Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh (candidatus liberibacter asiaticus) và bệnh tàn lụi (citrus tristeza virus) trên cây có múi bằng kỹ thuật miễn dịch

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NÔNG HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH (Candidatus Liberibacter Asiaticus) VÀ BỆNH TÀN LỤI (Citrus Tristeza Virus) TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH” Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS HÀ VIẾT CƯỜNG Người thực : CHU HOÀNG SƠN Lớp : K60CNSHB MSV : 600796 Bộ môn : BỆNH CÂY Hà Nội – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu báo cáo hoàn tồn trung thực chưa sử dụng, cơng bố báo cáo, luận văn, luận án công trình nghiên cứu khoa học trước Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn sử dụng luận văn ghi nguồn gốc rõ ràng, đảm bảo trích dẫn theo quy định Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2021 Sinh viên Chu Hồng Sơn LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận nhiều giúp đỡ tận tình từ thầy cơ, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn kính trọng sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Hà Viết Cường - Trưởng Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học Học viện Nông nghiệp Việt Nam - người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ vật tư, hóa chất, cho tơi hướng nghiên cứu bệnh cây, dành nhiều công sức, thời gian, đóng góp ý kiến vơ quan trọng tạo điều kiện để tơi thực hồn thành đề tài Khóa luận thực Trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam số vùng trồng ăn có múi huyện Gia Lâm, Hà Nội Tôi nhận giúp đỡ tập thể cán Bộ môn Bệnh khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Các chị kỹ thuật viên trung tâm bệnh nhiệt đới suốt trình thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu dành cho Chân thành cảm ơn gia đình, bạn, anh chị nhóm khóa luận nghiên cứu bệnh chia sẻ kinh nghiệm quý báu nghiên cứu giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần tơi phương diện, để tơi hồn thành tốt khóa luận Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2021 Sinh viên Chu Hoàng Sơn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẲNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT x PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Nội dung nghiên cứu .3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng Quan Cây Có Múi 2.1.1 Về nguồn gốc: 2.1.2 Phân loại: 2.1.3 Tình hình sản xuất có múi Việt nam 2.2 Tổng quan bệnh vàng gân xanh (HLB) 2.2.1 Lịch sử phân bố bệnh vàng gân xanh .6 2.2.2 Tác nhân gây bệnh - Vi khuẩn Candidatus liberibacter (Ca L) 2.2.3 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh .8 2.2.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh vàng gân xanh .12 2.3 Tổng Quan Về Bệnh Tàn Lụi Cây Có Múi (Citrus Tristeza Virus – CTV) 14 2.3.1 Lịch sử phân bố 14 2.3.2 Tác nhân gây bệnh 14 2.3.3 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh 16 2.3.4 Truyền bệnh biện pháp phòng chống .17 2.3.5 Chẩn đoán CTV 19 2.4 Tổng Quan Tình Hình Nghiên Cứu Trong Nước Và Ngồi Nước 20 2.4.1 Nghiên cứu nước 20 2.4.2 Nghiên cứu nước 22 2.5 Hệ thống biểu kỹ thuật dùng nghiên cứu 24 2.5.1 Hệ thống biểu 24 2.5.2 Hệ thống vector biểu .25 2.5.3 Các kỹ thuật dung nghiên cứu .26 2.5.4 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 28 PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Thời gian địa điểm 32 3.2 Vật liệu nghiên cứu .32 3.2.1 Sinh Phẩm .32 3.2.2 Các chất kháng sinh 32 3.2.3 Hóa chất 32 3.2.4 Môi trường 33 3.2.4 Các thiết bị máy chủ yếu .33 3.3 Nội dung nghiên cứu .33 3.4 Phương pháp nghiên cứu 34 3.4.1 Phương pháp tách chiết DNA RNA tổng số CTAB 34 3.4.2 Phương pháp PTA- ELISA (Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immune Sorbent Assay) 38 3.4.3 Phương pháp gây miễn dịch thỏ .39 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 Kết chuẩn bị kháng nguyên tái tổ hợp 40 4.1.1 Phục hồi nguồn vi khuẩn E Coli Rossetta DE3 Rossetta DE3 + pET28a 40 4.1.2 Biểu protein tái tổ hợp cấu trúc pET28a + OMP-N, pET28a +OMP-C pET28a + CTV-CP 40 4.1.3 Điện di sản phẩm cảm ứng nhân nuôi 42 4.2 Kết sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu cho HLB CTV kỹ thuật miễn dịch .43 4.2.1 Chuẩn bị nguồn kháng nguyên đặc hiệu .44 4.2.2 Tiến hành gây miễn dịch thỏ 44 4.2.3 Kiểm tra kháng huyết thu kỹ thuật PTA-ELISA 46 4.3 Chẩn đoán bệnh HLB CTV kĩ thuật PCR RT-PCR 50 4.3.1 Kết kiểm tra mẫu dùng phản ứng ELISA phương pháp sinh học phân tử 59 4.3.2 Một số bệnh thường gặp có múi số triệu chứng khơng điển hình bệnh HLB .62 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 73 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AP Alkaline phosphate APS Ca L Ca Las Dream Taq MM Amonium persulfate Candidatus Liberibacter Candidatus Liberibacter aseaticus Dream Taq Master Mix CT CTAB CTV DNA E.coli OMP HLB Công thức Cetyltrimethylammonium bromide Bệnh tàn lụi (Citrus tristeza closterovirus) Deoxyribonucleic acid Escherichia coli Outer membrain protein Huanglongbinh TPTG Isopropyl – b, D – thiogalactoside OMP Kb kDa PCR RT - PCR l Ml NPP OD ELISA PTA - ELISA LB SDS-PAGE TAE TEMED Outer membrain protein Kilo base Kilodalton Polymerase Chain Reaction Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction Microliter Mililiter Nitro Phenyl Phosphate Optical density Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Luria Bertani Sodium dedecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis Tris acetate EDTA Tetramethyl ethylenediamine DANH MỤC BẲNG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 3.3 Thành phần gel dung SDS – PAGE 37 Bảng 4.1 Kết cảm ứng sản phẩm tái tổ hợp mang gene đích biến nạp vào vector pET28a 41 Bảng 4.2 PTA-ELISA kiểm tra kháng huyết HLB-N sau tiêm lần (13/5/2021) .46 Bảng 4.3 PTA-ELISA kiểm tra kháng huyết HLB-C sau tiêm lần (13/5/2021) .47 Bảng 4.4 PTA-ELISA kiểm tra kháng huyết CTV-CP sau tiêm lần (13/5/2021) .48 Bảng 4.5 PTA-ELISA kiểm tra đối chứng kháng huyết (13/5/2021) 49 Bảng 4.6 Kết kiểm tra 12 mẫu Trung tâm Bệnh Nhiệt đới kỹ thuật PCR để chẩn đoán HLB 52 Bảng4.7 Kết kiểm tra mẫu cam thu thập Thanh Hóa kỹ thuật PCR để chẩn đoán HLB 54 Bảng 4.8 Kết kiểm tra mẫu cam thu thập Thanh Hóa kỹ thuật RT-PCR để chẩn đốn CTV .55 Bảng 4.9 Kết kiểm tra 16 mẫu cam thu thập Nghệ An kỹ thuật PCR để chẩn đoán HLB 58 Bảng 4.10 Kết kiểm tra mẫu dùng cho phản ứng ELISA phương pháp sinh học phân tử .60 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân bố bệnh vàng gân xanh (HLB) Thế giới Hình 2.2 Triệu chứng bệnh vàng gân xanh phận 10 Hình 2.3 Vector rầy chổng cánh châu Á (Diaphorina citri) truyền bệnh vàng gân xanh 11 Hình 2.4 Hình thái Citrus Tristeza Virus (CTV) 15 Hình 2.5 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh CTV phận bị nhiễm .17 Hình 2.6 Cấu trúc vector pET 28a(+) 26 Hình 4.1 Kết điện di SDS-PAGE protein tái tổ hợp 42 Hình 4.2 Điện di lượng lớn protein tái tổ hợp phương pháp SDS - PAGE 43 Hình 4.3 Thỏ giống Newzealand tháng tuổi sau lần gây miễn dịch .45 Hình 4.4 Kết phản ứng ELISA ngày 13/5/2021 CT 49 Hình 4.5 So sánh kết PTA- ELISA kháng thể ba cơng thức thí nghiệm 50 Hình 4.6 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh mẫu thu thập Thanh Hóa 51 Hình 4.7 Kết kiểm tra sản phẩm PCR điện di DNA 53 Hình 4.8 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh mẫu thu thập Thanh Hóa ) 53 Hình 4.9 Băng điện di sản phẩm DNA mẫu thu thập .55 Hình 4.10 Băng điện di sản phẩm RT-PCR mẫu thu thập .56 Hình 4.11 Hình ảnh triệu chứng, dấu hiệu bệnh trên mẫu thu thập Nghệ An 57 Hình 4.12 Băng điện di sản phẩm PCR 16 mẫu thu thập 59 Hình 4.13 Kết chẩn đốn mẫu đối chứng bị nhiễm CTV với bệnh HLB phương pháp PCR 61 Hình 4.14 Kết chẩn đốn mẫu đối chứng bị nhiễm HLB với bệnh CTVbằng phương pháp RT- PCR 61 Hình 4.15 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh khơng điển hình cam thu thập Cao Bằng 63 Hình 4.16 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh điển hình cam 63 Hình 4.17 Triệu chứng bệnh đốm dầu thu thập Cao Bằng 64 Hình 4.18 Triệu chứng bị bệnh đốm dầu mẫu thu thập Cao Bằng 65 Hình 4.19 Triệu chứng bệnh khơ cành có múi thu thập Cao Bằng 66 Hình 4.20 Triệu chứng bệnh loét có múi mẫu lưu trữ trung tâm bệnh nhiệt đới 66 HLB-10 CTV-1 CTV-2 CTV-3 K1 K2 K3 + + - + + + - (Ghi chú: + :Dương tính, - : Âm tính) Hình 4.13 Kết chẩn đốn mẫu đối chứng bị nhiễm CTV với bệnh HLB phương pháp PCR (+Ve: đối chứng dương, M: Marker) Nhận xét: Các mẫu Dc1, Dc2, Dc3 cam ghép cho kết âm tính với bệnh HLB Trong đó, Dc-k7 Dc-k8 cam vi ghép đỉnh sinh trưởng cho kết âm tính.Ba mẫu ctv1, ctv2 ctv3 chẩn đốn bị nhiễm CTV cho kết âm tính HLB chứng tỏ không bị nhiễm chéo bệnh với Đối chứng dương bị nhiễm HLB lưu trữ trung tâm Hình 4.14 Kết chẩn đoán mẫu đối chứng bị nhiễm HLB với bệnh CTVbằng phương pháp RT- PCR (+Ve: đối chứng dương, M: Marker) Nhận xét: Các mẫu Dc1 Dc2 mẫu đối chứng cho kết âm tính với CTV, mẫu Dc3 cho kết dương tính với bệnh nên loại bỏ Cả mẫu hlb4, hlb7 hlb10 đêù cho thấy kết âm tính với CTV, không bị nhiễm chéo với CTV Đối chứng dương nguồn bị nhiễm CTV trung tâm lưu trữ 4.3.2 Một số bệnh thường gặp có múi số triệu chứng khơng điển hình bệnh HLB Trong thực tế sản xuất có múi ngồi đồng ruộng việc chẩn đoán bệnh vàng gân xanh cho triệu chứng khơng điển hình dễ gây nhầm lẫn với triệu chứng, dấu hiệu bệnh bệnh nấm bệnh sinh lý thiếu kẽm Do tiến hành thu thập số mẫu có triệu chứng, dấu hiệu bệnh khơng điển hình tiến hành chẩn đốn phương pháp sinh học phân tử so sánh với số mẫu có dấu hiệu điển hình dương tính với bệnh vàng gân xanh mẫu khơng điển hình thu thập tai Cao Hình 4.15 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh khơng điển hình cam thu thập Cao Bằng Hình 4.16 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh điển hình cam Ở hình 4.15 Có xuất triệu chứng xuất vùng thịt bị biến vàng cục Lá bé có dạng tai thỏ, xuất hiện tượng bị biến dạng số lá, nhiên phần gân chưa xuất triệu chứng điển hình khơng xuất dấu hiệu bệnh Ở hình 4.16 có triệu chứng đốm vàng, thịt biến vàng, ven gân giữ màu xanh lục, gân nổi, nhỏ hẹp, thô cứng, cong Đây triệu chứng điển hình bệnh vàng gân xanh Bệnh đốm dầu có múi Trên mẫu thu thập đồng ruộng, phát xuất triệu chứng điển hình bệnh đốm dầu xuất phổ biến mẫu Cao Bằng Triệu chứng điển hình xuất mặt xuất vết loang màu nâu liu, có viền sang bao quanh, vết bệnh liên kết với tạo thành đám lớn, bệnh nặng nấm bao phủ tồn mặt gây cản trở q trình quang hợp hô hấp gây rụng Hình 4.17 Triệu chứng bệnh đốm dầu thu thập Cao Bằng Bệnh ghẻ có múi T rên non vết bệnh ban đầu điểm nhỏ màu vàng, dạng giọt dầu gờ, vết bệnh to dần màu hồng nâu, xung quanh có quầng vàng hẹp Vết bệnh thường lồi lên hình chóp, lên mặt lá, mặt dưỡi lõm vào Vết bệnh nằm riêng rẽ nối liền Vết bệnh lồi lên đầu tăm mặt lá, mặt lõm vào, biến dạng Hình 4.18 Triệu chứng bị bệnh đốm dầu mẫu thu thập Cao Bằng Bệnh khơ đầu cành có múi Triệu chứng xuất hiện tượng úa vàng đầu chồi, gân bị biến màu sang vàng nhạt Bệnh lan đến cành nhánh gây tượng chết khơ, vết đen nhơ lên có màu xám tro xám đen cành khơ héo khối nấm Hình 4.19 Triệu chứng bệnh khơ cành có múi thu thập Cao Bằng Bệnh loét có múi Triệu chứng xuất đốm vàng mặt sau đầu tiên, sau đốm vàng lan đến mặt Xung quanh vết bệnh có xuất quầng vàng bao quanh Tâm vết bệnh có màu nâu thẫm, nặng vết bệnh liên kết với tạo thành đám lớn gây ảnh hưởng lớn đến trình quang hợp cây, sau gây tượng rụng hang loạt Hình 4.20 Triệu chứng bệnh loét có múi mẫu lưu trữ trung tâm bệnh nhiệt đới PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã biểu thành công protein tái tổ hợp OMP-N, OMP-C, CTV-CP từ nguồn vật liệu lưu trữ Trung tâm bệnh nhiệt đới Kết kiểm tra PTA-ELISA cho thấy hai loại kháng thể HLB-N HLB-C chứa kháng thể đặc hiệu vi khuẩn Ca L Kết kiểm tra PTA-ELISA cho thấy kháng thể CTV-CP có chứa kháng thể đặc hiệu virus Tristeza khơng sinh kháng thể đặc hiệu, số liệu OD khỏe bệnh chênh sai số đối chứng Kháng thể HLB-N cho kết giá trị OD trung bình cao CT3- Xử lý Urê, nguyên nhân protein đầu N dạng cấu trúc bậc nằm ẩn màng tế bào nên xử lý urê giúp chuyển sang cấu trúc bậc nên tạo hiệu cao cao Trong với kháng thể HLB-C có trúc xuyên màng protein mã hóa vỏ CP CTV dễ gây phản ứng miễn dịch xử lý với đệm Carbonat Ở kháng thể xử lý song siêu âm cho kết không tốt, lý đưa song siêu âm ảnh hưởng đến liên kết kháng nguyênkháng thể Kiểm tra mẫu thu thập phương pháp sinh học phân tử nhằm chẩn đoán bệnh HLB CTV cho thấy bệnh phổ biến có múi xuất nhiều thực tế sản xuất có múi nước ta Đa số kết chẩn đoán dựa vào triệu chứng, dấu hiệu bệnh cho kết đồng với chẩn đoán dựa vào phương pháp sinh học phân tử bệnh HLB CTV Tuy nhiên, có sơ mẫu cho kết trái ngược lý giải triệu chứng, dấu hiệu bệnh HLB CTV giống với bệnh sinh lý bệnh nấm khác 5.2 Kiến nghị Cần có thí nghiệm dựa theo phương pháp khác nhằm đánh giá tinh đặc hiệu kháng thể thu Tiếp tục sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp OMP-N OMP-C nhằm sản xuất kít chẩn đốn nhanh bệnh ngồi thực tế sản xuất, từ đưa biện pháp phòng – chống phù hợp Cần có thêm thí nghiệm sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu cho CTV theo phương pháp khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1.Hà Viết Cường (2010), Bài giảng Công nghệ sinh học bệnh 2.Hà Viết Cường (2011), Bài giảng virus thực vật, phytoplasma viroid, NXB Nông nghiệp Hà Nội 3.Đặng Vũ Thị Thanh, Hà Minh Trung (1997), Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, tập 1, Phương pháp điều tra dịch hại trồng nông nghiệp thiên địch chúng, NXB Nông nghiệp Hà Minh Trung et al (1998) Ứng dụng phương pháp vi ghép đỉnh sinh trưởng để làm bệnh số giống có múi,, Kết nghiên cứu khoa học Viện Bảo vệ thực vật Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Lê Mai Nhất (2014), Nghiên cứu bệnh vàng greening hại ăn có múi số tỉnh phía bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống Đỗ Duy Hưng (2015), Nghiên cứu bệnh vàng greening quýt xã Gia Luận - Cát Hải - Hải Phòng biện pháp phòng trừ Thế, T T (1980) Tài nguyên ăn nước ta Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp-Hà Nội 9.Trình, T T (1995) Tìm hiểu loại ăn trái có triển vọng xuất Tài liệu tiếng Anh Arredondo Valdés, R., et al (2016) "A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus." Canadian journal of microbiology 62(10): 803-811 Ashmore, S (2014) Wild citrus in Oceania: harnessing the diversity XXIX International Horticultural Congress on Horticulture: Sustaining Lives, Livelihoods and Landscapes (IHC2014): IV 1101 Badaracco, A., et al (2017) "Citrus Huanglongbing in Argentina: detection and phylogenetic studies of Candidatus Liberibacter asiaticus." Australasian Plant Pathology 46(2): 171-175 Berk, Z (2016) Citrus fruit processing, Academic press Bové, J M (2006) "Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus." Journal of plant pathology: 7-37 Chen, M., et al (1971) "Mycoplasmalike bodies associated with likubindiseased Ponkan citrus." Phytopathology Ding, Y., et al (2015) "Network analysis of postharvest senescence process in citrus fruits revealed by transcriptomic and metabolomic profiling." Plant Physiology 168(1): 357-376 Fujikawa, T and T Iwanami (2012) "Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium “Candidatus Liberibacter asiaticus” by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers." Molecular and cellular probes 26(5): 194-197 Garnsey, S., , Barrett, HC and D Hutchson (1987) "Identification of citrus tristeza virus resistance in citrus relatives and its potential applications." Phytophylactica 19(2): 187-192 10.Ghorbel, R., et al (2001) "Transgenic citrus plants expressing the Citrus tristeza virus p23 protein exhibit viral‐like symptoms." Molecular plant pathology 2(1): 27-36 11.Harper, S., et al (2008) "First report of Citrus leaf blotch virus in New Zealand." Plant disease 92(10): 1470-1470 12.Hibino, H., et al (1985) "Rice grassy stunt virus: a planthopper-borne circular filament." Phytopathology 75(8): 894-899 13.Jagoueix, S., et al (1996) "PCR detection of the two «Candidatus» liberobacter species associated with greening disease of citrus." Molecular and cellular probes 10(1): 43-50 14.Kim, J.-s and N Wang (2009) "Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR." BMC Research Notes 2(1): 1-4 15.Lau, H Y., et al (2011) "Cloning, expression and purification of a partial outer membrane protein (Omp) from Candidatus Liberibacter asiaticus causing greening disease of citrus." J Trop Agric and Fd Sc 39(2): 179189 16.Lee, R., et al (1994) "The citrus tristeza virus: an introduction to current priorities, with special reference to the worsening situation in Central America and the Caribbean." 17.Lu, L., et al (2013) "Rhodosporidium paludigenum induces resistance and defense-related responses against Penicillium digitatum in citrus fruit." Postharvest Biology and Technology 85: 196-202 18.Moreno, P., et al (2008) "Citrus tristeza virus: a pathogen that changed the course of the citrus industry." Molecular plant pathology 9(2): 251-268 19.Nehela, Y and N Killiny (2020) "Revisiting the Complex Pathosystem of Huanglongbing: Deciphering the Role of Citrus Metabolites in Symptom Development." Metabolites 10(10): 409 20.Nikolaeva, O V., et al (1997) "Modulation of the antigenic reactivity of the citrus tristeza virus coat protein." Journal of immunological methods 206(12): 97-105 21.Roistacher, C and J Dodds (1993) Failure of 100 mild Citrus tristeza virus isolates from California to cross protect against a challenge by severe sweet orange stem pitting isolates International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010) 22.Sankaran, S., et al (2010) "A review of advanced techniques for detecting plant diseases." Computers and Electronics in Agriculture 72(1): 1-13 23.Saponari, M., et al (1999) "In vitro propagation of Prunus mahaleb and its sanitation from Prune dwarf virus." Advances in horticultural science: 56-60 24.Shokrollah, H., et al (2010) "Ultrastructures of Candidatus Liberibacter asiaticus and its damage in huanglongbing (HLB) infected citrus." African Journal of Biotechnology 9(36) 25.Spiegel-Roy, P and E E Goldschmidt (1996) The biology of citrus, Cambridge University Press 26.Su, H (2008) "Production and Cultivation of Virus-free Citrus Saplings for Citrus Rehabilitation in Taiwan Asia-Pacific Consortium on Agricultural Biotechnology, New Delhi and Asia-Pacific Association of Agricultural Research Institutions, Bangkok P 51+ ix." Cover page: Top row (left to right): HLB-diseased Tankan fruits showing atrophy with green-coloring (left) and healthy normal fruit (right) Different stages of STG showing rootstock seedlings and new sprouts regenerated from the grafted shoot-tip 27.Tanaka, T (1954) "Species problem in Citrus." 28.Vela, C., et al (1986) "Production and characterization of monoclonal antibodies specific for citrus tristeza virus and their use for diagnosis." Journal of General Virology 67(1): 91-96 29.Wallace, J D (1978) "Virtues and vices." 30.Warnert, J (2012) "Asian citrus psyllid and huanglongbing disease threaten California citrus." California Agriculture 66(4): 127-130 31.Zemzami, M., et al (1999) "Biological and serological characterization of citrus tristeza virus (CTV) isolates from Morocco." Phytopathologia Mediterranea: 95-100 PHỤ LỤC STT Kí hiệu Thỏ: HLB-N Thỏ: HLB-C Thỏ: CTV Thỏ: HLB-N Thỏ HLB-C Thỏ: CTV Thỏ: HLB-N Thỏ HLB-C Thỏ: CTV 10 Thỏ: HLB-N 11 Thỏ HLB-C 12 Thỏ: CTV Lần tiêm Ngày tiêm Vị trí tiêm 4/4/2021 Đùi trái, phải sau 4/4/2021 Đùi trái, phải sau 4/4/2021 Đùi trái, phải sau 11/4/2021 Đùi trái, phải sau 11/4/2021 Đùi trái, phải sau 11/4/2021 Đùi trái, phải sau 18/4/2021 Đùi trái, phải sau 18/4/2021 Đùi trái, phải sau 18/4/2021 Đùi trái, phải sau 27/4/2021 Đùi trái, phải sau 27/4/2021 Đùi trái, phải sau 27/4/2021 Đùi trái, phải sau Hình 1P Lịch tiêm thỏ Ghi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi Tiêm 0,4ml/đùi complex complex complex incomplex incomplex incomplex incomplex incomplex incomplex incomplex incomplex incomplex