luận án hay cơng trình nghiên cứu khoa học trước Tôi xin cam đoan rằng: Mọi giúp đỡ q trình hồn thành khố luận cảm ơn trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc theo quy định Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Phương i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ thầy cô, chị, bạn Tôi xin trân trọng cảm ơn tới TS Đoàn Thị Thanh Hương – Trường phịng Miễn dịch học (Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam trực tiếp hướng dẫn truyền đạt kiến thức suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài để tơi thuận lợi hồn thành tốt khố luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS Trần Thị ình Ngun – Trưởng Bộ mơn CNSH Động vật giúp đỡ hết lịng với tơi suốt thời gian hồn thiện khố luận tốt nghiệp Hồn thành khóa luận này, ngồi cố gắng thân, tơi ln nhận giúp đỡ tận tình, đầy trách nhiệm cán làm việc Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với Thầy/Cô Bộ môn CNSH Động vật tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khố luận tốt nghiệp Nhân dịp này, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè tất người thân yêu tin tưởng, giúp đỡ, động viên, hỗ trợ suốt thời gian hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Phương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi TÓM TẮT viii Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn .2 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.4 Những đóng góp đề tài Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan bệnh Marek Marek’s Disease Virus .3 2.1.1 Tổng quan bệnh Marek .3 2.1.2 Tổng quan Marek’s Disease Virus 2.1.3 Tình hình nước giới bệnh Marek 2.2 Tầm quan trọng việc nghiên cứu gen Meq .10 2.2.1 Giới thiệu gen Meq 10 2.2.2 Cấu trúc gen Meq 11 2.2.3 Các thành phần cấu trúc ảnh hưởng đến hoạt động ngăn ngừa ung thư Meq 12 2.2.4 Cơ chế gây ung thư Meq .13 2.2.5 Một số gen liên quan đến khả gây ung thư Meq 13 Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 15 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu .15 3.3 Đối tượng, hoá chất, thiết bị nghiên cứu 16 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 17 iii 3.3.2 Hoá chất .17 3.3.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 18 3.3.2 Thiết bị 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Thu nhập mẫu bệnh phẩm 19 3.4.2 Tách chiết DNA tổng số 20 3.4.3 Thiết kế mồi thực phản ứng PCR 21 3.4.4 Phương pháp điện di gel Agarose 22 3.4.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 22 3.4.6 Phương pháp giải trình tự gen .23 3.4.7 Xử lý chuỗi gen phân tích số liệu 23 3.5 Nội dung nghiên cứu 24 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết chiết tách DNA tổng số .25 4.2 Kết PCR chẩn đoán xác định GaHV-2 (MDV-1) 25 4.3 Kết PCR thu nhận gen MEQ 26 4.4 Kết thu nhận trình tự nucleotide amino acid tồn gen Meq 27 4.4.1 Trình tự nucleotide chuỗi gen Meq .27 4.4.2 Trình tự amino acid Meq 28 4.4.3 Kết so sánh, tìm kiếm trình tự gen tương đồng ngân hàng gen 29 4.5 So sánh đặc điểm di truyền phân tích phả hệ nguồn gốc mẫu MDV10 phân lập Việt Nam với chủng giới .30 4.5.1 Phân tích đặc điểm di truyền cấp độ phân tử mẫu MDV1 phân lập Việt Nam với chủng giới 30 4.5.2 Phân tích phả hệ nguồn gốc mẫu MDV1 phân lập Việt Nam với chủng giới 35 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .39 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại MDV Bảng 3.1 Danh sách chủng MDV sử dụng nghiên cứu so sánh đặc điểm di truyền 15 Bảng 3.2 Danh sách chủng GaHV-2 sử dụng nghiên cứu phả hệ nguồn gốc 16 Bảng 3.3 Hoá chất dùng chất điện di 17 Bảng 3.4 Dụng cụ dùng dùng nghiên cứu 18 Bảng 3.5 Thiết bị dùng nghiên cứu 19 Bảng 3.6 Quy trình tách chiết DNA tổng số 20 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR 21 Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21 Bảng 3.9 Quy trình tinh sản phẩm PCR 23 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Một số triệu chứng bệnh Marek Hình 2.2 Cấu tạo MDV Hình 2.3 Cấu trúc MDV Hình 2.4 Vị trí gen Meq gen MDV 11 Hình 2.5 Cấu trúc gen Meq 12 Hình 3.1 GeneJET Genomic DNA Purification Kit cột tinh tách chiết DNA 17 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 19 Hình 4.1 Kết điện di DNA tổng số mẫu nghiên cứu 25 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR chẩn đoán GaHV-2 cặp mồi MarekF-MarekR 25 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR thu nhận gen Meq cặp mồi GaHV2 – MeqF GaHV2 – MeqR 26 Hình 4.4 Kết tìm kiếm trình tự nucleotide tương đồng với gen Meq chủng MRVP10 chương trình LAST 29 Hình 4.5 Kết tìm kiếm trình tự nucleotide tương đồng với gen Meq chủng MRVP11 chương trình LAST 30 Hình 4.6 Kết so sánh trình tự nucleotide gen Meq mẫu MDV1 phân lập Việt Nam với chủng giới 32 Hình 4.7 Phả hệ nguồn gốc chủng GaHV-2 Việt Nam giới dựa liệu nucleotide gen Meq 36 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa từ viết tắt Từ viết tắt MD Marek Disease MDV Marek Disease Virus MDV1 Marek Disease Virus serotype GaHV Gallid herpesvirus DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotide acid PCR Polymerase chain reaction MEQ Marek’s EcoRI Q BR basic region bZIP Basic Leucine Zipper Domain kb Kilobase bp Base pair nt nucleotide kDa Kilo Dalton DEPC Diethyl pyrocarbonate pp phosphoprotein ORF Open reading frame vii TÓM TẮT Nghiên cứu tập trung vào giải mã trình tự gen Meq hai mẫu bệnh phẩm Marek gà (MRVP10 MRVP11), thu nhận tỉnh Vĩnh Phúc xác định dương tính với virus GaHV-2 Bằng phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm, tách chiết DNA tổng số thu mẫu cho kết thành công, đem chạy PCR chẩn đốn xác định mẫu dương tính hay âm tính với virus GaHV-2 bệnh Marek Từ kết có băng vạch rõ, đơn băng có kích thước 0,7 kb ta thu mẫu (MRVP10 MRVP11 phù hợp Và thiết kế mồi đặc hiệu gen Meq, sản phẩm cho chạy PCR thu nhận vùng gen Meq Có kết cho băng vạch đơn băng, rõ nét kích thước 1,4 kb Sau tinh sạch, giải trình tự phương pháp Sager Cuối xử lý phân tích số liệu với phần mềm (Gendoc & MegaX) Dựa vào kết phân tích trình tự nucleotide amino acid hai chủng Việt Nam với chủng giới, đánh giá hiệu phòng bệnh vaccince sản xuất từ chủng CVI988- chủng vacxin thuộc dòng MDV1 phổ biến Đồng thời, phân tích phả hệ nguồn gốc phát hình thành chi phân hóa theo khu vực địa lý hai chủng MRVP10 MRVP11 có quan hệ gần gũi với chủng phân lập từ Trung Quốc Từ khóa: Bệnh Marek, MDV1, Meq, Vĩnh Phúc, Việt Nam viii sản phẩm PCR đoạn DNA kích thước, khơng bị nhiễm tạp, tiến hành tinh để sử dụng cho phản ứng phân tích nghiên cứu sau 4.4 Kết thu nhận trình tự nucleotide amino acid tồn gen Meq Từ kết giải trình tự thu hoàn chỉnh gen Meq hai chủng MRVP10 MRVP11 4.4.1 Trình tự nucleotide chuỗi gen Meq 4.4.1.1 Trình tự nucleotide chuỗi gen Meq mẫu MRVP10 ATGTCTCAGGAGCCAGAGCCGGGCGCTATGCCCTACAGTCCCGCTGACGATCC GTCCCCCCTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCGAGACGGAAAAAAAGGAAAA GTCACGACATCCCCAACAGCCCCTCCAAACACCCCTTCCCTGACGGCCTATCT GAGGAGGAGAAACAGAAGCTGGAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGC TCGGAGAAGACGCAGGGAGCAGACGTACTATGTAGACTAACTCCATGAAGCAT GTGAAGAGCTGCAGAGGGCCAATGAACACCTACGTAAGGAAATTCGAGATCTA AGGACTGAGTGCACGTCCCTGCGTGCACAGTTGGCTTGTCATGAGCCAGTTTG CCCTATGGCGGTACCCCTAACGGTGACCCTTGGACTGCTTACCGCCCCGCACG ATCCCGTTCCTGAACCTCCCATTTGCACTCCTCCACCTCCCTCACCGGATGAA CCTAACGCTCCACATTGCTCCGGTTCCCAACCTCCTATCTGTACCCCCCGTCC TCCCGATACGGAGGAACTTTGCGCCCAGCTCTGCTCGACCCCACCACCTCCCA TCTCTACTCCCCATATTATCTACGCTCCGGGGCCTTCCCCCCTCCAACCTCCT ATCTGTACCCCCGCTCCTCCCGATGCGGAGGAGCTTTGCGCCCAGCTCTGCTC GACCCCACCACCTCCCATCTGTACTCCCCATTCCCTCTTCTGCCCTCCCCAGC CTCCATCTCCGGAGGGCATCTTCCCTGCATTGTGTCCTGTTACCGAGCCGTGT ACCCCTCCATCGCCGGGGACGGTTTACGCTCAGCTTTGTCCTGTTGGCCAGGC TCCCCTTTTTACCCCATCTCCCCCACATCCGGCTCCGGAGCCGGAGAGGCTTT ATGCTCGTCTTACCGAGGATCCCGAACAGGATTCCTTGTATTCGGGCCAGATT TATATTCAGTTTCCCTCGGATACTCAGTCTACGGTCTGGTGGTTTCCAGGTGA CGGGAGACCCTGA 4.4.1.2 Trình tự nucleotide chuỗi gen Meq mẫu MRVP11 ATGTCTCAGGAGCCAGAGCCGGGCGCTATGCCCTACAGTCCCGCTGACGATCCGTCCC CCCTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCGAGACGGAAAAAAAGGAAAAGTCACGACAT CCCCAACAGCCCCTCCAAACACCCCTTCCCTGACGGCCTATCTGAGGAGGAGAAACAG 27 AAGCTGGAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGCTCGGAGAAGACGCAGGGAGC AGACGTACTATGTAGACAAACTCCATGAAGCATGTGAAGAGCTGCAGGGGGCCAATGA ACACCTACGTAAGGAAATTCGAGATCTAAGGACTGAGAGCACGTCCCTGCGTGCACAG TTGGCTCGTCATGAGCCAGTTTGCCCTATGGCGGTACCCCTAACGGTGACCCTTGGAC TGCTTACCGCCCCGCACGATCCCGTTCCTGAACCTCCCATTTGCACTCCTCCACCTCC CTCACCGGATGAACCTAACGCTCCACATTGCTCCGGTTCCCAACCTCCTATCTGTACC CCCCGTCCTCCCGATACGGAGGAACTTTGCGCCCAGCTCTGCTCGACCCCACCACCTC CCATCTCTACTCCCCATATTATCTACGCTCCGGGGCCTTCCCCCCTCCAACCTCCTAT CTGTACCCCCGCTCCTCCCGATGCGGAGGAGCTTTGCGCCCAGCTCTGCTCGACCCCA CCACCTCCCATCTGTACTCCCCATTCCCTCTTCTGCCCTCCCCAGCCTCCATCTCCGG AGGGCATCTTCCCTGCATTGTGTCCTGTTACCGAGCCGTGTACCCCTCCATCGCCGGG GACGGTTTACGCTCAGCTTTGTCCTGTTGGCCAGGCTCCCCTTTTTACCCCATCTCCC CCACATCCGGCTCCGGAGCCGGAGAGGCTTTATGCTCGTCTTACCGAGGATCCCGAAC AGGATTCCTTGTATTCGGGCCAGATTTATATTCAGTTTCCCTCGGATACTCAGTCTAC GGTCTGGTGGTTTCCAGGTGACGGGAGACCCTGA 4.4.2 Trình tự amino acid Meq Bằng chương trình Gendoc 2.7 chúng tơi thu nhận trình tự amino acid suy diễn chủng GaHV-2 sau: 4.4.2.1 Trình tự amino acid chuỗi gen Meq mẫu MRVP10 MSQEPEPGAMPYSPADDPSPLDLSLGSTSRRKKRKSHDIPNSPSKHPFPDGLSEEEKQ KLERRRKRNRDAARRRRREQTYYVDKLHEACEELQRANEHLRKEIRDLRTECTSLRAQ LACHEPVCPMAVPLTVTLGLLTTPHDPVPEPPICTPPPPSPDEPNAPHCSGSQPPICT PRPPDTEELCAQLCSTPPPPISTPHIIYAPGPSPLQPPICTPAPPDAEELCAQLCSTP PPPICTPHSLFCPPQPPSPEGIFPALCPVTEPCTPPSPGTVYAQLCPVGQAPLFTPSP PHPAPEPERLYARLTEDPEQDSLYSGQIYIQFPSDTQSTVWWFPGDGRP 4.4.2.2 Trình tự amino acid chuỗi gen Meq mẫu MRVP11 MSQEPEPGAMPYSPAGDPSPLDLSLGSTSRRKKRKSHDIPNSPSKHPFPDGLSEEEKQ KLERRRKRNRDAARRRRREQTYYVDKLHEACEELQRANEHLRKEIRDLRTECTSLRAQ LACHEPVCPMAVPLTVTLGLLTAPHDPVPEPPICTPPPPSPDEPNAPHCSGSQPPICT PRPPDTEELCAQLCSTPPPPISTPHIIYAPGPSPLQPPICTPAPPDAEELCAQLCSTP PPPICTPHSLFCPPQPPSPEGIFPALCPVTEPCTPPSPGTVYAQLCPVGQAPLFTPSP PHPAPEPERLYARLTEDPEQDSLYSGQIYIQFPSDTQSTVWWFPGDGRP 28 4.4.3 Kết so sánh, tìm kiếm trình tự gen tƣơng đồng ngân hàng gen 4.4.3.1 Kết so sánh, tìm kiếm trình tự gen tương đồng với mẫu MRVP10 Hình 4.4 Kết tìm kiếm trình tự nucleotide tƣơng đồng với gen Meq chủng MRVP10 chƣơng trình BLAST 29 4.4.3.2 Kết so sánh, tìm kiếm trình tự gen tương đồng với mẫu MRVP11 Hình 4.5 Kết tìm kiếm trình tự nucleotide tƣơng đồng với gen Meq chủng MRVP11 chƣơng trình BLAST 4.5 So sánh đặc điểm di truyền phân tích phả hệ nguồn gốc mẫu MDV10 phân lập Việt Nam với chủng giới 4.5.1 Phân tích đặc điểm di truyền cấp độ phân tử mẫu MDV1 phân lập Việt Nam với chủng giới Hai chủng GaHV-2 phân lập Việt Nam so sánh với 29 chủng MDV1 giới (có danh sách kèm theo thơng qua chương trình GENEDOC 30 4.5.1.1 So sánh trình tự nucleotide gen Meq mẫu MDV10 phân lập Việt Nam với chủng giới 31 Hình 4.6 Kết so sánh trình tự nucleotide gen Meq mẫu MDV1 phân lập Việt Nam với chủng giới Ghi chú: Dấu (.) biểu thị trình tự giống chủng Sai khác nucleotide chủng so với chủng đối chiếu thể chữ kí hiệu chúng 32 Kết so sánh trình tự nucleotide gen Meq cho thấy: Giữa hai chủng MDV1 Việt Nam nghiên cứu có mức độ tương đồng cao nucleotide tồn số sai khác vị trí 250(T>A , 328(T>A , 355(T>C) So sánh với chủng giới, hai chủng GaHV-2 Việt Nam có mức độ tương đồng cao với hầu hết chủng GaHV-2 phân lập từ Trung Quốc, nhiên có nhiều sai khác so với chủng Mỹ Các vị trí sai khác nucleotide hai chủng GaHV-2 Việt Nam chủng giới bao gồm: Vị trí 239 (T>G , 249 (G>A , 250 (T>A , 279 (A>G), 328 (T>A , 344 (C>T , 356 (T>C , 539 (A>G , 577 (A>G , 649 (G>C …… Tuy sai khác trình tự nucleotide phân hóa chưa tập trung triệt để bắt đầu có phân chia theo nhóm nước nhóm khu vực địa lý, bước đầu nhìn quy luật biến đổi phân hóa, manh nha hình thành chi genotype riêng biệt Ngồi sai khác theo cụm nhóm nước vùng địa lý, xuất sai khác trình tự nucleotide tương tự nhiều chủng thuộc nhiều nhóm khác vị trí 250 (T>A 650 (G>C dẫn đến sai khác amino acid trình tự protein Meq Các sai khác xuất đồng loạt số chủng nhiều nhóm nước, dấu hiệu q trình lây nhiễm bệnh Marek nguồn nhóm địa lý Còn lại số đột biến điểm phân bố lẻ tẻ không thành quy luật Trong hệ gen GaHV-2, gen Meq xác định gen kháng nguyên virus, vừa định tính kháng nguyên, vừa định tình độc lực Do thay đổi amino acid vùng gen – đặc biệt amino acid quan trọng liên quan đến hoạt động protein Meq, dẫn đến thay đổi hoạt tính từ ảnh hưởng đến độc lực virus Kết phân tích đặc điểm di truyền, đặc biệt vị trí sai khác ảnh hưởng trực tiếp đến thay đổi thành phần, cấu trúc hoạt động gen Meq nguồn thông tin quan trọng, phục vụ cho nghiên cứu virus MDV nói chung GaHV-2 nói riêng Đây nghiên cứu có ý nghĩa mặt khoa học mà mặt thực tiễn, cung cấp thông tin chủng virus lưu hành thực địa, từ lựa chọn chủng virus phù hợp để sản xuất sử dụng vaccine đạt hiệu cao 33 4.5.1.3 So sánh tỷ lệ đồng nucleotide tỷ lệ tương đồng amino acid chủng MDV1 phân lập Việt Nam chủng MDV1 giới Ghi chú: Tỷ lệ đồng nucleotide đường chéo tỷ lệ tương đồng amino acid đường chéo Các chủng GaHV-2 sử d ng nghiên cứu: MRVP10; MRVP11; HNGS206-CN (HF546086); 2014055-CN (KU382456); GX36-CN (KT229640); QD/1311-CN (KP888856); MDJ-1212-CN (KP888857); LZ1390-CN (KX966280); MD239-JP (LC385873); 10 TKC-C1-JP (LC385869); 11 UDEACO-02-14-CO (KU058697); 12 UDEACO-02-14-CO (KU058698); 13 Elfeil-15A-EG (MH428671); 14 Fayoum -EG (MK261778); 15 ATE-HU (AY571784); 16 tn-nl-IN (HM749324); 17 DPR-IN (KT795529); 18 Ck-801-17-IT (MK9670); 19 CVI988-US (DQ530348); 20 Md5-US (AF243438) Từ bảng 4.10 thấy, chủng GaHV-2 giới có tỷ lệ đồng nucleotide từ 89,4-100% amino acid từ 87,6 -100% Trong đó, hai chủng Việt Nam có tỷ lệ tương đồng nucleotide 99,6%, tỷ lệ tương đồng amino acid 99,4% So sánh với chủng giới, hai chủng MRVP10 MRVP11 Việt Nam có tỷ lệ đồng nucleotide amino acid từ 99,3-99,9% từ 97,6-99,7% với chủng Trung Quốc; từ 99,0-99,5% nucleotide từ 97,6-98,5% amino acid với chủng Nhật Bản; từ 98,7-99,3% nucleotide từ 96,8-97,9% amino acid với chủng Ấn Độ; từ 89,4-99,4% nucleotide từ 88,5-98,2% amino acid với chủng Ý, Hungary, từ 99,1-99,7% nucleotide từ 97.9-98.5% amino acid với hai chủng Md5 CVI988 Mỹ 34 Trong chủng đưa vào so sánh với hai chủng thực địa phân lập Vĩnh Phúc năm 2021, chủng CVI988 chủng virus vaccine sử dụng phổ biến nay, có trình tự gốc chứa đoạn giàu proline lặp lại từ vị trí 575 đến vị trí 752 trình tự nucleotide gen Meq Đoạn giàu proline gây hoạt tính gen Meq từ làm độc lực chủng vaccine CVI988 Củng CVI988 sử dụng rộng rãi nhằm tạo chế miễn dịch cho mục đích tiêm phịng mà lại khơng gây bệnh cho vật chủ Chủng CVI988 có tỷ lệ đồng nucleotide amino acid so với hai chủng phân lập Việt Nam cao (lần lượt 99,4% 98,2% chủng MRVP10; 99,0% 97,6% chủng MRVP11) cho thấy vaccine sản xuất từ chủng hiệu sử dụng Việt Nam, nhiên hiệu phịng bệnh khơng triệt để Tương tự, tỷ lệ đồng nucleotide amino acid chủng giới so với chủng vacxin CVI988 (89,5 -99,4% (87,9 -97,9% , tùy vào nhóm nước chủng mà hiệu vaccine sản xuất từ chủng CVI988 khác đa số tỷ lệ tương đồng trình tự amino acid không cao 99% Chủng Fayoum phân lập Ai Cập năm 2018, có tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide amino acid với chủng vaccine đạt thấp 89,5% 87,9% Sự tương đồng thấp giải thích nguyên nhân gây chết gà hàng loạt kể với đàn gà tiêm vaccine Điều cho thấy cần có kế hoạch nghiên cứu chế tạo loại chủng vaccine từ chủng lưu hành thực địa để đạt hiệu phòng bệnh cao Đặc biệt cần phải đề phương án dự phòng khả thi, hiệu trước tình hình diến biến phức tạp bệnh Marek giới nói chung Việt Nam nói riêng, tình hình hiệu tiêm phịng vaccine khơng ổn định 4.5.2 Phân tích phả hệ nguồn gốc mẫu MDV1 phân lập Việt Nam với chủng giới Trong nghiên cứu này, sử dụng liệu nucleotide toàn gen Meq hai chủng GaHV-2 thu nhận tỉnh Vĩnh Phúc năm 2021 phân tích phả hệ với GaHV-2 giới (cường độc vaccine có ngân hàng gen phần mềm MEGAX sử dụng phương pháp kết nối liền kề (Neighbor-Joining (NJ), với hệ số tin tưởng (bootstrap) 1000 lần lặp lại (Kumar & cs., 2018) 35 Các chủng GaHV-2 giới phân thành nhóm (Hình 4.7) Hình 4.7 Phả hệ nguồn gốc chủng GaHV-2 Việt Nam giới dựa liệu nucleotide gen Meq Ghi chú: Vạch ngang cuối hình (0,002) biểu thị sai khác nucleotide (2/1000 nucleotide) theo khoảng cách di truyền nhánh Các chủng nghiên cứu dẫn mũi tên 36 Phân tích phả hệ: Phân nhóm thứ gồm chủng thuộc nhóm độc lực cao (vvMDV Phân nhóm thứ hai gồm chủng thuộc nhóm siêu độc lực châu Á, châu Âu (vv++MDV Phân nhóm thứ ba gồm chủng thuộc nhóm siêu độc lực châu Mỹ (vv++MDV Phân nhóm thứ tư gồm chủng thuộc nhóm độc lực cao (vMDV Phân nhóm thứ năm gồm chủng thuộc nhóm độc lực vừa (mMDV) Cả hai chủng GaHV-2 Việt Nam phân lập năm 2021 thuộc nhóm độc lực cao với chủng Trung Quốc Mỹ Cho đến nay, virus gây bệnh Marek nguyên nhân gây thiệt hại to lớn cho ngành chăn nuôi gà khắp giới Từ có nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố chủng virus gây bệnh Marek gà đặc biệt MDV serotype – dịng độc lực cao Các cơng bố cho thấy có nhiều biến đổi hệ gen virus đặc biệt gen kháng nguyên Đây là nguyên nhân hầu hết trường hợp bệnh Marek nay, gây chết hàng loạt kể đàn gà tiêm phòng Trong đó, cơng trình nghiên cứu hệ gen (nhất genmeq nước, đặc biệt công trình nghiên cứu cơng bố chủng phân lập từ Trung Quốc chiếm gần nửa số cơng trình nghiên cứu Kết quả: Cây phả hệ nguồn gốc cho thấy chủng Việt Nam có mối quan hệ gần gũi với chủng Trung Quốc Sự xuất thường xuyên rộng rãi biến chủng LLY-JL-06I, LCC-JL-08I, 201402, QD-1311, OkiH26035, Fayoum, Elfeil-15C… phản ánh phần tình hiền biến đổi mạnh mẽ phức tạp dịch bệnh Marek Từ kết phân tích cho thấy chủng GaHV-1 lưu hành Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc, xâm nhập vào Việt Nam qua đường bn bán, vận chuyển Tóm lại, nghiên cứu đề tài có mặt MDV serotype Việt Nam Đồng thời đề tài phân tích nguồn gốc phả hệ biến đổi trình tự gen hai chủng nghiên cứu Từ chủng GaHV-2 lưu hành Việt Nam có mối quan hệ gần gũi với chủng Trung Quốc có nguồn gốc từ Trung Quốc du nhập sang Việt Nam Ngoài ra, kết nghiên cứu đề tài bước đầu cung cấp số thông tin lưu hành chủng MDV Việt Nam, cung cấp liệu sinh học phân tử cho nghiên cứu tương lai Ngoài ý nghĩa khoa học, kết nghiên cứu đem lại ý nghĩa thực tiễn to lớn, cung cấp nguồn virus thực địa cho công tác sản xuất vaccine Đồng thời giúp cho việc lựa chọn sử dụng loại vaccine phù hợp để đạt hiệu cao 37 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã thu nhận giải mã toàn gen meq (dài 1020bp, mã hóa cho 339 amino acid hai mẫu bệnh Marek phân lập tỉnh Vĩnh Phúc năm 2021 - Đã đánh giá đặc điểm phân tử hai chủng nghiên cứu với chủng giới - Đã xác định phả hệ nguồn gốc hai chủng GaHV-2 lưu hành Việt Nam có mối quan hệ gần gũi với chủng Trung Quốc 5.2 Kiến nghị Cần thiết mở rộng phạm vi nghiên cứu nhiều vùng địa lý khác Việt Nam Từ xác định dịch tễ học phân tử virus MDV Việt Nam Từ lựa chọn chủng đại diện để phát triển sản xuất vaccine 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Hà Văn Quyết (2017) Hướng dẫn phòng bệnh Marek gà áo nhân dân điện Lê Ngọc Ý (2021 Cách phòng bệnh Marek gà áo điện tử Lê Văn Năm (2013) Bệnh Marek - mơ hình khối u truyền nhiễm NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hồng Lộc (2014) Giáo trình Cơ sở sinh học phân tử NX Đại học Huế Phạm Thành Hổ (2010) Phân tích gen sản phẩm gen Thư viện Học liệu Mở Việt Nam Phan Văn Lục, Nguyễn Ngọc Hùng, Nguyễn Thành Đồng, Đặng Thị Tám Lê Thanh Ân (2008 Mức độ nhiễm Marek ứng d ng vắc xin phòng bệnh cho đàn gà giống trại thực nghiệm Liên Ninh Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn ni - Số 13 VietDVM team (2014) Bệnh Marek gà áo điện tử Bệnh Trên Gia Cầm Tài liệu Tiếng Anh A.J.Davison (2010) Herpesvirus systematics Elsevier - Veterinary Microbioly Coupeau, G Dambrine & D Rasschaert (2012) Kinetic expression analysis of the cluster mdv1 - mirM9–M4, genes meq and vIL - differs between the lytic and latent phases of Marek’s disease virus infection Journal of General Virology, 93 10 Couteaudier & C Denesvre (2014) Marek’s disease virus and skin interactions Veterinary Reseach Vol.45 11 D Bacon, H D Hunt & H H Cheng (2001) Genetic Resistance to Marek's Disease Springer-Verlag Berlin Heidelberg 12 E.R.Tulman, C.L.Afonso, Z.Lu, L.Zsak, D.L.Rock, et al (2000) The genome of a very virulent Marek’s Disease Virus Plum Island Animal Disease Center 13 F Lee, P Wu, D Sui, D Ren, J Kamil (2000) The complete unique long sequence and the overall genomic organization of the GA strain of Marek’s disease virus PNAS-Microbiology, Vol.97 14 F Suhodolski, Y Izumiya, B Lupiani, D K Ajithdoss, L F Lee (2010) Both homo and heterodimers of Marek’s disease virus encoded Meq protein contribute to transformation of lymphocytes in chickens Elsevier-Virology 399 15 G Renz, J Cooke, N Clarke, B F Cheetham, Z Hussain (2012) Pathotyping of Australian isolates of Marek's disease virus and association of pathogenicity with meq gene polymorphism Avian Pathology, 41 16 Gennart, D Coupeau, S Pejakovit, S Laurent, S Rasschaert (2015) Marek’s disease: Genetic regulation of gallid herpesvirus infection and latency Elsevier-The Veterinary Journal, 38 17 H S Tai, C Hearn, S Umthong, O Agaifitei, H H Cheng (2017) Expression of Marek's Disease Virus Oncoprotein Meq During Infection in the Natural Host 39 Elsevier-Virology 503.J Spatz & R F Silva (2007) Sequence determination of variable regions within the genomes of gallid herpesvirus - pa 18 H Xuming, A Qin, J Mao, W Xu, C Yu (2013) Transcriptional profile of Marek’s disease virus genes in chicken thymus during different phases of MDV infection Springer-Arch Virol 158 19 J Davison (2010) Herpesvirus systematics Elsevier-Veterinary Microbioly, pp: 143 20 J Kung, L Xiai, P Brunovskis, J L Liu & L F Lee (2001) Meq: An MDV Specific bZIP Transactivator with Transforming Properties Springer -Verlag Berlin Heidelberg 21 J MacLachlan & E J Dubovi (2011) Fenner’s Veterinary Virology Elsevier Inc 22 Jones, L Lee, J L Liu, H J Kung & J K Tillotson (1992) Marek’s disease virus encodes a basic - leucine zipper gene resembling thefos/jun oncogenes that is highly expressed in lymphoblastoid tumors Proc Nati Acad Sci USA, Vol 89 23 Kishi, K.W.Jarosinski, B.K.Tischer, S Trap & N.Osterrieder (1988) Marek’s disease virus: lytic replication, oncogenesis and control Future Drugs Ltd 24 L F Lee, K Kreager, M Heidari, H Zhang, B Lupiani (2013) Properties of a meq - Deleted rMd5 Marek's Disease Vaccine: Protection Against Virulent MDV Challenge and Induction of Lymphoid Organ Atrophy Are Simultaneously Attenuated by Serial Passage In Vitro Avian Diseases, pp: 57 25 L.D.Bacon, H.D.Hunt & H.H.Cheng (2001) Genetic Resistance to Marek's Disease Springer - Verlag Berlin Heidelberg 26 Lupiani, L F Lee, X Cui, I Gimeno, A Anderson (2004) Marek’s disease virus encoded Meq gene is involved in transformation of lymphocytes but is dispensable for replication PNAS – Microbiology, Vol.101 27 M Biggs & V Nair (2012) The long view: 40 years of Marek’s disease reseach and Avian Pathology Taylor & Francis Group 28 M Gupta, D Deka, Ramneek (2016) Sequence analysis of Meq oncogene among Indian isolates of Marek’s disease herpesvirus Elsevier-Meta Gene,1809 29 M S Parcells, J Burnside & R W Morgan (2012) Marek’s Disease Virus Induced T - Cell Lymphomas Springer Science, Business Media 30 M Teng, Z H Yu, P Zhao, G Q Zhuang, Z X Wu (2017) Putative roles as oncogene or tumour suppressor of the Midclustered microRNAs in Gallid alphaherpesvirus (GaHV2) induced Marek’s disease lymphomagenesis Journal of General Virology, 98 31 N Osterrieder, J P Kamil, D Schumacher, B K Tischer & S.Trapp (2006) Marek’s disease virus: from miasma to model Nature Reviews Microbiology 4, pp: 283-294 32 N.Osterrieder, J.P.Kamil, D.Schumacher, K.Tischer & S.Trapp (2006 , Marek’s disease virus: from miasma to model, Nature Reviews Microbiology 4, 283 -294 40 33 Nair & H J Kung & orther authors (2004) Marek's Disease An Evolving Problem Elsevier Ltd 34 Nair (2018) Spotlight on avian pathology: Marek’s disease Avian Pathology 47 35 R Tulman, C L Afonso, Z Lu, L Zsak, D L Rock (2000) The genome of a very virulent Marek’s Disease Virus Plum Island Animal Disease Center 36 S J Spatz, C Rue, D Schumacher & N Osterrieder (2008) Clustering of mutations within the inverted repeat regions of a serially passaged attenuated gallid herpesvirus type strain Virus Genes 37 37 S Murata, T Hashiguchi, Y Hayashi, Y Yamamoto, A M Kato (2013) Characterization of Meq proteins from field isolates of Marek’s disease virus in Japan Elsevier - Infection, Genetics and Evolution 16 38 S Sbramaniam, L Preeyanon & H H Cheng (2013) Transcriptional Profiling of MEq - Dependent Genes in Marek’s Disease Resistant and Susceptible Inbred Chicken Lines Plos One Vol.8 39 Stik, G Dambrine, S Pfeffer, D Rasschaert (2013) The Oncogenic MicroRNA OncomiR - 21 Overexpressed during Marek’s Disease Lymphomagenesis Is Transactivated by the Viral Oncoprotein Meq Journal of Virology, Vol.87 40 W Jarosinski, B K Tischer, S Trap & N Osterrieder (2006) Marek’s disease virus: lytic replication, oncogenesis and control Future Drugs Ltd 41 W Morgan & J Burnside (2011) Roles of anvian herpesvirus microRNAs in infection, latency and oncogenesis Elsevier-Biochimica et Biophisica Acta 42 Woźniakowski, E Samorek-Salamonowicz, W Kozdruń (2016 Sequence analysis of meq oncogene among Polish strains of Marek’s disease Journal of Veterinary Sciences, Vol 13 43 Z H Yu, M Teng, J Luo, X W Wang, K Ding (2013) Molecular characteristics and evolutionary analysis of field Marek’s disease virus prevalent in vaccinated chicken flocks in recent years in China Virus Genes 47 44 Zelnik, B.Lupiani, L.F.Lee, X.Cui, I.Gimeno, A.Anderson, et al (2004) Marek’s disease virus - encoded Meq gene is involved in transformation of lymphocytes but is dispensable for replication PNAS - Microbiology Vol.101 41