Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch và cụm chồi từ chồi măng cây song mật (calamus platyacanthus warb exbecc) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP KHOA LÂM HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO MẪU SẠCH VÀ CỤM CHỒI TỪ CHỒI MĂNG CÂY SONG MẬT (Calamus platyacanthus Warb Ex Becc) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 307 Giáo viên hướng dẫn : ThS Hồ Văn Giảng ThS Vũ Thị Huệ Sinh viên thực : Nguyễn Quang Đàm Khoá học : 2005 - 2009 Hà Nội, 2009 MỞ ĐẦU Nƣớc ta nƣớc lên từ nông nghiệp nhƣng ngày vào thời kỳ cơng nghiệp hố đại hố đất nƣớc, nông nghiệp dần đƣợc thay cơng nghiệp đại Vì ruộng đất nơng dân ngày bị thu hẹp, nơng dân cịn ruộng để sản xuất Để giải công ăn việc làm cho bà nơng dân cịn ruộng đất, nhƣ nơng nhàn nghề phụ nhƣ nghề mây tre đan, làm gốm, làm nón giải pháp tốt Các làng nghề không giúp bà giải công ăn việc làm, tăng thu nhập mà cịn góp phần tích cực vào phát triển kinh tế xã hội chung đất nƣớc Một nghề phụ đƣợc phát triển mạnh mẽ nghề chế biến kinh doanh mặt hàng thủ công mỹ nghệ Các mặt hàng đƣợc dùng nƣớc xuất Một nguồn nguyên liệu để sản xuất mặt hàng thân Song mật Ngày nhu cầu phát triển mặt hàng thủ công mỹ nghệ với nguyên liệu lấy từ thân Song mật ngày nhiều Từ đòi hỏi nguồn nguyên liệu lớn Song mật phục vụ cho sản xuất Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex beec) lồi có giá trị kinh tế cao thân nhẹ, bền, dễ kết hợp với vật liệu khác để sản xuất hàng thủ công mỹ nghệ Tuy nhiên thân song mật có giá trị kinh tế cao nên thƣờng bị khai thác trƣớc hoa kết Mặt khác, hạt Song mật nhanh sức nảy mầm có độ ẩm cao nên thƣờng khó bảo quản Trong thực tế việc nhân giống cách gieo hạt hệ số nhân không đủ để cung cấp cho sản xuất Kết nguồn nguyên liệu Song mật phục vụ sản xuất ngày cạn kiệt dần Trong đại phận nguồn nguyên liệu có đƣợc chủ yếu đƣợc mọc lên từ tự nhiên thu hái từ tất nguồn khác mà chƣa qua khảo nghiệm đƣợc đem gieo trồng Chính nguồn giống khơng đảm bảo chất lƣợng nên việc tạo nguồn giống Song mật với sản lƣợng chất lƣợng cao nhu cầu cấp bách [8] Để trì phát triển nguồn tài nguyên có giá trị việc tạo phƣơng pháp in vitro để đáp ứng nhu cầu phát triển sản xuất hƣớng ƣu tiên đƣợc nhiều ngƣời quan tâm có khả tạo số lƣợng mẫu lớn, bệnh… đáp ứng đƣợc yêu cầu nguyên liệu Song mật cho sản xuất [5] Chính tơi chọn nghiên cứu cho khố luận tốt nghiệp là:”Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu cụm chồi từ chồi măng Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex beec) phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào” Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô - tế bào thực vật Nuôi cấy mô - tế bào thực vật phƣơng pháp nhân giống từ phận mẹ, cách nuôi cấy chúng ống nghiệm điều kiện vơ trùng có mơi trƣờng thích hợp đƣợc kiểm sốt [1] Bộ phận đem nuôi cấy (mẫu) thƣờng nhỏ so với nhân giống truyền thống đƣợc tiến hành không gian nhỏ (bình, phịng…) nên hình thức cịn gọi vi nhân giống (micro propogation) Vì đƣợc thực điều kiện vô trùng ống nghiệm với môi trƣờng dinh dƣỡng phù hợp đƣợc kiểm soát gọi nhân giống ống nghiệm (in vitro) [1] 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Haberlandt (1902) ngƣời đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ơng, tế bào thể sinh vật mang tồn lƣợng thơng tin di truyền cần thiết đủ sinh vật Vì vậy, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Ơng làm thí nghiệm với tế bào khí khổng không thành công Thất bại làm nhà khoa học hết hy vọng xây dựng phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào thời gian dài, nhƣng sau Garrison (1904-1907) thực đƣợc tƣ tuởng Haberlandt Ơng ni đƣợc tế bào thần kinh ếch huyết tƣơng [4] Năm 1922, Robbins học trò Haberlandt Kotte thành công việc nuôi cấy đầu rễ 12 ngày Từ đầu rễ đƣợc sử dụng để ni hồn thiện mơi trƣờng ni cấy Từ năm 30 kỉ trƣớc phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào mang nét nuôi cấy mô tế bào đại không khác nhiều mặt kĩ thuật Trong thời gian Whtite nhà bác học ngƣời Mỹ Gautheret (Pháp) có nhiều đóng góp việc nghiên cứu mơi trƣờng nuôi cấy Nhiều môi trƣờng đến đƣợc sử dụng [4] Từ 1931 phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào coi nhƣ đƣợc thức bắt đầu cơng trình nghiên cứu White với việc nuôi cấy đầu rễ cà chua ông ngƣời mơ phân sinh sinh trƣởng thời gian dài đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng dinh dƣỡng Trong thời gian Gautheret thành công nuôi cấy mô tƣợng tầng tìm đƣợc mơi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp Sau Miller Skoog ni cấy lõi thuốc xác định đƣợc vai trò Kinetin kích thích phát triển mơ [4] Những thí nghiệm mơi trƣờng dinh dƣỡng mơi trƣờng dinh dƣỡng, tính chất vật lí, hóa học điều kiện quan trọng định thành công môi trƣờng nuôi cấy mô, quan tế bào Những thành phần bắt buộc mơi trƣờng gồm chất khống từ muối khác nguyên tố đa lƣợng vi lƣợng, thành phần hidrocacbon dinh dƣỡng chất điều hòa sinh trƣởng [4] Cũng từ năm 30 kỉ trƣớc nuôi cấy mô - tế bào phát triển thành hƣớng nhƣ nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô quan tách rời[4] Từ năm 60 kỉ trƣớc hƣớng kể ni cấy bào phấn hạt phấn, ni cấy tế bào đơn tế bào trần (protoplast) đƣợc phát triển mạnh [4] Từ năm 70 kỉ trƣớc đến nay, kĩ thuật lai xôma dung hợp tế bào trần kĩ thuật chuyển gen đƣợc phát triển thu đƣợc thành tựu đáng kể Đến nuôi cấy mô tế bào đƣợc phát triển mạnh mẽ ứng dụng rộng rãi công tác chọn giống nhân giống trồng [4] 1.1.3 Cơ sở khoa học nuôi cấy mơ tế bào thực vật 1.1.3.1 Tính tồn tế bào Cuối kỉ 19 đầu kỉ 20 nhà sinh lí thực vật học ngƣời Đức Haberlandt phát biểu tính tồn tế bào thực vật:”tế bào thể sinh vật mang tồn lƣợng thơng tin di truyền (ADN) cần thiết đủ sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hoàn chỉnh” [10] 1.1.3.2 Sự trẻ hóa tế bào Khả chồi, rễ thành phần khác khác Trong nuôi cấy mô tế bà thực vật phận non trẻ chồi, rễ tốt phận trƣởng thành [10] 1.1.3.3 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào Sự phân hóa tế bào chuyển hóa tế bào phơi sinh thành tế bào mơ chun hóa, đảm nhận chức khác thể Sự phản phân hóa chuyển hóa tế bào chuyên hóa chức trở lại thành tế bào phơi sinh điều kiện ni cấy thích hợp đặc biệt [10] Phân hóa tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào 1.2 Sự phát triển thành tựu nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.1 Trên giới Nghiên cứu mô - tế bào thực vật kỹ thuật sinh học đại phƣơng pháp nhân giống hữu hiệu phƣơng pháp nhân giơng vơ tính Kỹ thuận cho phép tạo quần thể đồng đều, giữ nguyên đặc tính mẹ, hệ số nhân giống cao, sớm phát huy đƣợc hiệu kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc dễ khắc phục đƣợc điều kiện bất lợi [1] Phƣơng pháp đặc biệt tỏ ƣu việt với lồi khó nhân giống đƣờng hữu tính (Phong lan), giống quý có số lƣợng ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh Nghiên cứu mơ - tế bào thực vật cịn đƣợc ứng dụng để: - Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống - Làm vius, phục tráng giống thoái hoá, bị bệnh - Nhân nhanh trì giống có ý nghĩa khoa học, giá trị kinh tế cao Khả ứng dụng nuôi cấy mô - tế bào thực vật dễ nhận thấy lĩnh vực nhân giống phục tráng giống trồng Với phƣơng pháp nghiên cứu đỉnh sinh trƣởng, Morel mở hƣớng lớn không cách mạng cơng nghệ lan mà cịn áp dụng cho nhân giống nhiều loại trồng khác nhƣ: Đu đủ, Khoai tây, Dâu tây,…(Morel, 1960) Năm 1985 theo Roca có 55 lồi trồng đƣợc áp dụng để nhân giống bệnh qua nuôi cấy mô gồm 11 ăn quả, loài lấy củ, loài cơng nghiệp 23 lồi cảnh Năm 1965, Morel Martin dùng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh tạo đƣợc Khoai tây không chứa virus mang lại ý nghĩa lớn cho ngành sản xuất Khoai tây giới Năm 1970, Storrisky thành công nuôi cấy vẩy củ hoa Lay ơn môi trƣờng dinh dƣỡng có 5mg/l BAP Dạ lan hƣơng với nồng độ 8ppm IAA [16] 1.2.2 Ở Việt Nam Nuôi cấy mô - tế bào thực vật đƣợc phát triển Việt Nam sau chiến tranh kết thúc (1975) Phịng thí nghiệm ni cấy mơ - tế bào đƣợc xây dựng viện sinh vật học, viện khoa học Việt Nam tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Bƣớc đầu phòng tập trung nghiên cứu phƣơng pháp nuôi cấy điều kiện Việt Nam nhƣ nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo protoplast Các kết nuôi cấy thành công bao phấn lúa thuốc đƣợc công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội cs 1978; Lê Thị Xuân cs) Tiếp thành công nuôi cấy protoplast thuốc khoai tây (Lê Thị Muội Nguyễn Đức Thành 1978; Nguyễn Đức Thành Lê Thị Muội, 1980, 1981) Trong thời gian phân viện khoa học Việt Nam Thành Phố Hồ Chí Minh muộn Đại học Nông Nghiệp Hà Nội Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam phịng thí nghiệm ni cấy mơ - tế bào đƣợc thành lập tập trung chủ yếu vào vi nhân giống khoai tây Đến có nhiều phịng thí nghiệm ni cấy mơ viện nghiên cứu (Viện Di truyền Nơng Nghiệp, Viện rau Trung Ƣơng) mà cịn số tỉnh sở sản xuất (Yên Bái, Hƣng Yên, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Cần Thơ,.) [4] Từ năm 80 kỷ trƣớc trở lại đây, hƣớng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô - tế bào đƣợc phát triển mạnh Những kết khích lệ đạt dƣợc lĩnh vực nhân giống khoai tây (Viện công nghệ sinh học, Đại học Nông Nghiệp 1, Viện khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp Việt Nam), dứa, chuối, mía (Viện cơng nghệ sinh học, Đại học Nông Nghiệp 1, Viện Di truyền Nông Nghiệp, Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam, Viện rau Trung Ƣơng) Một số hoa nhƣ Phong lan (Phân viện công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm chƣớng (Viện cơng nghệ sinh học, Viện Di truyền Nông Nghiệp) công nghiệp nhƣ Bạch đàn (Viện Di truyền Nông Nghiệp, Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam) Một số kết bƣớc đầu dƣợc ghi nhận lĩnh vực chọn dòng tế bào nhƣ chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thuỷ cs, 1994), chọn dịng chịu muối, chịu nƣớc (Nguyễn Tƣờng Vân cs, 1994; Đinh Thị Phòng cs, 1994) Các kết dung hợp tạo tế bào chất chuyển gen lục nạp thu đƣợc kết lý thú (Nguyễn Đức Thành cs, 1993, 1997) Nuôi cấy dƣợc liệu quý để bảo tồn nguồn gen tạo dịng tế bào có hàm lƣợng chất sinh học quan trọng cao (Phan Huy Bảo Lê Thị Xuân, 1998) đƣợc phát triển (Phan Thị Bảy cs,1995) [4] 1.3 Ý nghĩa nuôi cấy mô tế bào thực vật công tác giống trồng Sự đời kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại ý nghĩa vơ to lớn Nó chứng minh đƣợc tính tồn tế bào thực vật Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật góp phần giải vấn đề lý luận thực tiễn, đặc biệt lĩnh vực nghiên cứu trình phát sinh hình thái nhiều thực vật từ mức độ tế bào đến cấu trúc mô [10] Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc xem giải pháp công nghệ có ý nghĩa khoa học cơng nghệ sinh học Trên môi trƣờng nhân tạo, từ mô hay tế bào thực vật phân chia, phân hóa phát triển thành hồn chỉnh [10] Đây kỹ thuật sinh học đại phƣơng pháp nhân giống vơ tính [1] Những ƣu việt phƣơng pháp nhân giống vơ tính là: + Mang đầy đủ ý nghĩa hình thức nhân giống sinh dƣỡng thông thƣờng [1] + Tạo quần thể đồng giữ nguyên đƣợc phẩm chất di truyền nhƣ mẹ đƣợc chọn lọc [1] + Bảo tồn đƣợc nguyên vẹn ƣu lai F1 dùng F1 để nhân giống tiếp [1] + Là trình nhân nhanh quý phục vụ cho mục tiêu bảo tồn Vì bảo tồn theo hình thức hệ sau thân nguyên vẹn hệ trƣớc [1] + Là phƣơng thức nhân giống bổ sung cho lồi khó thu hạt khó bảo quản hạt nhƣ: Sao đen hạt giống nảy mầm sau vài ngày thu hái hạt hay nhƣ họ Dầu khó bảo quản hạt nhanh khả nảy mầm, hay lồi Lát hoa, nghiến khó thu hái hạt hạt nhỏ lại có cánh [1] + Tạo quần thể trồng đồng sinh trƣởng, phát triển sinh sản nhƣ sản phẩm thu hoạch nên thuận lợi cho việc gieo trồng, chăm sóc, khai thác, chế biến sản phẩm [1] + Phƣơng pháp đƣợc thực cách chủ động điều kiện thời tiết không chịu chi phối tƣợng bảo lƣu cục bộ-hiện tƣợng mà trồng giữ nguyên tập tính phận sinh dƣỡng nhƣ mẹ [1] + Nhân giống vơ tính kỹ thuật ni cấy mơ tế bào có hệ số nhân giống cao: từ 36-1012/năm, rút ngắn thời gian đƣa giống vào sản xuất để sớm phát huy đƣợc hiệu kinh tế [10] + Nhân đƣợc số lƣợng lớn diện tích nhỏ Trong 1m2 đạt tới 18000 [10] + Cây bệnh không tiếp xúc với nguồn bệnh [10] + Cây đƣợc tạo ni cấy mơ đƣợc trẻ hóa, chí khơng có khác biệt đáng kể so với mọc từ hạt [10] + Thuận tiện làm hạ giá thành vận chuyển Việc bảo quản giống thuận lợi Các giống đƣợc giữ nhiệt độ 4oC hàng tháng cho tỷ lệ sống 95% [10] Nhu cầu giống mô tế bào ngày nhiều Mấy năm gần đây, hàng năm giới sản xuất khoảng 50 triệu Ƣớc tính phải đạt 250 triệu cây/năm đáp ứng đƣợc yêu cầu thực tiễn sản xuất [10] 1.4 Các điều kiện cần thiết nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.4.1 Môi trƣờng nuôi cấy 1.4.1.1 Môi trƣờng vật lý - Ánh sáng Sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng chất lƣợng ánh sáng [4], [10] Thời gian chiếu sáng có vai trị q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy, với đa số lồi thời gian chiếu sáng thích hợp từ 12-18 Kết phân tích phƣơng sai nhân tố tỷ lệ mẫu sạch: ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 464.2247 92.84494 7.922085 0.001661 3.105875 Within Groups 140.6371 12 11.71976 Total 604.8619 17 Theo kết Ftính= 7,92 > Fcrit= 3,11 nên cơng thức khử trùng có sai khác rõ rệt Theo bảng 3.2 Hình 3.2 ta thấy nhƣ phƣơng pháp khử trùng kết hợp cồn 700 lần HgCl2 0,1% phƣơng pháp khử trùng kết hợp cồn 700 lần HgCl2 0,1% chất khử trùng nồng độ nhƣng thời gian xử lý mẫu khác cho tỷ lệ mẫu khác Cùng thời gian xử lý cồn thấy: Khi tăng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% lên, tỷ lệ mẫu đạt cao Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu nảy mầm có giảm đi: + Khi dùng cồn cồn700 phút công thức cho tỷ lệ khác nhƣ công thức CT tỷ lệ mẫu đạt 56,67% tỷ lệ mẫu nảy mầm có 31,11% Tăng thời gian khử trùng HgCl 0,1% lên phút công thức CT tỷ lệ mẫu đạt 64,44% tỷ lệ mẫu nảy mầm đạt tới 52,22% + Khi dùng cồn 700 phút cơng thức CT 12 tỷ lệ mẫu đạt 71,11% nhƣng tỷ lệ mẫu nảy mầm có 25,56% Cịn cơng thức CT 10 tỷ lệ mẫu giảm đạt 60%, nhƣng tỷ lệ mẫu nảy mầm ca đạt 28,89% Nguyên nhân tƣợng này, thời gian thời gian khử trùng thấp nên nấm, khuẩn chƣa đƣợc tiêu diệt hết, sau thời gian mẫu đƣợc cấy vào môi trƣờng nấm, khuẩn bắt đầu mọc trở lại dẫn đến mẫu bị nhiễm chết Khi tăng thời gian khử trùng lên hiệu diệt nấm khuẩn tốt nhiên tỷ lệ nảy mầm mẫu cấy giảm rõ rệt thời gian xử lý 30 chất khử trùng kéo dài làm tổn thƣơng mẫu Nhƣ thời gian khử trùng mẫu mang tính định đến tỷ lệ mẫu nảy mầm Ở công thức khử trùng phù hợp cho tạo mẫu mẫu nảy mầm công thức CT (cồn 700 thời gian phút, lần HgCl2 0,1% thời gian phút lần phút) Hình 3.3: Mẫu chồi Song mật sau khử trùng sơ Hình 3.4: Mẫu chồi măng đƣợc cấy vào môi trƣờng MS 31 3.2 Xác định môi trƣờng điều kiện nuôi cấy phù hợp cho mẫu tái sinh chồi Khi bắt đầu tiến hành nuôi cấy mô với đối tƣợng định, vấn đề phải chọn lựa môi trƣờng nào, sở để phối hợp tỷ lệ chất mơi trƣờng Việc tìm mơi trƣờng thích hợp cho tồn phát triển mô nuôi cấy vấn đề quan trọng dẫn đến thành cơng q trình ni cấy Mơi trƣờng ni cấy có tác dụng làm giá thể cho mẫu cấy, cung cấp chất dinh dƣỡng cho mẫu tồn tại, phân hố phát triển Mơi trƣờng ni cấy đƣợc bổ sung chất điều hồ sinh trƣởng nồng độ thích hợp, làm cho hoạt động sinh lý bên mô thực vật theo hƣớng gia tăng có lợi, cho việc phát triển chồi kích thích chồi ngủ tiềm ẩn phát triển thành chồi Có nhiều loại mơi trƣờng khác phục vụ cho việc nuôi cấy mô - tế bào thực vật Tuy nhiên để chọn đƣợc mơi trƣờng thích hợp cho chồi măng phát triển vấn đề khó khăn Trong khóa luận chúng tơi thử nghiệm hai loại môi trƣờng hai điều kiện nuôi là: + Môi trƣờng MS kết hợp điều kiện nuôi tối nuôi sáng + Môi trƣờng MS cải tiến kết hợp điều kiện nuôi tối nuôi sáng Kết nghiên cứu đƣợc ghi bảng 3.3 phụ biểu Bảng 3.3: Kết ảnh hƣởng môi trƣờng điều kiện nuôi đến khả mẫu tái sinh chồi CTTN Môi trƣờng Điều kiện Thời gian mẫu Tỷ lệ mẫu mẫu nuôi cấy mẫu tái sinh chồi tái sinh chồi (%) (ngày) S1 S2 S3 S4 MS Nuôi tối 5,67 48,89 Nuôi sáng 6,67 32,22 Nuôi tối 6,33 37,78 7,33 21,11 MS cải tiến Ni sáng 32 - Từ bảng 3.3 ta có hình 3.5 Hình 3.5: Biểu đồ mơ ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy đến khả mẫu tái sinh chồi Kết phân tích phƣơng sai hai nhân tố tỷ lệ mẫu tái sinh chồi: ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Sample 370.1852 370.1852 18.17437 0.00275 5.317655 Columns 833.1667 833.1667 40.90462 0.00021 5.317655 Interaction 8.33E-06 8.33E-06 40.9128 0.0099505 5.317655 Within 162.9482 20.36853 Total 1366.3 11 Qua kết cho FSample = 18,17 > Fcrit = 5,32 FClumns = 18,17 > Fcrit = 5,32 FInteraction= 18,17 > Fcrit = 5,32 Chúng thấy môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả mẫu tái sinh chồi, điều kiện nuôi cấy có ảnh hƣởng tới 33 khả mẫu cấy tái sinh chồi cs ảnh hƣởng qua lại rõ rệt môi trƣờng điều kiện nuôi cấy đến khả mẫu cấy tái sinh chồi Từ bảng 3.3 hình 3.5 cho thấy: Cùng loại mẫu cấy nhƣng đƣợc nuôi cấy loại môi trƣờng điều kiện ni cấy khác khả nảy mầm khác Trong điều kiện ni cấy mơi trƣờng MS có khả nảy mầm cao MS cải tiến nhƣ tỷ lệ mẫu nảy mầm ni sáng mơi trƣờng MS đạt 32,22%, cịn mơi trƣờng MS cải tiến đạt 21,11% Hay điều kiện đƣợc che tối hồn tồn tỷ lệ nảy mầm môi trƣờng MS đạt 48,89%, môi trƣờng MS cải tiến 37,78% Trong môi trƣờng nuôi cấy mẫu đƣợc ni điều kiện che tối hồn tồn có khả nảy mầm nhanh mẫu ni sáng Khi nuôi cấy môi trƣờng MS: thời gian mẫu nảy mầm nuôi sáng 6,67 ngày ni tối hồn tồn 5,67 ngày Ni cấy môi trƣờng MS cải tiến: thời gian mẫu nảy mầm ni sáng 7,33 ngày cịn ni tối 6,33 ngày Vậy nuôi môi trƣờng MS kết hợp che tối hoàn toàn tạo điều kiện tốt tới khả tái sinh chồi mẫu cấy 34 Hình 3.6: Chồi măng sau vào môi trƣờng MS điều kiện che tối 3.3 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi Tạo cụm chồi bƣớc khó khăn, khả tạo cụm chồi phụ vào nhiều yếu tố môi trƣờng nuôi cấy, đặc điểm nguồn mẫu cấy, tuổi chồi làm mẫu cấy Vì giai đoạn môi trƣờng nuôi cấy quan trọng định đến thành cơng chủ yếu việc tạo cụm chồi Mơi trƣờng ni cấy có bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng với nồng độ khác nhau, làm tiêu theo dõi ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi Sau mẫu nảy mầm, tiến hành nuôi cấy môi trƣờng dinh dƣỡng khác để tạo cụm chồi.Tuy nhiên, giai đoạn thử nghiệm bƣớc đầu nghiên cứu chất điều hòa sinh trƣởng đến khả cảm ứng tạo cụm chồi Theo kết nghiên cứu nhân giống mây đơn cho thấy bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng vào mơi trƣờng ni cấy chồi mây có cảm ứng tạo cụm chồi tốt Nhƣng IBA, NAA, Kinetin bổ sung 35 nồng độ thấp, chọn chất nồng độ cố định để xem BAP có ảnh hƣởng nhƣ đến khả cảm ứng tạo cụm chồi Kết thí nghiệm đƣợc thể bảng 3.4 phụ biểu Bảng 3.4: Kết ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi Chất ĐHST CTTN NAA+ Kinetin+ IBA(mg/l) BAP (mg/l) Thời gian mẫu bắt đầu tạo cụm chồi (ngày) Hệ số nhân chồi (lần) Chất lƣợng chồi B1 0,1 0,5 92 1,01 ++ B2 0,1 87 1,83 +++ B3 0,1 1,5 81 2,32 +++ B4 0,1 76 3,12 ++ + : chồi xấu ++ : chồi trung bình +++: chồi tốt Từ bảng 3.4 ta có hình 3.6 biểu diễn ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi 36 Hình 3.7: Biểu đồ mơ ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng đến khả tạo cụm chồi Kết phân tích phƣơng sai: ANOVA Source of Variation SS df MS Between Groups 11.95648 11 1.087 Within Groups 7.8193 F P-value F crit 3.66810793 0.039615691 3.314410986 12 0.6516 Theo bảng kết ta thấy Ftính = 3,67 > Fcrit = 3,31 nên chất điều hịa sinh trƣởng có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả tạo cụm chồi Theo kết bảng 3.4 hình 3.7 cho thấy: Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo cụm chồi lớn Các công thức đƣợc thể rõ tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi cao Khi nồng độ BAP tăng lên khả tạo cụm chồi mẫu lớn thời gian mẫu bắt đầu tạo cụm chồi ngắn Công thức B1cho hệ số nhân chồi thấp đạt 1,01 lần, thời gian mẫu tạo cụm chồi chậm nhất, sau 92 ngày mẫu bắt đầu đẻ chồi Chồi phát triển môi trƣờng tốt, chồi khỏe mạnh, nhiên số lƣợng chồi cụm nên hạn chế dùng môi trƣờng để tạo cụm chồi Khi tăng nồng độ BAP lên mg/l (Công thức B2) hệ số nhân tăng lên 1,83 lần thời gian tạo cụm chồi giảm xuống cịn 87 ngày Cụm chồi đƣợc tạo mơi 37 trƣờng khỏe mạnh, khả phát triển tốt nhƣng số lƣợng chồi tạo cụm thấp Tăng nồng độ BAP lên mg/l, hệ số nhân tăng cao đạt 3,12 lần nhƣng chất lƣợng chồi lại Tuy số lƣợng chồi cụm nhiều nhƣng chồi nhỏ phải cạnh tranh dinh dƣỡng, chiều cao chồi thấp, khả phát triển kém, hầu nhƣ chƣa xuất Khi nồng độ BAP 1,5 mg/l (công thức B3), hệ số nhân chồi đạt 2,32 lần thời gian tạo cụm chồi 81 ngày, chất lƣợng chồi tốt, chồi khỏe xuất lá, số lƣợng chồi tạo cụm vừa đủ không gian dinh dƣỡng cho chồi phát triển bình thƣờng Điều chứng tỏ BAP có ảnh hƣởng lớn tới khả tạo cụm chồi Tùy theo nồng độ BAP thay đổi mà khả tạo cụm chồi nhƣ chất lƣợng chồi khác Nồng độ BAP thấp, khả tạo cụm chồi kém, nhƣng nồng độ BAP cao chất lƣợng chồi V ì công thức tốt công thức thí nghiệm nghiên cứu tạo cụm chồi cơng thức B3 (Môi trƣờng nuôi cấy bổ sung 0,1mg/l IBA + 0,1mg/l NAA +0,1mg/l Kinetin + 1,5mg/l BAP) 38 Hình 3.8: Chồi măng bắt đầu tạo cụm chồi 39 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ Kết luận Qua thời gian nghiên cứu khoá luận cho số kết định: - Phƣơng pháp khử trùng phù hợp cho tạo mẫu chồi măng Song mật khử trùng kết hợp dùng cồn 700 lần HgCl2 0,1% với thời gian: cồn 700 phút kết hợp với HgCl2 0,1% lần phút lần phút - Chồi măng Song mật tái sinh tốt nuôi cấy mơi trƣờng MS điều kiện khơng có ánh sáng - Cơng thức hóa học với thành phần: MS + 1,5mg/l BAP + 0,1 mg/l IBA + 0,1 mg/l NAA + 0,1 mg/l Kinetin + 40g/l Saccharose + g/l Agar có tác dụng kích thích chồi măng Song mật tạo cụm chồi tốt Tồn Do thời gian làm khố luận cịn hạn chế nên cịn số tồn tại: - Chƣa nghiên cứu đƣợc ảnh hƣởng nhiều loại hoá chất khử trùng đến kết tạo mẫu - Chƣa nghiên cứu đƣợc ảnh hƣởng nhiều thang nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi tạo cụm chồi Song mật Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu giai đoạn qui trình nhân giống Song mật phƣơng pháp nuôi cấy in vitro từ chồi măng - Tiến hành nuôi cấy loại vật liệu khác, nhƣ: Từ con, từ phôi hạt… 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dƣơng Mộng Hùng, Lê Đình Khả (2003) - Giống rừng- NXB Nông nghiệp, Gây trồng song mây - NXB Văn hóa Dân tộc, 2000, trang 98-107 Hoàng Kim Ngũ, Phùng Ngọc Lan (2005) - Sinh thái rừng - NXB Nông nghiệp- Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2000) - Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng-NXB Nông nghiệp Hà Nội Nuôi cấy mô tế bào với việc chọn giống rừng - Thông tin khoa học kỹ thuật Lâm Nghiệp số1-1991 PGS.PTS Lê Trần Bình, PGS.TS Hồ Hữu Nhị, PGS.TS Lê Thị Muội (1997) ” Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng” Nhà xuất Nông Nghiệp Tài nguyên thực vật Đông Nam Á tập - Các song mây – NXB Nông nghiệp,1998 Tạp chi nông nghiệp phát triển nông thôn Song mây Việt Nam: Thực trạng phát triển số 11,2006 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005) “ Sinh lý học thực vật” NXB Giáo Dục 10 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005) “Công nghệ sinh học (Tập 2”) NXB Giáo Dục Tài liệu nƣớc 11 Barba, R.C.; Patena, L.J.; Mercado, M.M & Lorico, L 1985 Tissue cultureof rattan (Calamus manillensis H Wendl) Paper presented at the SecondNatl Symp on Issue Culture of Rattan Universiti Pertanian Malaysia 12 Chen Zhiying and Fan Kuan 1995 Rattan propagation and nursery in Yunnan Forest Science and Technology, (2): 24-25 41 13 Chen Zhiying, Fankun, Li Ying, Chen Sanyang and Duang Jinyu 1998 A study on rattan conservation in Yunnan Collected Research Papers on the Tropical Botany (IV) Pp 62-68 Yunnan University Press, Kunming, Yunnan 14 Dekkers, A.J and Rao, A.N.1989 Some observations on in vitro culture of Calamus trachycoleus Pp 63-68 in Proceedings of the Seminar on Tissue Culture of Forest Species (A.N Rao and A.M Yusoff, eds.) Forest Research Institute Malaysia and International Development Research Centre, Singapore Các trang web: 15 http://www.dalat.gov.vn 16 http://www.nhasinhhoctre.com 42 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÀI MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3.1 Tính tồn tế bào 1.1.3.2 Sự trẻ hóa tế bào 1.1.3.3 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào 1.2 Sự phát triển thành tựu nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Ở Việt Nam 1.3 Ý nghĩa nuôi cấy mô tế bào thực vật công tác giống trồng 1.4 Các điều kiện cần thiết nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.4.1 Môi trƣờng nuôi cấy 1.4.1.1 Môi trƣờng vật lý 1.4.1.2 Môi trƣờng hoá học 10 1.4.2 Vật liệu nuôi cấy 13 1.4.3 Điều kiện vô trùng 14 1.5 Nghiên cứu nhân giống Song mây 14 1.5.1 Trên giới 14 1.5.2 Ở Việt Nam 15 1.6 Giới thiệu Song mật 16 43 1.6.1 Đặc điểm hình thái Song mật 16 1.6.2 Đặc điểm sinh học phân bố Song mật 17 1.6.3 Giá trị kinh tế Song mật 18 Chƣơng 19 MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phƣơng pháp luận 19 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể 20 2.3.2.1 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 20 2.3.2.2 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 25 Chƣơng 26 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Xác định phƣơng pháp khử trùng phù hợp cho tạo mẫu 26 3.2 Xác định môi trƣờng điều kiện nuôi cấy phù hợp cho mẫu tái sinh chồi 32 3.3 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi 35 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Tồn 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ BIẾU 44