Nghiên cứu nuôi cấy lỏng lắc protocorm like bodies plbs, cụm chồi lan thạch hộc dược liệu dendrobium nobile lindl in vitro nghiên cứu khoa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY LỎNG LẮC PROTOCORM LIKE BODIES-PLBs, CỤM CHỒI LAN THẠCH HỘC DƯỢC LIỆU DENDROBIUM NOBILE LINDL IN VITRO Mã số đề tài:… Bình Dương, 03/2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY LỎNG LẮC PROTOCORM LIKE BODIES-PLBs, CỤM CHỒI LAN THẠCH HỘC DƯỢC LIỆU DENDROBIUM NOBILE LINDL IN VITRO Mã số đề tài:… Chủ nhiệm đề tài: Đồn Thúy Vy Khoa: Cơng nghệ sinh học Các thành viên: Trần Văn Minh Lữ Hồng Thơng Châu Ngọc Q Người hướng dẫn: Nguyễn Thanh Mai Bình Dương, 03/2019 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ DANH MỤC BẢNG LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Sơ lược lan thạch hộc 11 1.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 1.3 Những nghiên cứu ngồi nước kỹ thuật ni cấy lỏng lắc 18 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu: 20 2.2 Nguyên vật liệu: 20 2.3 Trang thiết bị hóa chất 20 2.4 Môi trường nuôi cấy 21 2.5 Điều kiện nuôi cấy 21 2.6 Phương pháp nghiên cứu: 22 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ …………………………………………33 4.1 Kết luận 33 4.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 iii DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ Hình 1 Cây lan Thạch hộc Dendrobium nobile Lindl 11 Hình (a,b,c,i,g): Chồi lan Dendrobium theo nồng độ BA khác 27 Hình 1: Chồi Dendrobium nobile tạo cụm PLB môi trường Knudson C có bổ sung BAP/NAA 60 NSC 28 Hình 3.2: Chồi Dendrobium nobile tạo cụm PLB mơi trường Knudson C có bổ sung mg/l BAP + NAA 0,5 mg/l (nghiệm thức BN4) 29 Hình 3: Hình PLBs nuôi tăng sinh nổng độ nước dừa khác 32 DANH MỤC BẢNG Bảng 4: Thành phần dung dịch dinh dưỡng MS 21 Bảng 6.2: Bố trí thí nghiệm 23 Bảng 6.3 : Ảnh hưởng BAP/NAA lên tạo PLB từ chồi Dendrobium nobile 60 NSC 24 Bảng 6.4: Bố trí thí nghiệm 25 Bảng 1: Bố trí thí nghiệm 26 Bảng :Ảnh hưởng BAP/NAA lên tạo PLB từ chồi Dendrobium nobile 60 NSC 28 Bảng 3: Ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến protocorm like bodies- PLBs 30 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập giảng đường Đại học hoàn thành đề tài thực tập tốt nghiệp này, em nhận giúp đỡ, quan tâm hỗ trợ từ phía nhà trường, Thầy Cơ, gia đình bạn bè Em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cô Nguyễn Thanh Mai, người nâng đỡ em từ kinh nghiệm chuyên môn nâng đỡ tinh thần bước đầu thực đề tài thực tập đầy bỡ ngỡ Em xin cảm ơn thầy Mai Trường, chị Thu Hiền anh Thê Viện Sinh học Nhiệt đới giúp đỡ, chia cho em kinh nghiệm chuyên môn tạo cho em điều kiện để thực đề tài thực tập Em xin cảm ơn ban giám hiệu nhà trường, quý Thầy Cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện học tập truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt trình học tập Em xin cảm ơn anh Thiên Hùng, chị Hồng Qun, chị Thu Ngân, bạn khóa hỗ trợ em trình thực đề tài thực tập Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba mẹ người thân gia đình u thương, chăm sóc, động viên suốt trình học tập Em xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày….tháng…năm 2019 Đoàn Thúy Vy BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy lỏng lắc Protocorm Like Bodies- PLBs, cụm chồi lan Thạch hộc dược liệu Dendrobium nobile Lindl - Sinh viên thực hiện: Đoàn Thúy Vy - Lớp: DH15SH02 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: - Người hướng dẫn: Nguyễn Thanh Mai Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy lỏng lắc Protocorm Like Bodies- PLBs, cụm chồi lan Thạch hộc dược liệu ( Dendrobium nobile Lindl)” thực hằm tìm phương pháp để thu nhiều sinh khối Protocorm Like Bodies- PLBs từ lồi lan có dược liệu q đáp ứng nhu cầu thị trường, tránh việc bị khai thác mức bên cạnh để bảo tồn lồi lan có dược liệu q Tính sáng tạo: Nghiên cứu nuôi cấy lỏng lắc Protocorm Like Bodies- PLBs, cụm chồi lan Thạch hộc dược liệu ( Dendrobium nobile Lindl)” thực hằm tìm phương pháp để thu nhiều sinh khối Protocorm Like Bodies- PLBs hướng đến việc mang sinh khối protocorm thị trường cách sử dụng trược tiếp protocorm để trị bệnh Kết nghiên cứu: Ở thí nghiệm 1: Tạo chồi từ chồi bên loài lan thạch hộc Dendrobium nobile Lindl Chồi lan thạch hộc cho chồi xanh, to khỏe môi trường nuôi MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA+ 8g agar/lít mơi trường thích hợp cho việc phát sinh chồi giống lan Ở thí nghiệm 2: Tạo PLBs (Protocorm Like Bodies) từ mẫu chồi loài lan thạch hộc Dendrobium nobile Lindl Đối với mẫu nghiệm thức bổ sung BAP/ NAA, nồng độ NAA giử cố định 0,5 mg/l, nồng độ BAP từ 0,5 đến mg/l cho kết tạo PLB Phần trăm tăng rõ rệt từ 33,00 (BN1) đến cao 52,78 (BN4) thời điểm 60 NSC, số PLB/mẫu cao BN4 10,04 PLB/mẫu tái sinh mơi trường Knudson C có bổ sung dừa (15%) + đường (30%) + mg/l BAP + NAA 0,5 mg/l Ở thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường nồng độ nước dừa đến protocorm like bodies- PLBs Qua bảng kết cho thấy nước dừa nghiệm thức B2 10% cho gia tăng trọng lượng tươi cao (3,35 lần) so với nghiệm thức B1 % B3 15% (3,18; 3,03 lần) Từ ta thấy bổ sung 10 % nước dừa môi trường MS có 30g/l đường gia tăng trọng lượng tươi cao Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: Nghiên cứu dược lý đại, Thạch hộc tiá có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng thể, làm dãn mạch máu kháng đông máu, sử dụng rộng rãi lâm sàng làm thuốc Thạch hộc tía dùng đơn độc phối trộn với dược liệu khác, có 100 thuốc từ Thạch hộc thị trường đón nhận Thị trường tiêu thụ khả quan, chế biến sâu, thị trường lớn hiệu qủa cao, bao gồm thị trường nội địa, thị trường Đông Nam Á, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản châu Âu, châu Mỹ Nhưng sản lượng đưa thị trường khiêm tốn Bộ phận sử dụng làm thuốc toàn tươi hay khơ qua đề tài thực hằm tìm phương pháp để thu nhiều sinh khối Protocorm Like Bodies- PLBs từ lồi lan có dược liệu quý đáp ứng nhu cầu thị trường, tránh việc bị khai thác mức bên cạnh để bảo tồn lồi lan có dược liệu q Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ tên tạp chí có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có): Theo Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh việc sử dụng mơi trường VW bổ sung BA,NAA,Kitenin,TDZ,nước dừa,sucrose nuôi cấ phát sinh tăng sinh tế bào soma, phát sinh tái sinh phôi giả ( PLB) Li (2012) nghiên cứu nhân nhanh giống lan D officinale Kimura et Migo môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA+ 6g agar/lít mơi trường thích hợp cho việc phát sinh chồi Đỗ Đăng Giáp, Đỗ Đức Thăng, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Thị Huyền Trang, Đỗ Thị Tuyến Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam “Khảo sát ảnh hưởng trạng thái môi trường nuôi cấy lên tăng sinh khối A formosanus Hayata môi trường lỏng khơng có chất điều hịa sinh trưởng thực vật” Nghiên cứu cho thấy A formosanus Hayata nuôi cấy môi trường lỏng hay lỏng lắc có tượng đa chồi chồi ni cấy điều kiện khỏe mạnh có thân to xanh so với chồi nuôi cấy môi trường rắn Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài (phần người hướng dẫn ghi): Ngày tháng năm Người hướng dẫn (ký, họ tên) Xác nhận đơn vị (ký tên đóng dấu) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Ảnh 4x6 Họ tên: Đoàn Thúy Vy Sinh ngày: 14 tháng 10 năm 1997 Nơi sinh: Minh Hòa – Kiên Giang Lớp: DH15SH02 Khóa:15 Khoa:CNSH Địa liên hệ: 3D4 Phạm Phú Thứ, Bình Khánh 5, Long Xuyên, An Giang Điện thoại: 0972823245 Email: 1553010252vy@ou.edu.vn II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích sinh viên từ năm thứ đến năm học): * Năm thứ 1: Ngành học: CNSH Khoa:CNSH Kết xếp loại học tập: Trung bình Sơ lược thành tích: 5.89/10 * Năm thứ 2: Ngành học: CNSH Khoa:CNSH Kết xếp loại học tập: Trung bình Sơ lược thành tích: 6.09/10 * Năm thứ 3: Ngành học: CNSH Khoa:CNSH Kết xếp loại học tập: Trung bình Sơ lược thành tích: 6.66/10 * Năm thứ 4: (học kì I) Ngành học: CNSH Khoa:CNSH Kết xếp loại học tập: Trung bình 2.4 Mơi trường ni cấy Môi trường sử dụng môi trường MS (Murashige-Skoog) bản, gồm thành phần sau: Bảng 4: Thành phần dung dịch dinh dưỡng MS Thành phần dung dịch dinh dưỡng MS Thành phần mg/l - Đa lượng: 1650 NH4NO3 1900 KNO3 170 KH2PO4 370 MgSO4.7H2O 440 CaCl2.2H2O - Vi lượng: MnSO4.4H2O 22,3 H3BO3 6,2 ZnSO4.7H2O 8,6 KI 0,83 NaMoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 - Fe EDTA: 37,3 Na2EDTA 27,8 FeSO4.7H2O 2.5 Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ phòng: 27±oC Vận tốc lắc: 100 vòng/phút 21 Cường độ chiếu sáng: 1000 lux Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày pH môi trường nuôi cấy: 5,7 - 5,8 2.6 Phương pháp nghiên cứu: Thực phương pháp nghiên cứu phịng thí nghiệm Nghiên cứu gồm nội dung chính: Gồm nội dung - Khảo sát môi trường tạo chồi lan thạch hộc D.nobile Lindl - Khảo sát môi trường tạo protocorm like bodies- PLBs lan thạch hộc D.nobile Lindl - Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường nồng độ nước dừa đến protocorm like bodies- PLBs 2.6.1 Các phương pháp thống kê phương pháp luận sử dụng thí nghiệm Thí nghiệm sử dụng phương pháp thống kê: Các số liệu thu được, thống kê phần mềm Microsoft Excel 2007 Statgraphics plus 3.0 Phương pháp luận dựa trên: - Các kiến thức sinh lý thực vật đối tượng nghiên cứu - Kết nghiên cứu liên quan trước tác giả 2.6.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát mơi trường tạo chồi lan thạch hộc D.nobile Lindl Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với nghiệm thức (NT) NT lặp lại lần 22 Bảng 6.1: Bố trí thí nghiệm BAP ĐC NT1 0,5 NT2 NT3 1,5 NT4  Chỉ tiêu : Số lượng đặc điểm chồi NAA 0,5  *Tiến hành thí nghiệm: - Mẫu sử dụng khúc cắt chồi bên lan thạch hộc D.nobile Lindl phòng nghiên cứu trọng điểm, viện sinh học Nhiệt Đới - Đưa mẫu vào tủ cấy: - Gấp mẫu đĩa sau cắt mẫu thành khúc chồi bên 0,5cm - Đưa mẫu khúc cắt chồi bên rễ lan thạch hộc vào đĩa petri có chứa môi trường vô trùng chuẩn bị sẵn - Các mẫu nuôi môi trường MS với pH dao động từ 5.7 đến 5.8 bổ sung NAA BA theo nồng độ bảng 2.6.2 (môi trường khử trùng 1,2 atm, 1210C thời gian 20 phút) - Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng đặc điểm chồi - Thời gian thí nghiệm: 2-3 tháng sau cấy 2.6.3 Thí nghiệm 2: Tạo PLBs (Protocorm Like Bodies) từ mẫu chồi loài Dendrobium nobile Mỗi thí nghiệm có nghiệm thức gồm đối chứng, nghiệm thức lặp lại lần 23 Cytokinin/auxin (mg/l) BAP NAA ĐC 0,0 0,0 BN1 0,5 0,5 BN2 1,0 0,5 BN3 1,5 0,5 BN4 2,0 0,5 Bảng 2.6 : Ảnh hưởng BAP/NAA lên tạo PLB từ chồi Dendrobium nobile 60 NSC *Tiến hành thí nghiệm: - Mẫu sử dụng chồi thí nghiệm lan thạch hộc D.nobile Lindl - Đưa mẫu vào tủ cấy: - Đưa mẫu khúc cắt chồi bên rễ lan thạch hộc vào đĩa petri có chứa mơi trường vơ trùng chuẩn bị sẵn - Các mẫu nuôi môi trường MS với pH dao động từ 5.7 đến 5.8 bổ sung NAA BA theo nồng độ bảng 2.6.3 (môi trường khử trùng 1,2 atm, 1210C thời gian 20 phút) - Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng đặc điểm chồi - Thời gian thí nghiệm: 30 ngày sau cấy 2.6.4 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường nồng độ nước dừa đến protocorm like bodies- PLBs Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với nghiệm thức (NT) NT lặp lại lần 24 Bảng 2.6 3: Bố trí thí nghiệm Khối lượng(g) Nghiệm thức B1 B2 B3  Các tiêu theo dõi: khối lượng (g)  Nồng độ nước dừa (%) NT Kí hiệu B1 10 B2 15 B3 *Tiến hành thí nghiệm: - Mẫu sử dụng PLBs tạo thí nghiệm lan thạch hộc D.nobile Lindl phòng nghiên cứu trọng điểm, viện sinh học Nhiệt Đới - Đưa protocorm vào bình Erlen 250ml có chứa 50ml dung dịch dinh dưỡng vơ trùng chuẩn bị sẵn - Các mẫu nuôi mơi trường MS giảm ½ đa lượng với pH dao động từ 5.7 đến 5.8 bổ sung đường, nước dừa theo nồng độ bảng 2.6.4 (môi trường khử trùng 1,2 atm, 1210C thời gian 20 phút) Cuối đem mẫu lắc với nhiệt độ phòng: 27±oC, vận tốc lắc: 100 vòng/phút, cường độ chiếu sáng: 1000 lux - Chỉ tiêu theo dõi: khối lượng(g) - Thời gian thí nghiệm: 30 ngày sau cấy 25 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Tạo chồi từ chồi bên loài Dendrobium nobile Tỷ lệ auxin/cytokinin quan trọng phát sinh hình thái hệ thống nuôi cấy Sự kết hợp auxin cytokinin với tỷ lệ định cải thiện khả tái sinh mà làm tăng sinh trưởng chồi Do vậy, nghiên cứu tiến hành thử nghiệm công thức tạo phát sinh hình thái với tổ hợp BA NAA nồng độ khác Bảng 1: Bố trí thí nghiệm BAP ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 NAA Đặc điểm chồi Khơng có chồi Chồi xanh thân 0,5 mập Chồi xanh nhạt 0,5 thân mãnh Chồi xanh nhạt 1,5 thân mãnh Chồi xanh nhạt thân mãnh Từ kết bảng 3.1 cho thấy nghiệm thức có chứa 0,5 BAP/0,5 NAA cho chồi xanh, chồi to khỏe Tuy nhiên, BAP tăng cao thi số chồi cụm giảm, chồi nhạt dần chậm phát triển Còn nghiệm thức đối chừng khơng có diện chồi Sự phối hợp auxin cytokinin thúc đẩy biệt hóa chồi tốt sử dụng đơn lẻ báo cáo nghiên cứu Nguyễn Thị Sơn cộng (2014) MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA+ 8g agar/lít mơi trường thích hợp cho việc phát sinh chồi giống lan D officinale Kimura et Migo.[4,5] 26 b) Mẫu đối chứng e) Mẫu NT2 i) Mẫu NT3 a) Mẫu NT1 c) Mẫu NT3 g) Mẫu NT4 Hình (a,b,c,i,g): Chồi lan Dendrobium theo nồng độ BA khác 27 3.2 Thí nghiệm 2: Tạo PLBs (Protocorm Like Bodies) từ mẫu chồi loài Dendrobium nobile Mẫu chồi in vitro tạo từ thí nghiệm tiến hành nuôi cấy môi trường Knudson C (Morel, 1965) bổ sung nước dừa (15%), đường (30%) BAP với nồng độ từ 0,5-2 mg/l, nồng độ NAA cố định 0,5 mg/l (theo Roman, 2008) Mỗi thí nghiệm có nghiệm thức gồm đối chứng, nghiệm thức lặp lại lần Bảng :Ảnh hưởng BAP/NAA lên tạo PLB từ chồi Dendrobium nobile 60 NSC NT Cytokinin/auxin (mg/l) Phần trăm chồi tạo PLB (%) Số PLBtrung bình/ mẫu (TB ± SE) BAP NAA ĐC 0,0 0,0 0,00 az 0,00 a BN1 0,5 0,5 33,00 ± 3,66 b 6,12 ± 0,90 b BN2 1,0 0,5 41,15±1,92 bc 6,12 ± 0,55 b BN3 1,5 0,5 45 cd 8,21 ± 1,79 b BN4 2,0 0,5 52,78 ± 2,01 d 10,04 ± 1,34 c ANOVA ** ** Ghi chú: NT: nghiệm thức; n: số mẫu khảo sát; số liệu phần trăm chuyển sang dạng arcsin√x z: Các số có chữ khác cột khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức P ≤ 0,01 theo phân hạng Holm-Sidak’s test (phần mềm SigmaPlot ver.11, Systat software, Inc., California, USA) Hình 1: Chồi Dendrobium nobile tạo cụm PLB mơi trường Knudson C có bổ sung BAP/NAA 60 NSC Ở nghiệm thức đối chứng, hình thành PLB từ chồi khơng xảy Do đó, khơng có diện diện BAP/NAA ngoại sinh môi trường nuôi cấy, chồi khả mg/l BAP) + NAA 0,5 mg/l tạo PLB (hình 3.2.1) 28 Đối với mẫu nghiệm thức bổ sung BAP/ NAA, nồng độ NAA giử cố định 0,5 mg/l, nồng độ BAP từ 0,5 đến mg/l cho kết tạo PLB Phần trăm tăng rõ rệt từ 33,00 (BN1) đến cao 52,78 (BN4) thời điểm 60 NSC, số PLB/mẫu cao BN4 10,04 PLB/mẫu tái sinh (hình3 2.2) Sự diện BAP/NAA môi trường nuôi cấy cho thấy tỷ lệ cytokinin cao, auxin thấp kích thích chồi tạo PLB Trong nghiên cứu sử dụng kết hợp cytokinin/auxin, theo Roman (2008) chồi lồi Dendrobium nobile có khả tạo PLB cao theo tỷ lệ BAP/NAA 4:1 Do đó, bổ sung BAP/NAA vào mơi trường với nồng độ thích hợp làm thay đổi cân hormone nội sinh mẫu giúp kích thích tạo PLB.[8,9] Hình 2.2: Chồi Dendrobium nobile tạo cụm PLB môi trường Knudson C có bổ sung mg/l BAP + NAA 0,5 mg/l (nghiệm thức BN4) 3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường nồng độ nước dừa đến protocorm like bodies- PLBs PLB tạo từ thí nghiệm ni cấy mơi trường MS lỏng có bổ sung hàm lượng nước dừa khác để theo dõi khả tăng sinh PLB (lắc máy lắc, tốc độ 100V/phút) 29 Bảng 3: Ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến protocorm like bodies- PLBs Nước dừa (%) Khối lượng PLB ban đầu (g) Khối lượng PLB 30 ngày sau cấy Gia tăng khối lượng tươi (lần) B1 1,010g 3,21g 3,18 lần B2 10 1,030g 3,45 3,35 lần B3 15 1,035g 3,42 3,03 lần NT Nước dừa có khả kích thích tạo mơ sẹo thực vật kích thích có tác động tích cực tới q trình biệt hóa quan nhờ tác động lên trình phân chia sinh trưởng tế bào thực vật Nước dừa sử dụng nhiều nuôi cấy mô tác động tốt lên sinh trưởng q trình phơi hóa mơ sẹo phân hóa nhân nhanh chồi nhiều lồi Công bố sử dụng nước dừa nuôi cấy mô thuộc Van Overbeek cộng (Van Overbeek cs, 1941,1942) Sau đó, tác dụng tích cực nước dừa môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa xác định giàu hợp chất hữu cơ, chất khống chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996) Nước dừa sử dụng để kích thích phân hóa nhân nhanh chồi nhiều loài Nước dừa thường sử dụng nồng độ từ đến 20% Thực khảo sát nồng độ nước dừa thích hợp để thay chất điều hòa sinh trưởng trình nhân sinh khối hiệu cho sản phẩm sử dụng.[6] Qua bảng kết cho thấy nước dừa nghiệm thức B2 10% cho gia tăng trọng lượng tươi cao (3,35 lần) so với nghiệm thức B1 % B3 15% (3,18; 3,03 lần) Trong số loài thực vật, trình tái sinh gia tăng cách bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy [ 9,12] Ngoài ra, nước dừa báo cáo có khả làm tăng q trình sinh trưởng phát triển hoa lan ống nghiệm có liên quan đến diện loại cytokinin [10,14] Kết phù hợp với nghiên cứu Saranjeet cộng (2012) Ông cộng nhận thấy bổ sung 10 % nước dừa mơi trường MS có 30g/l đường thúc đẩy q trình nhân nhanh hình thành chồi có từ - - rễ, đạt 73,75 % [7] 30 Shantz cộng bổ sung nước dừa có tác dụng kích thích q trình nhân nhanh tế bào mơ nước dừa có chứa số yếu tố tăng trưởng Khi bổ sung nước dừa vào mơi trường ni cấy, hiệu kích thích nhận thấy xảy hàm lượng nước dừa thêm vào từ 10 % cần thiết cho q trình tăng trưởng mơ sẹo số loài [11,13] 3.3 a: NT B1 31 3.3 b: NT B2 3.3 c: NT B3 Hình 3: Hình PLBs ni tăng sinh nổng độ nước dừa khác 32 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Ở thí nghiệm 1: Tạo chồi từ chồi bên loài lan thạch hộc Dendrobium nobile Lindl Chồi lan thạch hộc cho chồi xanh, to khỏe môi trường nuôi MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA+ 8g agar/lít mơi trường thích hợp cho việc phát sinh chồi giống lan - Ở thí nghiệm 2: Tạo PLBs (Protocorm Like Bodies) từ mẫu chồi loài lan thạch hộc Dendrobium nobile Lindl Đối với mẫu nghiệm thức bổ sung BAP/ NAA, nồng độ NAA giử cố định 0,5 mg/l, nồng độ BAP từ 0,5 đến mg/l cho kết tạo PLB Phần trăm tăng rõ rệt từ 33,00 (BN1) đến cao 52,78 (BN4) thời điểm 60 NSC, số PLB/mẫu cao BN4 10,04 PLB/mẫu tái sinh mơi trường Knudson C có bổ sung dừa (15%) + đường (30%) + mg/l BAP + NAA 0,5 mg/l - Ở thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường nồng độ nước dừa đến protocorm like bodies- PLBs Qua bảng kết cho thấy nước dừa nghiệm thức B2 10% cho gia tăng trọng lượng tươi cao (3,35 lần) so với nghiệm thức B1 % B3 15% (3,18; 3,03 lần) Từ ta thấy bổ sung 10 % nước dừa môi trường MS có 30g/l đường gia tăng trọng lượng tươi cao 4.2 Kiến nghị Nếu tiếp tục nghiên cứu, đề nghị nghiên cứu: - Cần tiếp tục thí nghiệm với dịch chiết hữu khác, nhiều nồng độ khác để tìm mơi trường cho gia tăng trọng lượng tươi protocorm tốt - Tăng thể tích bình thể tích dung dịch dinh dưỡng để tạo nguồn protocorm lớn 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Khoa học Công nghệ 2007 Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật) NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội, tr 404-405 Đỗ Đăng Giáp*, Đỗ Đức Thăng, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Thị Huyền Trang, Đỗ Thị Tuyến, Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy không sử dụng chất điều hòa sinh trưởng lên khả tăng sinh khối dư lượng nitrat, kim loại nặng có mẫu lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata), Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại học Quốc gia, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012) Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (Hoàng Thảo Long nhãn) Tạp chí Khoa học Phát triển, 10(2): 263 - 271 Nguyễn Thị Sơn, Trần Thế Mai, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch (2013) Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc thiết bì) 1282 Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreactor plantima nhân giống loài lan Hoàng Thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 2: 28-34 29 Trịnh Thị Hương, Trịnh Thị Lan Anh, Huỳnh Kim Thùy My, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Minh Nhật, Đặng Xuân Thành, Dương Tấn Nhựt - Ảnh hưởng số dịch chiết có nguồn gốc thực vật thời gian cấy chuyền tới q trình nhân nhanh phơi vơ tính lan Hồ Điệp (Phalaenopsis spp.), Hội nghị công nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam (2009) 341-346 Tài liệu nước ngoài: Maddock S E., Lancaster V A., Risiott R., Franklin J - Plant regeneration from cultured immature embryos and inflorescences of 25 cultivar of wheat (Triticum aestivum), J Exp Bot 34 (1983) 915-926 Mathias R J., Simpson E S - The interaction of genotype and culture medium on the tissue culture responses of wheat (Triticum aestivum L.) callus, Plant Cell Tiss Org Cult (1986) 31-37 Nasib A., Ali K., Khan S - An optimized and improved method for the in vitro propagation of kiwifruit (Actinidia deliciosa) using coconut water, Pak J Bot 40 (2008) 2355-2360 10 Bhasker J - Micropropagation of Phalaenopsis [Ph.D Thesis.] Thrissur, Kerala Agricultural University, 1996 11 Shantz E M., Steward F C - Coconut milk factor: The growth promoting substance in coconut milk, J Amer Chem Soc 74 (1952) 6133-6135 34 12 Burnet G., Ibrahim R K - Tissue culture of Citrus peel and its potential for flavonoid synthesis, Z Pflanzenphysiol 69 (1973) 152-162 13 Intuwong O., Sagawa Y - Clonal propagation of sarcanthine orchids by aseptic culture of inflorescences, Amer Orc Soc Bull 42 (1973) 264-270 Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt 61 14 Saranjeet K., Bhutani K K - Organic growth supplement stimulants for in vitro multiplication of Cymbidium pendulum, HortScince (1) (2012) 47-52 35 ... lắc Protocorm Like BodiesPLBs, cụm chồi lan Thạch hộc dược liệu ( Dendrobium nobile Lindl) ” cần thiết Mục tiêu Nghiên cứu nuôi cấy lỏng lắc Protocorm Like Bodies- PLBs, cụm chồi lan Thạch hộc dược. .. ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY LỎNG LẮC PROTOCORM LIKE BODIES- PLBs, CỤM CHỒI LAN THẠCH HỘC DƯỢC LIỆU DENDROBIUM NOBILE. .. tài: Nghiên cứu nuôi cấy lỏng lắc Protocorm Like Bodies- PLBs, cụm chồi lan Thạch hộc dược liệu ( Dendrobium nobile Lindl) ” thực hằm tìm phương pháp để thu nhiều sinh khối Protocorm Like Bodies-