Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu chẩn đoán virus hại lúa và tính gây bệnh của vi khuẩn bạc lá lúa

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NÔNG HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU CHẨN ĐỐN VIRUS HẠI LÚA VÀ TÍNH GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN BẠC LÁ LÚA” Sinh viên thực : KHUẤT THỊ YẾN Lớp : K62 - BVTVA Mã sinh viên : 620063 Chuyên ngành : BẢO VỆ THỰC VẬT Bộ môn : BỆNH CÂY Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS HÀ VIẾT CƯỜNG HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2021 Tác giả Khuất Thị Yến i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, nổ lực thân, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ động viên từ gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến thầy PGS.TS Hà Viết Cường – giám đốc trung tâm bệnh nhiệt đới trưởng môn Bệnh Người trực tiếp hướng dẫn đóng góp ý kiến quan trọng cho tơi suốt q trình thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy, cô giáo ngành BVTV khoa Nông học giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè ln động viên, khích lệ, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành đề tài Mặc dù cố gắng, kinh nghiệm cịn nên đề tài khơng thể tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, tơi mong nhận góp ý thầy, giáo mơn để đề tài tơi hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2021 Tác giả Khuất Thị Yến ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP x PHẦN I : MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tầm quan trọng lúa 2.2 Thành phần phân bố bệnh hại virus gây lúa giới 2.3 Các bệnh virus gây hại lúa phổ biến Việt Nam 2.3.1 Bệnh vàng lùn lúa: virus gây bệnh vàng lùn lúa rice grassy stunt virus 2.3.2 Bệnh lùn xoắn lá:virus gây bệnh lùn xoắn lúa rice ragged stunt virus 12 2.3.3 Bệnh lùn sọc đen phương nam: virus gây bệnh lùn sọc đen phương Nam Southern rice black-streaked dwarf virus 15 2.3.4 Bệnh vàng lụi lúa: virus rice yellow stunt virus gây 20 2.3.5 Biện pháp phịng chống bệnh hại virus lúa 21 2.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát triển kĩ thuật PTA ELISA 22 2.4.1 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 22 2.4.2 Nghiên cứu phát triển kĩ thuật chẩn đoán dựa vào huyết học ELISA 23 2.5 Nghiên cứu bệnh bạc lúa: Xanthomonas oryzae pv oryzae 25 iii 2.5.1 Phân bố bệnh bạc lúa giới Việt Nam 25 2.5.2 Triệu chứng, dấu hiệu quy luật phát sinh phát triển 27 2.5.3 Hình thái vi khuẩn khuẩn lạc 28 2.5.4 Biện pháp phòng chống 29 PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Đối tượng nghiên cứu 31 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 31 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 31 3.3 Vật liệu nghiên cứu 31 3.3.1 Mẫu 31 3.3.2 Môi trường sử dụng nuôi cấy 32 3.3.3 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 33 3.4 Phương pháp nghiên cứu 34 3.4.1 Phương pháp chiết RNA tổng số 34 3.4.2 Phương pháp RT – PCR 35 3.4.3 Kĩ thuật điện di sản phẩm RT-PCR gel Agarose % 37 3.4.4 Gây miễn dịch tạo kháng thể đa dòng thỏ 37 3.4.5 Đánh giá kháng thể kĩ thuật ELISA 38 3.4.6 Phân lập vi khuẩn 39 3.4.7 Kỹ thuật PCR kiểm tra chủng vi khuẩn Xanthomons Oryzae pv oryzae phân lập 40 3.4.8 Đánh giá khả gây bệnh chủng vi khuẩn bạc phân lập 42 PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Kết kiểm tra mẫu bệnh 43 4.1.1 Phát lùn sọc đen phương nam mẫu rầy, mẫu lúa thu thập Nghệ An (năm 2021) Trung tâm Bệnh nhiệt đới kĩ thuật RT-PCR, ELISA DOT BLOT 43 4.1.2 Phát virus rice yellow stunt virus gây bệnh vàng lụi lúa Hà Tĩnh năm 2021 kĩ thuật PTA-ELISA 46 iv 4.1.3 Phát virus vàng lùn, lùn xoắn mẫu bệnh thu thập Hậu Giang Kiên Giang năm 2021 kĩ thuật RT-PCR 49 4.1.4 Kiểm tra mẫu virus vàng lùn lùn xoắn mẫu khô Trung tâm Bệnh nhiệt đới kĩ thuật RT-PCR 51 4.2 Kết nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng 54 4.2.1 Gây miễn dịch thỏ kiểm tra có mặt kháng thể 54 4.2.2 Đánh giá ảnh hưởng hấp thụ chéo đến phản ứng PTA-ELISA KHT P9 S10N với công thức xử lý dịch nghiền khác 57 4.2.3 Đánh giá toàn KHT virus lúa kỹ thuật PTA- ELISA 60 4.2.4 Đánh giá chất lượng năm nguồn KHT: RGSV-Virion 08, RGSV- NCP 03, RRSV-Virion 10-L, RRSV-P9-10, RRSV-P9-21 kỹ thuật PTA-ELISA 63 4.3 Kết nghiên cứu Xanthomonas oryzae pv oryzae 66 4.3.1 Mẫu thu thập 66 4.3.2 Kiểm tra PCR dòng vi khuẩn phân lập 67 4.3.3 Kiểm tra khả gây bệnh chủng bạc phân lập 69 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 5.1 Kết luận 74 5.2 Kiến nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC 80 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AP Alkaline phosphatase BVTV Bảo vệ thực vật CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid ĐBSCL Đồng sông Cửu Long IgG Immunoglobulin gamma Kb Kilo base LB Luria Bertani Broth LBNT Lây bệnh nhân tạo LXL Lùn xoắn LSĐ Lùn sọc đen ml Mililiter NPP Nytrophenyl Phosphate OD Optical density PBS-T Phosphate Buffer Salin – Tween PCR Polymerase Chain Reaction PTA-ELISA Plate trapped antigen - ELISA RGSV Rice grassy stunt virus RNA Ribonucleic acid RRSV Rice ragged stunt virus RT-PCR Reverse transcriptase - PCR SDS - PAGE Sodium dedecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus TAE Tris-acetate-EDTA vi TBS Tris Buffer Salin TBS-T Tris Buffer Salin – Tween TEMED Tetramethyl ethylenediamine TTBCNĐ Trung tâm bệnh nhiệt đới VL Vàng lùn μg Microgram μl Microliter Xoo Xanthomonas oryzae pv oryzae vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1:Thành phần bệnh virus hại lúa Bảng 4.1:Phát virus LSĐ Nghệ An kiểm tra mẫu thu trung tâm bệnh nhiệt đới năm 2021 44 Bảng 4.2:PTA-ELISA kiểm tra RYSV mẫu lúa Hà Tĩnh thu ngày 30/06/2021 47 Bảng 4.3:Mẫu bệnh vàng lùn lùn xoắn Hậu Giang Kiên Giang năm 2021 49 Bảng 4.4: Kiểm tra mẫu lúa khô rice grassy stunt virus có TTBCNĐ 52 Bảng 4.5: Kiểm tra mẫu lúa khơ rice ragged stunt virus có TTBCNĐ 53 Bảng 4.6:Kết đánh giá có mặt kháng thể IgG đặc hiệu với virus SRBSDV virus RRSV kháng huyết thỏ lần lấy máu thứ kĩ thuật PTA - ELISA 55 Bảng 4.7:Kết đánh giá có mặt kháng thể IgG đặc hiệu với virus SRBSDV virus RRSV kháng huyết thỏ lần lấy máu thứ hai kĩ thuật PTA - ELISA 56 Bảng 4.8: Ảnh hưởng kỹ thuật xử lý mẫu bệnh đến khả phát virus SRBSDV PTA-ELISA 58 Bảng 4.9: Ảnh hưởng kỹ thuật xử lý mẫu bệnh đến khả phát virus RRSV PTA-ELISA 59 Bảng 4.10: PTA-ELISA đánh giá khả chẩn đoán virus hại lúa nguồn KHT sản xuất từ trước 61 Bảng 4.11: PTA-ELISA đánh giá khả chẩn đoán virus hại lúa nguồn KHT sản xuất từ trước 64 Bảng 4.12: Mẫu bệnh bạc vi khuẩn thu thập năm 2021 66 Bảng 4.13:Phát Xanthomonas oryzae pv oryzae kỹ thuật PCR 68 Bảng 4.14 :Kết lây nhiễm chủng giống lúa thị 70 Bảng 4.15:Kết lây nhiễm chủng giống lúa địa phương 72 viii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1:Triệu chứng bệnh lùn lúa cỏ (Satoh, Yoneyama et al., 2013) Hình 2.2:Thể virus RGSV kính hiển vi điện tử Thanh đen dài 100 nm (Hibino, Cabauatan et al., 1985) Hình 2.3:Sơ đồ cấu trúc gene RGSV 10 Hình 2.4:Triệu chứng bệnh lùn xoắn hại lúa rice ragged stunt virus (Lai, Zhang et al., 2018) 13 Hình 2.5:Sơ đồ virion RRSV ảnh hiển vi điện tử cho thấy virion hình cầu với mấu gai (trái) lớp vỏ (phải), bar 50 nm (Milne, Boccardo et al., 1982) 14 Hình 2.6:Sơ đồ cấu trúc gene RRSV(Milne, Boccardo et al., 1982) 15 Hình 2.7:Triệu chứng bệnh LSĐ TTBCNĐ 18 Hình 2.8:Cấu trúc phân tử SRBSDV (Viralzone, 2009) 19 Hình 2.9:Tổ chức gen SRBSDV(Milne, Boccardo et al., 1982) 19 Hình 2.10:Hình thái khuẩn lạc xanthomonas oryzae pv oryzae 29 Hình 4.1:RT- PCR kiểm tra mẫu bệnh virus LSĐ 45 Hình 4.2:Kiểm tra mẫu rầy lúa bệnh LSĐ PTA – ELISA Dot - blot 46 Hình 4.3:Triệu chứng bệnh nghi ngờ vàng lụi Hà Tĩnh năm 2021 48 Hình 4.4: PTA - ELISA kiểm tra virus vàng lụi Hà Tĩnh năm 2021 48 Hình 4.5:PCR phát RGSV mẫu Lúa cặp mồi RGSV- P6 - F/R cặp mồi RRSV – P9-F/R 50 Hình 4.6:Triệu chứng u sưng rễ mẫu lúa Kiên Giang năm 2021 51 Hình 4.7:Kiểm tra mẫu lúa khơ rice grassy stunt virus có TTBCNĐ 52 Hình 4.8:RT-PCR (TWO STEP – ONE STEP) kiểm tra mẫu lúa khơ RRSV 53 Hình 4.9:PTA-ELISA kiểm tra kháng huyết P9 (RRSV) S10N (SRBSDV) sau lần lấy máu thứ sau sau lần lấy máu thứ hai 57 Hình 4.10 Kết ELISA kiểm tra độ nhạy nồng độ kháng thể huyết tương điều kiện hấp thụ chéo không hấp thụ chéo 60 ix Hình 4.12: Dịng dịch vi khuẩn từ mẫu bạc lúa thu thập năm 2021 kĩ thuật lam ép Hình 4.13:Triệu chứng bạc vi khuẩn gây thu thập năm 2021 4.3.2 Kiểm tra PCR dòng vi khuẩn phân lập Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây bệnh bạc lúa Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzicola (Xoc) gây bệnh đốm sọc vi khuẩn, hai loại vi khuẩn gây bệnh quan trọng nhất, đặc biệt Xoo lúa Cả hai loài bệnh thường đồng nhiễm lúa đồng ruộng thường đồng phân lập từ mẫu Việc phân biệt Xoo với Xoc dựa hình thái khuẩn lạc khơng thể Gần đây, loại mồi đặc hiệu để phân biệt X oryzae 67 với vi khuẩn khác phát triển Hơn nữa, từ đoạn mồi này, tập hợp mồi xác nhận cho hệ thống multiplex PCR với mục tiêu phân biệt Xoo với Xoc với vi khuẩn khác phản ứng nhất.Trong thí nghiệm này, kỹ thuật PCR sử dụng hỗn hợp mồi, sử dụng để phát Xoo từ khuẩn lạc phân lập Những tách tạo sản phẩm 162 bp để xác định Xanthomonas oryzae tạo băng sản phẩm 162bp 331 bp dành riêng cho loài Xanthomonas oryzae pv oryzae Đối với mẫu, hai khuẩn lạc thử nghiệm Kết PCR, thể Bảng 4.13 Bảng 4.13:Phát Xanthomonas oryzae pv oryzae kỹ thuật PCR STT Mẫu Kết xác định Kết phân lập PCR môi trường Nam Định + + Xoo-1 Nam Định + + Xoo-2 Hà Nội + + Xoo-3 Ghi chú: (+) có vi khuẩn Xanthomonas oryzae; (-) khơng có vi khuẩn Xanthomonas oryzae Kết luận: dựa vào bảng cho thấy khuẩn lạc từ mẫu PCR dương tính với Xoo tạo hai băng cụ thể, 162 331 bp Kết dễ hiểu tất mẫu chọn để phân lập có triệu chứng điển hình bạc lúa Đối với chủng mang lây nhiễm để đánh giá khả gây bệnh 68 Hình 4.14: Multiplex PCR phân lập Xoo chọn từ khuẩn lạc dương tính Chú thích : M bậc thang DNA 100 bp với dải tham chiếu ký hiệu.1,2,3: isolate Xoo – 01, Xoo – 02, Xoo – 03 Hai dải, 331 162 bp, dành riêng cho vi khuẩn Xoo định mũi tên 4.3.3 Kiểm tra khả gây bệnh chủng bạc phân lập 4.3.3.1 Khả gây nhiễm chủng bạc giống lúa thị Để xác định khả gây bệnh dịng vi khuẩn Xoo, chúng tơi tiến hành thí nghiệm dòng phân lập lúa 10 giống khác (IRBB2, IRBB 3, IRBB 4, IRBB 5, IRBB 7, IRBB 10, IRBB 11, IRBB 14, IRBB 21, IR24, IR64) phương pháp cắt kéo trình bày Phần III mục 3.10 Các tất giống trồng bầu đến giai đoạn 7-10 Các dịng phân lập ni cấy môi trường PSA Sau ngày ủ, chủng phân lập hòa lại nước cất sử dụng để thí nghiệm phương pháp cắt kéo Ít cắt dòng phân lập Sau ngày lây nhiễm sau 18 ngày lây nhiễm tiến hành đo chiều dài vết bệnh, chủng phân lập đo điển hình tính trung bình Tuy 69 nhiên, đối chứng IR24 vết bệnh chạy dài hết nên đo kết sau 11 ngày kết thúc thí nghiệm Chúng tơi thu thập gieo trồng 10 dòng lúa đẳng gen mang gen kháng có nguồn gốc từ IRRI lấy từ Trung tâm Bệnh nhiệt đới- Học viện nông nghiệp Việt Nam trồng nhà lưới Trung tâm Bệnh nhiệt đới IR24 không chứa gen kháng nên chọn làm giống chuẩn nhiễm làm giống đối chứng nhiễm Kết thể Bảng 4.14 Hình 4.16 Bảng 4.14 :Kết lây nhiễm chủng giống lúa thị Chiều dài vết bệnh sau Chiều dài vết bệnh sau Tỉ lệ R/M/S ngày lây nhiễm 11 ngày lây nhiễm STT Giống Xoo1/ Xoo1 Xoo2 Xoo3 H20 Xoo1 Xoo2 Xoo3 H20 Xoo2/ Xoo3 IRBB 4.4 6.6 8.6 5.8 8.2 M/R/S IRBB 3 3.2 4.6 5.2 R/R/R IRBB 11.6 10.2 9.2 13.6 11.8 11.2 S/M/M IRBB 1.2 1.8 R/R/R IRBB 10 8.6 7.8 12 9.2 10.4 M/M/M IRBB 10 10.8 8.6 12.8 9.8 11.4 S/M/M IRBB 11 11 8.2 12.8 10.2 10.6 S/M/M IRBB 14 12.6 7.6 8.6 16 9.4 12.8 S/M/S IRBB 21 10 10.2 14.6 11.6 14.4 S/M/S 10 IR 24 13 10.2 10.6 17.4 15.4 14.2 S/S/S 11 IR64 12.2 9.8 10 19 12.2 15.8 S/S/S R/M/S 2/1/8 3/6/2 2/5/4 Kết luận: Dựa vào bảng lây nhiễm chủng vi khuẩn bạc với dòng lúa thị thấy rằng: Tất chủng Xoo lây nhiễm với dòng IR24 cho kết nhiễm với 11 ngày chạy hết Giống IR64 bị nhiễm hoàn toàn với chủng tỉ lệ 3/3 chủng, nên khả bị nhiễm cao 70 Các dịng IRBB14, IRBB21 có tỉ lệ nhiễm cao 2/3 chủng Các dòng IRBB2,IRBB4, IRBB10, IRBB11 có tỉ lệ nhiễm thấp 1/3 chủng Các dịng IRBB3, IRBB5 có khả kháng cao khơng bị nhiễm với chủng Điều có ý nghĩa quan trọng với nhà chọn giống sau Chủng gây nhiễm cao với dòng đẳng gen 8/11 dòng, chủng gây nhiễm thứ hai với 4/11 dòng, chủng gây nhiễm thấp với 2/11 dòng Hình 4.15:Kết lây nhiễm bạc chủng Xoo giống thị 4.3.3.2 Khả gây nhiễm chủng bạc giống lúa địa phương Chúng tơi tìm hiểu thu thập giống lúa trồng chủ yếu miền Bắc đế tiến hành đánh giá tính gây bệnh chủng vi khuẩn bạc Kết thể Bảng 4.15 Hình 4.17 71 Bảng 4.15:Kết lây nhiễm chủng giống lúa địa phương STT Chiều dài vết bệnh sau Chiều dài vết bệnh sau ngày lây nhiễm 18 ngày lây nhiễm Giống Xoo1 Xoo2 Xoo3 H20 Xoo1 Xoo2 Xoo3 H20 Tỉ lệ R/M/S Xoo1/ Xoo2/ Xoo3 Nếp 10.6 5.4 7.4 14.6 11.6 12.6 S/M/S BC15 13.6 11.4 10 22.6 16.6 18.6 S/S/S BT số 12.8 11.6 10 24.6 21 16.4 S/S/S 10.6 21.6 S Trung ương HP 9.2 18.8 S Đ1 9.4 22.4 S Đ4 21 S Kết luận: Các giống lúa: Trung ương, HP, Đ1, Đ4 giống lúa có số lượng khơng đủ lây nhiễm chủng nên sử dụng chủng để lây nhiễm Dựa vào kết lây nhiễm chủng cho thấy giống lúa bị nhiễm nặng Các giống lúa Nếp, BC15, BT số giống lúa trồng phổ biến miền Bắc, tất giống gây nhiễm nặng chủng bạc với tỉ lệ 2/3, 3/3, 3/3 72 Hình 4.16:Kết lây nhiễm bạc chủng Xoo giống địa phương 73 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua trình thực đề tài, xin phép đưa kết luận sau: Kiểm tra RT-PCR, ELISA Dot-Blot không phát thấy SRBSDV, RRSV, RGSV RYSV mẫu lúa thu thập vụ xuân năm 2021 Kiên Giang, Hậu Giang, Nghệ An Hà Tĩnh Kiểm tra mẫu lúa nhiễm RRSV bảo quản điều kiện khô từ năm 2009 RT-PCR cho thấy kỹ thuật RT-PCR bước cho kết phản ứng tốt so với kỹ thuật RT-PCR bước Kết cho thấy virus lúa phát từ mẫu lúa bảo quản khô nhiệt độ phòng sau 11 năm Dựa kết này, mẫu lúa nhiễm RGSV RRSV xác lại từ mẫu bảo quản khô sau 11 năm năm nhằm làm vật liệu để nghiên cứu chẩn đoán kháng huyết Đã gây miễn dịch thỏ kháng nguyên tái tổ hợp virus protein mã hóa protein P9 RRSV protein S10 SRBSDV Kết đánh giá kháng huyết thu PTA-ELISA cho thấy kháng huyết SRBSDV không chứa kháng thể đặc hiệu virus cịn kháng huyết RRSV có chứa kháng thể đặc hiệu virus kháng thể đặc hiệu protein Đối với kháng huyết RRSV (P9), kỹ thuật gồm hấp thụ chéo kháng huyết xử lý dịch chiết bệnh Urea làm tăng độ nhạy tính đặc hiệu kháng huyết Kỹ thuật PTA-ELISA sử dụng để đánh giá khả chẩn đoán nguồn kháng huyết virus RRSV, RGSV SRBSDV sản xuất bảo quản từ trước TTNCBCND Kết kiểm tra xác định nguồn trì khả chẩn đốn, nguồn kháng huyết RGSV-virion-08 (đặc hiệu RGSV) nguồn RRSV-P9-10 (đặc hiệu 74 RRSV) có tiềm chẩn đốn tốt nhất, ứng dụng thực tiễn chẩn đoán virus Đã thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn bạc lúa từ mẫu lúa bị bệnh bạc thu thập Nam Định Phúc Thọ-Hà Nội vụ xuân năm 2021 Danh tính vi khuẩn xác định đặc điểm hình thái mơi trường PCR-lồng (nested-PCR) Cả mẫu vi khuẩn, Xoo-1, Xoo-2 Xoo-3, đánh giá tính gây bệnh số dịng lúa thị tính kháng Kết đánh giá cho thấy mẫu vi khuẩn gây bệnh từ trung bình tới mạnh giống lúa thị gây bệnh yếu dòng IRBB3 (mang gen kháng Xa3) IRBB5 (mang gen kháng (Xa5) Tuy nhiên mẫu Xoo-1 có tính gây bệnh mạnh so với mẫu Xoo-2 Xoo-3 dựa mức độ phản ứng dòng lúa thị Mẫu vi khuẩn Xoo-1 sử dụng để đánh giá khả kháng nhiễm giống lúa địa phương gồm Nếp, BC15, BT số 7, TW, HP, Đ1 Đ4 Kết lây nhiễm cho thấy tất giống mãn cảm với mẫu vi khuẩn 5.2 KIẾN NGHỊ Bài báo cáo số hạn chế, muốn đưa số kiến nghị: Tiếp tục nghiên cứu tạo kháng huyết đặc hiệu virus SRBSDV, RRSV, RGSV Từ sản xuất kit chẩn đoán nhanh bệnh đồng ruộng để đưa biện pháp khắc phục nhanh chóng kịp thời 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Báo ĐN (8/9/2010) Bệnh lùn sọc đen phát sinh 28 tỉnh, thành phố Tác giả Mạnh Hưng http://www.qdnd.vn/QDNDSite/viVN/61/43/7/24/24/123115/Default.aspx Báo Nông nghiệp Việt Nam, ngày 7/9/2009 Chuyện khẩn cấp Nghệ An 5.500 lúa hè thu bị Vàng lùn – lùn xoắn Tác giả: Sao Mai http://nongnghiep.vn/vi-VN/61/158/45/45/45/39098/Default.aspx Báo TNT (4/8/2010) ĐBSH: Thắng lùn sọc đen nhờ gieo thẳng Tác giả Hữu Nguyên Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn Công điện số 31/CĐ BNNBVTV/vv Cảnh giác bệnh VL-LXL lúa bộc phát lần phía Bắc để phát hiện, phòng trừ kịp thời Đỗ Tiến Công (2008) Thử nghiệm chế tạo kháng huyết virus lúa cỏ Rice grassy stunt virus (RGSV) Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp Hà Viết Cường cộng (2009) "Xác định nguyên nhân gây bệnh lùn sọc đen (lùn lụi) lúa vụ mùa 2009 miền Bắc" TT BCNĐ, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Hà Viết Cường cộng (2010) "Xác định nguyên nhân gây bệnh vàng lúa tỉnh Bắc Giang vụ mùa 2010" TT BCNĐ, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Lê Lương Tề (1998), “Các chủng sinh lý (race) Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lúa vùng ðơng Nam Á”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, tháng 6/1998, tr.39-42 Lê Lương Tề Vũ Triệu Mân (2001) Giáo trình bệnh nơng nghiệp NXBNN Hà Nội 10.Lương Minh Châu, Nguyễn Thị Phong Lan 1995 „ kết bước đầu nghiên cứu lan truyền bệnh lùn xoắn lúa rầy nâu‟ Tạp chí NN CNTP, số 4, trang 143-144 11.Tạ Minh Sơn (1987), Bệnh bạc vi khuẩn (Xanthomonas oryzae ) tạo giống chống bệnh, Luận án PTS khoa học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông 76 nghiệp Việt Nam, 186tr 12.Vũ Triệu Mân (6/2010) Nghiên cứu sản xuất kit chẩn đoán nhanh virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lúa Báo cáo tổng kết kết khoa học công nghệ đề tài Tài liệu tiếng Anh Boccardo G, Milne RG (1984) Plant reovirus group CMI/AAB, Descriptions of Plant Viruses No 294, Association of Applied Biologists,Wellesbourne, Warwick Buddenhagen, I., H Vuong and D Ba (1979) "Bacterial blight found in Africa." International Rice Research Newsletter 4(1) Chang, S and J Puryear "Cairney (1993) A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees." Plant molecular biology reporter 11(2): 113-116 Chen, C and R Chiu (1989) "Transmission of rice wilted stunt virus by brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål)." Bull Taichung Dist Agric Improv Stn 23: 3-10 Chen, R., J Wu, S Zhu and J Zhang (1984) "Flight capacity of the brown planthopper Nilaparvata lugens Stal." Acta Entomologica Sinica (China) Cuong, H V., N V Hai, V T Man and M Matsumoto (2009) "Rice dwarf disease in North Vietnam in 2009 is caused by southern rice blackstreaked dwarf virus (SRBSDV)." Bulletin of the Institute of Tropical Agriculture, Kyushu University 32(1): 85-92 Gibbs, A and B Harrison (1976) Plant virology the principles, Edward Arnold Gnanamanickam, S., V B Priyadarisini, N Narayanan, P Vasudevan and S Kavitha (1999) "An overview of bacterial blight disease of rice and strategies for its management." Current Science: 1435-1444 Hibino, H (1986) "Rice grassy stunt virus." Tropical Agriculture Research Series 19: 165-172 10.Hibino, H (1996) "Biology and epidemiology of rice viruses." Annual review of phytopathology 34(1): 249-274 77 11.Hibino, H., P Cabauatan, T Omura and T Tsuchizaki (1985) "Rice grassy stunt virus strain causing tungrolike symptoms in the Philippines." Plant Disease 69(6): 538-541 12.Hoàng, V T (2010) "Bệnh chuyên khoa." Giáo trình trực tuyến Đọc từ: http://www ctu edu vn/colleges/agri/gtrinh 15(10): 2015 13.Lai, D., Y Zhang, Q Huang, G Yin, K K Pennerman, Z Liu and A Guo (2018) "Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification to rapidly detect Rice ragged stunt virus." Saudi journal of biological sciences 25(8): 1577-1584 14.Ling, K., V Aguiero and S H Leel (1970) "TO GRASSY STUNT DISEASE OF RICE." The Plant Disease Reporter 54: 565 15.Mayo, A (2000) "The role of employee development in the growth of intellectual capital." Personnel Review 16.Milne, R., G Boccardo and K Ling (1982) "Rice ragged stunt virus." CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses 16: 248 17.Raina, G., G Sidhu and P Saini (1981) "Rice bacterial blight status in the Punjab, India." International Rice Research Newsletter 6: 12 18.Satoh, K., K Yoneyama, H Kondoh, T Shimizu, T Sasaya, I Choi, K Yoneyama, T Omura and S Kikuchi (2013) "Relationship between gene responses and symptoms induced by Rice grassy stunt virus." Frontiers in Microbiology 4: 313 19.Toriyama, S., T Kimishima, M Takahashi, T Shimizu, N Minaka and K Akutsu (1998) "The complete nucleotide sequence of the rice grassy stunt virus genome and genomic comparisons with viruses of the genus Tenuivirus." Journal of General Virology 79(8): 2051-2058 20.Wang, Qi and Cutler (1993) "A simple method of preparing plant samples for PCR." Nucleic Acids Res 21(17): 4153-4154 21.Wang, T C., R D Cardiff, L Zukerberg, E Lees, A Arnold and E V Schmidt (1994) "Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV-cyclin D1 transgenic mice." 22.Zhou, G., J Wen, D Cai, P Li, D Xu and S Zhang (2008) "Southern rice black-streaked dwarf virus: a new proposed Fijivirus species in the 78 family Reoviridae." Chinese science bulletin 53(23): 3677-3685 23.Zhou, G., D Xu and H Li (2004) Identification of rice black streaked dwarf virus infecting rice in Guangdong Proceedings of the conference on Chinese plant pathology, Agricultural Scientech Press Beijing, China 24.Zhou, G., D Xu, D Xu and M Zhang (2013) "Southern rice blackstreaked dwarf virus: a white-backed planthopper-transmitted fijivirus threatening rice production in Asia." Frontiers in Microbiology 4: 270 79 PHỤ LỤC Bảng phụ lục: Lịch tiêm thỏ lấy máu thỏ LẦN TIÊM NGÀY VỊ TRÍ TIÊM LẤY MÁU Chân sau: đùi trái, đùi phải 11/4/2021 S10-N Chân sau: đùi trái, đùi phải 11/4/2021 Chân sau: đùi trái, đùi phải 18/4/2021 S10-N Chân sau: đùi trái, đùi phải 18/4/2021 Chân sau: đùi trái, đùi phải 28/4/2021 S10-N Chân sau: đùi trái, đùi phải sau lần tiêm 28/4/2021 P9 Chân sau: đùi trái, đùi phải sau lần tiêm 6/5/2020 S10-N Chân sau: đùi trái, đùi phải sau lần tiêm 6/5/2020 P9 sau lần tiêm 8/5/2021 S10-N Toàn máu P9 Tồn máu 4/4/2021 P9 P9 P9 80 Hình phụ lục: Tiến hành gây miễn dịch thỏ Hình phụ lục: Kết lây nhiễm chủng bạc sau 18 ngày 81