Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy lát mỏng trong nhân nhanh cây hoàng tinh hoa đỏ (polygonatum kingianum coll et hemsl)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NI CẤY LÁT MỎNG TRONG NHÂN NHANH CÂY HỒNG TINH HOA ĐỎ (POLYGONATUM KINGIANUM COLL ET HEMSL) Sinh viên : PHẠM THỊ THÙY DƯƠNG Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa : K62 Người hướng dẫn : ThS VŨ HOÀI SÂM TS BÙI THỊ THU HƯƠNG Hà nội - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng để bảo vệ báo cáo Tơi xin cam đoan, giúp đỡ cho khóa luận cảm ơn thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2021 Sinh viên Phạm Thị Thùy Dương i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, ngồi cố gắng nỗ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, cán kỹ thuật, bạn bè người thân Trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban quản lý Học Viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện cho tơi thực khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học nhiệt tình dạy bảo tơi suốt năm học vừa qua Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Thị Thu Hương ThS Vũ Hoài Sâm người hướng dẫn, dành nhiều thời gian, tâm huyết, nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hồn thành tốt khóa luận Đồng thời tơi xin gửi lời cảm ơn tới cán Trung tâm nghiên cứu nguồn gen giống dược liệu Quốc gia – Viện dược liệu, đặc biệt chị Nguyễn Thị Xuyên giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh ủng hộ động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu đề tài Báo cáo không tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp q báu Q Thầy Cơ để báo cáo hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2021 Người thực Phạm Thị Thùy Dương ii MỤC LỤC   LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii KÍ HIỆU VIẾT TẮT viii TÓM TẮT BÁO CÁO ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Hoàng tinh hoa đỏ 2.1.1 Nguồn gốc phân bố 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm thực vật học 2.1.4 Thành phần hóa học 2.1.5 Tác dụng dược lí 2.1.6 Công dụng 2.2 Giới thiệu sơ lược kỹ thuật nuôi cấylớp mỏng tế bào 2.2.1 Khái niệm lớp mỏng tế bào 2.2.2 Ưu điểm nuôi cấy lớp mỏng tế bào 2.2.3 Các yếu tổ ảnh hưởng đến khả phát sinh hình thái 2.2.4 Quá trình tái sinh in vitro 12 2.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống Hoàng tinh hoa đỏ 13 2.3.1 Nhân giống theo phương pháp truyền thống 13 2.3.2 Nhân giống theo phương pháp nuôi cấy mô invitro 14 iii 2.4 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro thông qua mô sẹo 14 2.4.1 Trên họ Asparagaceae 14 2.4.2 Trên chi Polygonatum 16 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Vật liệu nghiên cứu: 19 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST điều kiện chiếu sáng đến khả tạo mô sẹo từ lát mỏng thân rễ in vitro 19 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng CĐHST đến khả tái sinh chồi từ mơ sẹo lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ 21 3.4 Điều kiện nghiên cứu 22 3.5 Phương pháp đánh giá xử lí số liệu 23 PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng CĐHST điều kiện chiếu sáng đến khả tạo mô sẹo từ lát cắt mỏng thân rễ thân rễ in vitro 24 4.1.1 Ảnh hưởng 2,4 – D đến khả tạo mô sẹo từ lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ 24 4.1.2 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo mô sẹo từ lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ 26 4.1.3 Ảnh hưởng α- NAA đến khả tạo mơ sẹo từ lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ 28 4.1.4 Ảnh hưởng TDZ đến khả tạo mô sẹo từ lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ 31 4.1.5 Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hịa sinh trưởng đến khả hình thành mơ sẹo từ lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ 34 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng CĐHST đến khả tái sinh chồi từ mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ 36 iv 4.2.1 Ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi từ mơ sẹo lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ 36 4.2.2 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi từ mơ sẹo lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ 38 4.2.3 Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ 40 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LUC 48 v DANH MỤC HÌNH Hình hình ảnh Hồng tinh hoa đỏ Error! Bookmark not defined Hình Mảnh lát cắt thân rễ Hồng tinh hoa đỏ mơi trường MS có bổ sung 2,4D tối hồn tồn điều kiện chiếu sáng (sau tuần nuôi cấy) 25 Hình Mảnh lát cắt thân rễ Hồng tinh hoa đỏ mơi trường MS có bổ sung IBA tối hoàn toàn điều kiện chiếu sáng (sau tuần nuôi cấy) 28 Hình Mảnh lát cắt thân rễ hoàng tinh hoa đỏ môi trường nuôi cấy bổ sung NAA điều kiện tối hoàn toàn (A-D) điều kiện chiếu sang 14h/ ngày (E-H) (sau tuần nuôi cấy) 30 Hình 4 Mảnh lát cắt thân rễ hồng tinh hoa đỏ ni cấy mơi trường có bổ sung TDZ nồng độ từ 0-2mg/l điều kiện tối hồn tồn (sau tuần ni cấy) 33 Hình Mảnh lát cắt thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ bổ sung α-NAA với 2,4D TDZ 35 Hình Hình ảnh quan sát kính hiển vi quang học mẫu mơ sẹo thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ 36 Hình Tái sinh chồi từ mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ môi trường bổ sung KI (sau tuần nuôi cấy) 38 Hình Tái sinh chồi từ mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ môi trường MS bổ sung BAP (sau tuần ni cấy) 40 Hình Tái sinh chồi từ mô sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ mơi trường MS bổ sung mg/l NAA BAP Kinitin (sau tuần nuôi cấy) 42 vi DANH MỤC BẢNG Bảng Ảnh hưởng 2,4D đến khả hình thành mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần nuôi cấy) 24 Bảng Ảnh hưởng IBA đến khả hình thành mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần nuôi cấy) 26 Bảng Ảnh hưởng α-NAA đến khả hình thành mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần ni cấy) 28 Bảng 4 Ảnh hưởng TDZ đến khả hình thành mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần ni cấy) 31 Bảng Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần nuôi cấy) 34 Bảng Ảnh hưởng Kinetin tới khả tái sinh chồi từ mơ sẹo Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần theo dõi) 37 Bảng Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi mô sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần ni cấy) 39 Bảng Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần ni cấy) 41 vii KÍ HIỆU VIẾT TẮT BAP CT 6-Benzyl amino purine Công thức TCL Thin Cell Layer CV% Sai số thí nghiệm 2,4-D 2,4-Dichlorphenoxy acetic acid ĐC Đối chứng IAA Indole acetic acid IBA Indole – – butyric acid Kin Kinetin LSD0.05 MS α-NAA TDZ CS Độ lệch chuẩn mức ý nghĩa 5% Môi trường Murashige Skoog – 1962 α-Naphthalene acetic acid Thidiazuron Cộng RNA Acid ribonucleic DNA Acid deoxyribonucleix viii TÓM TẮT BÁO CÁO Nghiên cứu nhằm xác định ảnh hưởng phytohormone đến khả tái sinh chồi in vitro từ lát cắt mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll et Hemsl) để chọn loại nồng độ phytohormone thích hợp nhất, nhằm nhân nhanh Hồng tinh hoa đỏ thông qua đường tái sinh gián tiếp Nghiên cứu cho thấy 2,4 D IBA khơng có khả cảm ứng tạo mơ sẹo điều kiện chiếu sáng 14 h/ngày, α-NAA TDZ cho kết thấp (< 30%); điều kiện tối hồn tồn mơi trường bổ sung 2,4 D, IBA, α-NAA TDZ đơn chất cho tỷ lệ hình thành mơ sẹo thấp (< 50%); kết hợp α-NAA 2,0 mg/l 2,4 D 2,0 mg/l cho tỷ lệ hình thành mô sẹo tốt nhất, đạt 64% Kết thu cho thấy, giai đoạn nuôi cấy 82,22% mẫu phát sinh chồi sử dụng kết hợp 2,0 mg/l BAP 1,0 mg/l α-NAA môi trường nuôi cấy, cho số chồi đạt 6,16 chồi/mẫu ix kích thích khối mơ sẹo phát triển mạnh (Hình 4.8), có xu hướng tăng khả phát sinh chồi thời gian nuôi cấy kéo dài Hình Tái sinh chồi từ mơ sẹo lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ mơi trường MS bổ sung BAP (sau tuần nuôi cấy) Qua hình 4.8, tcho thấy đặc điểm mẫu ni cấy có phân hóa chồi rõ rệt chiều cao chồi thấp Như vậy, nồng độ mg/l BAP tốt để cảm ứng tạo mô sẹo từ lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ, cho tỷ lệ tạo chồi đạt 64,44% với số chồi/ mẫu 3,29 Theo kết nghiên cứu Thenmozhi M et al (2018), BAP chất thích hợp để tái sinh chồi từ loài thuộc chi Polygonatum, với mức nồng độ thích hợp 1,5 mg/l 4.2.3 Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ Tiếp tục thí nghiệm với tổ hợp chất điều hồ sinh trưởng khác để khảo sát khả tái sinh chồi từ mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ nhằm xác định loại chất ĐHST thích hợp Thông thường, Auxin kết hợp chặt chẽ với thành phần khác môi trường dinh dưỡng để kích thích tăng trưởng mơ sẹo, huyền phù tế bào điều hịa 40 phát sinh hình thái, đặc biệt phối hợp sử dụng với cytokinin Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu kết hợp auxin cytokinin vào môi trường nuôi cấy cho hiệu tái sinh chồi in vitro cao so với bổ sung riêng rẽ Q trình phân hóa chồi phụ thuộc tỷ lệ auxin/ cytokinin, tỷ lệ cao kích thích hình thành rễ, ngược lại tỷ lệ thấp kích thích tạo chồi Qadir et al (2020) nghiên cứu tạo mô sẹo từ mầm hạt Polygonatum verticillatum kết cho thấy kết hợp auxin cytokinin nồng độ mg/L Kin + mg/L IAA tốt nhất, sau 33 ngày mô sẹo xuất tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo đạt 60% Mô sẹo thu từ mẫu hạt nảy mầm tái sinh thân rễ nuôi cấy phụ môi trường MS bổ sung BAP kết hợp với αNAA Từ tảng trên, chúng tơi tiến hành bố trí thêm thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng auxin cytokinin để tăng hiệu tạo chồi Ở sử dụng kết hợp α-NAA BAP với Kinetinvớicác nồng độ tốt từ thí nghiệm Kết thu Bảng 4.8 đây: Bảng Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ (sau tuần ni cấy) Nồng Nồng độ độ BAP độ Kin α-NAA (mg/L) (mg/L) (mg/L) Nồng CT Thời gian chồi bắt đầu xuất (tuần) Tỷ lệ mẫu hình thành chồi (%) Số chồi/mẫu (chồi) CT1 0 20,00d 1,22d CT2 1,0 1,0 64,44c 3,87c CT3 2,0 1,0 82,22a 6,16a CT4 1,0 1,0 71,11b 4,42b CV% 5,6 2,1 LSD 6,28 0,15 CT1: công thức đối chứng ; ký hiệu chữ a, b, c thể khác có ý nghĩa giá trị cột mức α = 0,5 kiểm định Duncan’s test 41 Bảng kết 4.8 cho thấy, Khi bổ sung α-NAA vào môi trường ni cấy có chứa chất thuộc nhóm cytokinin (BAP, Kin) kích thích mạnh mẽ phát sinh chồi sau tuần nuôi cấy Tỷ lệ mẫu cấy phát sinh chồi số chồi/mẫu đạt cao thu công thức CT3 công thức chứa tổ hợp BAP 2,0 mg/l 1,0 mg/l với số tương ứng 82,22% 6,16 chồi Tuy vậy, kết hợp 1,0 mg/l NAA với mức nồng độ 1,0 mg/l Kinetin BAP cơng thức kết hợp với Kinetin lại tỏ hiệu so công thức kết hợp với BAP trình phát sinh chồi từ mơ sẹo lớp mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ Hình thái chồi cơng thức mơi trường có bổ sung kinetin tỏ vượt trội so với cơng thức mơi trường có bổ sung BAP, đầu xuất chồi phân tách cụm rõ (Hình 4.9) Hình Tái sinh chồi từ mơ sẹo lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ môi trường MS bổ sung tổ hợpNAA vớiBAP với Kinitin (sau tuần nuôi cấy) Như vậy, tỷ lệ tái sinh chồi số chồi/mẫu đạt cao mô sẹo từ lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ ni cấy mơi trường có bổ sung tổ hợp NAA (1,0 mg/l) với BAP (2 mg/l), tương ứng đạt 82,22% 6,16 chồi sau tuần nuôi cấy Qadir et al (2020) công bố kết tái sinh chồi từ mô sẹo tốt kết hợp BAP α-NAA Polygonatum verticillatum 42 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 2,4D sử dụng nồng độ từ 0mg/l đến 4mg/l điều kiện chiếu sáng 14h/ngày khơng có khả tạo cảm ứng mơ sẹo mẫu thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ Trong điều kiện tối hoàn toàn nồng độ 2mg/l 2,4D cho khả hình thành mơ sẹo tốt với tỉ lệ 32%, mẫu mơ sẹo có màu trắng IBA nồng độ mg/l điều kiện ni cấy tối hồn tồn cho tỉ lệ tạo mơ sẹo 10,67% từ lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ Nuôi cấy điều kiện chiếu sáng 14h/ngày mẫu cấy khơng cảm ứng hình thành mơ sẹo NAA nồng độ 2mg/l với tỉ lệ mẫu cấy cảm ứng tạo mô sẹo cao nhất, đạt 41,33%, mơ sẹo có màu vàng ni cấy điều kiện tối hoàn toàn đạt cao với tỉ lệ 22,67% với mẫu mơ sẹo có màu vàng xanh nuôi cấy điều kiện chiếu sáng 14h/ngày TDZ nồng độ mg/l điều kiện tối hồn tồn cho khả tạo mơ sẹo cao từ lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ với tỉ lệ 28% mơ sẹo khối có màu vàng; Còn điều kiện chiếu sáng 14h/ngày, tỉ lệ tạo cảm ứng mô sẹo tốt 20%.Tỉ lệ tạo mơ sẹo từ lát mỏng thân rễ Hồng tinh hoa đỏ cao nuôi cấy môi trường MS kết hợp 2mg/l NAA 2mg/l 2,4D đạt tỉ lệ 64%, khối mơ sẹo có màu xanh vàng, xốp Kinetin nồng độ 1mg/l cho tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo lát mỏng thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ cao nhất, đạt 62,22% với số chồi/mẫu 3,56, sau tuần nuôi cấy BAP nồng độ mg/l BAP khiến 64,44% mẫu mô sẹo tái sinh chồi sau tuần nuôi cấy số chồi trung bình mẫu cao sử dụng 1mg/l BAP cho kết 3,29 Khi sử dụng kết hợp NAA BAP KI, kết cho thấy kết hợp 1mg/l NAA 2mg/l BAP cho khả tái sinh chồi từ mơ sẹo thân rễ Hồng tinh hoa đỏ tốt với tỉ lệ 82,22% số chồi trung bình mẫu 6,16 5.2 Kiến nghị - Sử dụng thêm chất điều tiết sinh trưởng khác để nghiên cứu phản ứng mô thân rễ Hồng tinh hoa đỏ, nhằm xây dựng quy trình ni cấy mơ phục vụ sản xuất giống Hồng tinh hoa đỏ chất lượng cao qui trình tái sinh chồi từ mô sẹo 43 thân rễ, nhằm phục vụ trình nghiên cứu bản, chọn tạo giống có suất, chất lượng cao - Tiến hành đánh giá sinh trưởng tiến hành nghiên cứu thí nghiệm rễ để đưa vào sản xuất giống, bảo tồn phát triển giống Hoàng tinh hoa đỏ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 1138 trang Đỗ Tất Lợi (2006) Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học, tr.910 Nguyễn Thị Phương Thảo (2019) Đặc điểm công dụng Hồng tinh hoa đỏ Trung tâm Nghiên cứu ni trồng dược liệu quốc gia – Vietfarm La Việt Hồng, Trần Hồng Thu, Phạm Thị Quy, Đinh Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Ngọc Khánh (2019) Xác định thị phân tử tái sinh chồi Hoàng tinh hoa đỏ Polygonatum kingianum coll et Hemsl Tạp chí khoa học công nghệ đại học Thái Nguyên, T164, S.04 Nguyễn Trần Anh Thư (2021) Hoàng tinh: vị thuốc bị lãng quên Công ty TNHH Youmed Việt Nam Hoàng Lê Thu Hà (2017) Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Loài Hoàng Tinh Đỏ (Polygonatum Kingianum Coll Et Hemsl) Tại Bắc Quang, Hà Giang Và Nhân Giống Invitro Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 60.62.02.01 Vũ Thị Hiền (2018) Nghiên cứu trình tái sinh nhân giống invitro sâm ngọc linh kĩ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào Học viện khoa học công nghệ, luận văn tiến sĩ Trần Thanh Vân (1980) Kiểm sốt phát sinh hình thái yếu tố ứng dụng vốn có ngoại sinh lớp tế bào mỏng, Tạp chí Quốc tế Tế bào học, 1980, 32, 291-311 Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo dục, Hà Nội, 1999, 5-33 10 Dương Tấn Nhựt (2006) Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào nghiên cứu tái sinh, nhân giống chuyển gene thực vật, NXB Nơng Nghiệp 11 Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật, Nxb Giáo dục, Hà nội 253 trang 12 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009) Công nghệ sinh học tập 2- Công nghệ tế bào, Nxb giáo dục 187 trang Tài liệu tiếng anh 13 Ruoshi Li, Aien Tao, Runmei Yang, Min Fan, Xiaocan Zhang, Zefei Du, Feineng Shang, Conglong Xia, Baozhong Duan (2020) Structural characterization, hypoglycemic effects and antidiabetic mechanism of a novel polysaccharides from Polygonatum kingianum Coll et Hemsl Biomedicine and Pharmacotherapy, volume 131, 110687 14 Xiaowei Cui, Shiyuan Wang, Hui Cao, Hong Guo, Yujuan Li, Mengmeng Zheng, Xiaozhi Xi, Chunchao Han (2018) A Review: The Bioactivities and Pharmacological Applications of Polygonatum sibiricum polysaccharides NCBI 23(5) PMC6099637 15 Min Wan Park, Shi Hyun Ryu, Y Young Lee, Jae-Mo Song, Jin Ho Kim, Young-Hee Ahn, Kee Hwa Bae (2018) Mô sẹo induction and in vitro plant regeneration of Polygonatum stenophyllum Maxim J Plant Biotechnol, ) 45:266–272 16 Ning Hui; Yang PeiJun (2009) Tissue culture and rapid propagation of Polygonatum odoratum (Mill.) Druce Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, Vol.29 No.11 pp.2339-2344 ref.15 45 17 Y He, Zhu YQ, Xiao B, Fu SH, Si JP (2019) Study on tissue culture system of Polygonatum cyrtonema China Journal of Chinese Materia Medica, 44 (10): 2032-2037 18 T Tiwari, P Chaturvedi (2018) Mô sẹo induction in Polygonatum verticillatum (L.) All.: An Astavarga medicinal herb Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 7(2): 26712674 19 Yang Yu-hong (2011) Effect of Plant Growth Regulator on Mô sẹo Induction of Polygonatum sibiricum 20 Skoog, F and E.O Miller (1957) Chemical regularion of growth and organ formation in plant fissue cultured In vitro, Exp Biol., v.11, p.118-131, 1957 21 J Qadir, Seema Singh, Sumeet Kour1, Zahoor A Kaloo, and Bashir A Ganai (2020) In vitro Propagation of Polygonatum verticillatum All A Threatened Medicinal Herb through Seed Explant, Journal of Scientific Research, Volume 64 22 Li Xing Cong, Chong-Ren Yang, Makoto Ichikawa, Hiromichi Matsuura, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki (1992) Saponin steroid từ Polygonatum kingianum Phytochemistry, Volume 31, issure 10, page 3559 – 3563 23 Szybka – Hrynkiewicz , Zbigniew Janeczko, Katedra Farmakognozji, Collegium Medicum, Uniwersytet jagielloński, Kraków (2004) Densitometric analysis of diosgenin in extracts from mô sẹo tissue of Polygonatum verticillatum (L.) All Prace Eksperymentalne, (65) 93-99 24 Pei Li-xin; JI Bao-yu; Chen Sui-qing; Zhang Cai-juan; Dong Cheng-ming (2017) The effect of different explants of Polygonatum sibiricum on mô sẹo induction Henan University of Traditional Chinese Medicine 25 Yoon , Eui – soo, Park Yong-Eui (2002) Micropropagation and Mass Production of Adventitious Roots of Polygonatum odoratum via the Culture of Seedling Explnnts Journal of Plant Biotechnology, volume 4, issue 1, page 33-37, 1229-2818 (pISSN) 26 P Veli-Pekka et K Anneli (1999) The Effect of Light and Auxins on the Regeneration of Lily (Lilium Regale Wil.) Cells by Somatic Embryogenesis and Organogenesis International Journal of plant sciences, volume 160, number 27 Azad, MAK & Amin, MN (2017) Regeneration of Asparagus officinalis L Through embryonic mô sẹo Biotechnology and plant tissue culture , 27 (1), 21–31 28 Sadegh Mohajer, Rosna Mat Taha, Arash Khorasani et Jamilah Syafawati Yaacob (2012) Induction of different mô sẹo types and somatic embryogenesis in different cultures of Sainfoin ('Onobrychis sativa') Australian Journal of Crop Science, volume 6, page 13051313, 1835-2693 29 Ahmed A Barakat (2021) In vitro propagation and phylogeny of Dracaena draco Egyptian Academic Journal of Biological Sciences, H Botany, volume 12, issure 1, page 87-105 30 A V Deepa, M Anju et T Dennis Thomas (2018) Applications of TDZ in medicinal plant tissue culture Thidiazuron: From Urea Derivative to Plant Growth Regulator, page 297-316 31 T Ivanova , D Dimitrova, G Angelov, Ch Gussev, Y Bosseva and T Stoeva (2013) Mô sẹo Cultures and indirect regeneration of Rucus Hypoglossum invitro Bulgarian Journal of Agricultural Science, 19 (2) 2013, 49–51 46 32 Thenmozhi M and Hiranmai Yadav R (2018) IN VITRO PROPAGATION OF AN ENDANGERED MEDICINAL PLANT ASPARAGUS RACEMOSUS An International Refereed, Peer Reviewed & Indexed Quarterly Journal in Science, Agriculture & Engineering, Vol-4 Issue-1, IJARIIE-ISSN(O)-2395-4396 33 Thomas Efferth (2019) Biotechnology Applications of Plant Mô sẹo Cultures Engineering, volume 5, issure 1, Pages 50-59 34 Qi Zhao, Chuanfang Wu, Wenguo Wang, Shu Yuan, Jinku Bao & Fang Chen (2009) In vitro plantlet regeneration system from rhizomes and mannose-binding lectin analysis of Polygonatum cyrtonema Hua Plant Cell Tiss Organ Cult 99, 269–275 35 Martyn Rix Keith Rushforth (2016) Polygonatum kingianum Curtis's Botanical, volume 33, No.2, pp 142-150 36 Toshio Murashige (1980) Plant Growth Substances in Commercial Uses of Tissue Culture Các chất tăng trưởng thực vật, pp 426-434 37 J Ouyang, X Wang, B Zhao, Y Wang (2003) Light intensity and spectral quality influencing the callus growth of Cistanche deserticola and biosythesis of phenylethanoid glycosides, Plant Science, 2003, 165, 657-661 38 J.J Zhong, T Seki, S.I Kinoshita, T Yoshida (1991) Effect of light irradiace on anthocyanin production by suspended culure of Perilla frutescens, Biotechnology and Bioengineering, 1991, 38, 653-658 39 R.E Kendrick, G.H.M Kronenberg (1994) Photomorphogenensis in plants, Dordrech: Kluwer Academic Publishers, 1994 40 S.K Jaiswal, S.S Bhojwaini, S.P Bhatnagar (1987) In vitro regeneration potentialities of sesdling explants of Brassica carinata A Braun, Phytomorphology, 1987, 37, 235-241 41 P.C Debergh, C.J Aitken, D Cohen, B Grout, S Von Amold, R Zimmerman, M Ziv (1992) Reconsideration of the term ‘vitrification’ as used in micropropagation, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1992, 30, 135-140 42 S.M Kaeppler, H.F Kaeppler, Y Rhee (2000) Epigenetic aspects of somaclonal variotion in plants, Plant Molecular Biology, 2000, 43, 179-188 43 R Schaffer, N Ramsey, A Samach, S Corden, J Putterill, I.A Carre, G Coupland (1998) The late elongated hypocotyl mutation of Arabidopsis disrupts circadian rhythms and the photoperiodic control of flowering, Cell, 1998, 93(7), 1219-1229 44 D Davis, J Allen, R.M Consenza (1988) Segmenting local residents by their attitudes, interested and opinions toward tourism, Journal of Travel Research, 1988, 27(2), 2-8 47 PHỤ LUC Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo callus BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE KIN 13/ 8/21 13:17 :PAGE anh huong cua 2,4D den kha nang tao callus VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 2244.27 561.067 526.00 0.000 * RESIDUAL 10 10.6666 1.06666 * TOTAL (CORRECTED) 14 2254.93 161.067 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KIN 13/ 8/21 13:17 :PAGE anh huong cua 2,4D den kha nang tao callus MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TL 0.000000 8.00000 32.0000 29.3333 16.0000 SE(N= 3) 0.596283 5%LSD 10DF 1.87891 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KIN 13/ 8/21 13:17 :PAGE anh huong cua 2,4D den kha nang tao callus F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TL GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 17.067 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 12.691 1.0328 6.1 0.0000 | | | | Thí nghiệm 2: ảnh hưởng IBA đến khả tạo mơ sẹo Hồng tinh hoa đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTC FILE IBATOI 7/ 9/21 14:10 :PAGE ti le tao mo seo bo sung iba dk toi hoan toan VARIATE V003 TLTC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NL 6.40000 3.20000 1.71 0.240 CT 241.067 60.2667 32.29 0.000 * RESIDUAL 14.9333 1.86666 * TOTAL (CORRECTED) 14 262.400 18.7429 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IBATOI 7/ 9/21 14:10 :PAGE ti le tao mo seo bo sung iba dk toi hoan toan MEANS FOR EFFECT NL NL NOS TLTC 4.00000 48 5 3.20000 2.40000 SE(N= 5) 0.611009 5%LSD 8DF 1.99244 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TLTC 0.000000 1.33333 10.6667 4.00000 0.000000 SE(N= 3) 0.788809 5%LSD 8DF 2.57223 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IBATOI 7/ 9/21 14:10 :PAGE ti le tao mo seo bo sung iba dk toi hoan toan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLTC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 3.2000 STANDARD DEVIATION C OF V |NL SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 4.3293 1.3663 42.7 0.2397 |CT | | | 0.0001 | | | | Thí nghiệm 3: ảnh hưởng CĐHST NAA đến khả hình thành mơ sẹo Hoàng tinh hoa đỏ Điều kiện tối hoàn toàn BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL TOI FILE KIN 15/ 8/21 14:53 :PAGE anh huong cua NAA den kha nang tao callus VARIATE V003 TL TOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 3748.27 937.067 878.53 0.000 * RESIDUAL 10 10.6664 1.06664 * TOTAL (CORRECTED) 14 3758.93 268.495 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL SANG FILE KIN 15/ 8/21 14:53 :PAGE anh huong cua NAA den kha nang tao callus VARIATE V004 TL SANG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 964.267 241.067 113.00 0.000 * RESIDUAL 10 21.3333 2.13333 * TOTAL (CORRECTED) 14 985.600 70.4000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KIN 15/ 8/21 14:53 :PAGE anh huong cua NAA den kha nang tao callus MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TL TOI TL SANG 49 3 3 0.000000 8.00000 41.3333 36.0000 20.0000 0.000000 12.0000 22.6667 20.0000 17.3333 SE(N= 3) 0.596276 0.843273 5%LSD 10DF 1.87889 2.65718 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KIN 15/ 8/21 14:53 :PAGE anh huong cua NAA den kha nang tao callus F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TL TOI TL SANG GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 21.067 15 14.400 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 16.386 1.0328 4.9 0.0000 8.3905 1.4606 10.1 0.0000 | | | | Thí nghiệm 4: ảnh hưởng CĐHST TDZ đến khả hình thành mơ sẹo Hồng tinh hoa đỏ Tối hồn toàn Ảnh hưởng TDZ đến khả tao callus BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL TOI FILE KIN 16/ 8/21 17:58 :PAGE VARIATE V003 TL TOI LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 1329.07 332.267 311.50 0.000 * RESIDUAL 10 10.6667 1.06667 * TOTAL (CORRECTED) 14 1339.73 95.6952 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL SANG FILE KIN 16/ 8/21 17:58 :PAGE VARIATE V004 TL SANG SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 1073.07 268.267 251.50 0.000 * RESIDUAL 10 10.6666 1.06666 * TOTAL (CORRECTED) 14 1083.73 77.4095 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KIN 16/ 8/21 17:58 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TL TOI TL SANG 0.000000 0.000000 21.3333 17.3333 28.0000 20.0000 16.0000 12.0000 12.0000 0.000000 SE(N= 3) 0.596287 0.596284 5%LSD 10DF 1.87892 1.87891 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KIN 16/ 8/21 17:58 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN (N= 15) STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | 50 | | TL TOI TL SANG NO OBS 15 15.467 15 9.8667 BASED ON TOTAL SS 9.7824 8.7983 BASED ON RESID SS 1.0328 1.0328 % | | 6.7 0.0000 10.5 0.0000 | | Thí nghiệm 5: ảnh hưởng tổ hợp CĐHST đến khả hình thành mơ sẹo thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ Ảnh hưởng tổ hợp CĐHST đến khả tạo callus thân rễ HTHĐ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL TOI FILE KIN 27/ 8/21 15:49 :PAGE anh huong cua to hop CÐHST den kha nang tao callus VARIATE V003 TL TOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 2062.93 515.733 161.17 0.000 * RESIDUAL 10 32.0000 3.20000 * TOTAL (CORRECTED) 14 2094.93 149.638 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KIN 27/ 8/21 15:49 :PAGE anh huong cua to hop CÐHST den kha nang tao callus MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TL TOI 42.6667 64.0000 46.6667 36.0000 29.3333 SE(N= 3) 1.03280 5%LSD 10DF 3.25438 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KIN 27/ 8/21 15:49 :PAGE anh huong cua to hop CÐHST den kha nang tao callus F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TL TOI GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 43.733 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 12.233 1.7889 4.1 0.0000 | | | | Thí nghiệm 6: ảnh hưởng KI đến khả tái sinh chồi mô sẹo Hoàng tinh hoa đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TAI SINH FILE KIN 2/ 9/21 10:29 :PAGE anh huong cua kin den kha nang tai sinh choi tu callus VARIATE V003 TAI SINH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 3407.41 851.852 71.88 0.000 * RESIDUAL 10 118.518 11.8518 * TOTAL (CORRECTED) 14 3525.93 251.852 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CHOI FILE KIN 2/ 9/21 10:29 :PAGE anh huong cua kin den kha nang tai sinh choi tu callus VARIATE V004 SO CHOI 51 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 9.83704 2.45926 377.28 0.000 * RESIDUAL 10 651846E-01 651846E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 9.90222 707302 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KIN 2/ 9/21 10:29 :PAGE anh huong cua kin den kha nang tai sinh choi tu callus MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TAI SINH 20.0000 37.7778 62.2222 57.7778 44.4444 SO CHOI 1.28889 2.57778 3.55556 3.20000 2.04444 SE(N= 3) 1.98761 0.466135E-01 5%LSD 10DF 6.26304 0.146881 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KIN 2/ 9/21 10:29 :PAGE anh huong cua kin den kha nang tai sinh choi tu callus F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TAI SINH SO CHOI GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 44.444 15 2.5333 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 15.870 3.4426 7.7 0.0000 0.84101 0.80737E-01 3.2 0.0000 | | | | Thí nghiệm 7: ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi mô sẹo Hoàng tinh hoa đỏ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TAI SINH FILE KIN 2/ 9/21 10:25 :PAGE anh huong cua BAP den kha nang tai sinh choi tu callus VARIATE V003 TAI SINH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 5600.00 1400.00 94.50 0.000 * RESIDUAL 10 148.148 14.8148 * TOTAL (CORRECTED) 14 5748.15 410.582 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CHOI FILE KIN 2/ 9/21 10:25 :PAGE anh huong cua BAP den kha nang tai sinh choi tu callus VARIATE V004 SO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 7.40563 1.85141 215.47 0.000 * RESIDUAL 10 859260E-01 859260E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 7.49156 535111 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KIN 2/ 9/21 10:25 :PAGE anh huong cua BAP den kha nang tai sinh choi tu callus MEANS FOR EFFECT CT 52 CT NOS 3 3 3 TAI SINH 17.7778 24.4444 57.7778 57.7778 64.4444 SO CHOI 1.20000 2.33333 3.28889 2.84444 2.20000 SE(N= 3) 2.22222 0.535182E-01 5%LSD 10DF 7.00229 0.168638 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KIN 2/ 9/21 10:25 :PAGE anh huong cua BAP den kha nang tai sinh choi tu callus F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TAI SINH SO CHOI GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 44.444 15 2.3733 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 20.263 3.8490 8.7 0.0000 0.73151 0.92696E-01 3.9 0.0000 | | | | Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng tổ hợp auxin cytokin đến khả tái sinh chồi từ callus BALANCED ANOVA FOR VARIATE TAI SINH FILE KIN 2/ 9/21 11:16 :PAGE anh huong cua to hop CDHST den kha nang tai sinh choi tu callus VARIATE V003 TAI SINH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 6707.41 2235.80 201.22 0.000 * RESIDUAL 88.8882 11.1110 * TOTAL (CORRECTED) 11 6796.30 617.845 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CHOI FILE KIN 2/ 9/21 11:16 :PAGE anh huong cua to hop CDHST den kha nang tai sinh choi tu callus VARIATE V004 SO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 37.5922 12.5307 ****** 0.000 * RESIDUAL 533321E-01 666651E-02 * TOTAL (CORRECTED) 11 37.6456 3.42232 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KIN 2/ 9/21 11:16 :PAGE anh huong cua to hop CDHST den kha nang tai sinh choi tu callus MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TAI SINH 20.0000 64.4444 82.2222 71.1111 SO CHOI 1.22222 3.86667 6.15556 4.42222 SE(N= 3) 1.92449 0.471399E-01 5%LSD 8DF 6.27558 0.153718 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KIN 2/ 9/21 11:16 53 :PAGE anh huong cua to hop CDHST den kha nang tai sinh choi tu callus F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SD/MEAN | TAI SINH SO CHOI GRAND MEAN | NO OBS 12 59.444 12 3.9167 STANDARD BASED ON TOTAL SS 24.856 1.8500 DEVIATION C OF V |CT (N= BASED ON % | RESID SS | 3.3333 5.6 0.0000 0.81649E-01 2.1 0.0000 54 | | 12)