Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T6 2016 Trang 53 Nghiên cứu khả năng hấp thu selenium của nấm Ophiocordyceps sinensis trong nuôi cấy lỏng Trần Minh Trang Phạm Tiến Dũng Trường Đ[.]
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T6- 2016 Nghiên cứu khả hấp thu selenium nấm Ophiocordyceps sinensis nuôi cấy lỏng Trần Minh Trang Phạm Tiến Dũng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG - HCM Lê Quốc Phong Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM Đinh Minh Hiệp Ban Quản lý Khu Nông nghiệp - Công nghệ cao TP.HCM ( Bài nhận ngày 19 tháng 09 năm 2016, nhận đăng ngày 21 tháng 11 năm 2016) TÓM TẮT sinh khối hàm lượng Se đạt 14,52 ± Ophiocordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo) 0,82 g/L 1644,83 ± 116,45µg/g Trong đó, lồi nấm dược liệu có giá trị cao y thành phần Se có hợp chất hữu Sehọc cổ truyền đại Bên cạnh đó, selenium EPS, Se-PS Se-Pr tương ứng 568,84 ± 12,86 (Se) nguyên tố vi lượng thiết yếu µg/g, 429,68 ± 22,17µg/g 443,19 ± 18,48µg/g thể người Do vậy, nghiên cứu khả hấp Hơn nữa, kết phân tích phổ hồng ngoại thu Se nấm O sinensis, từ nâng cao dược FT-IR chúng xác định có diện tính khả dụng sinh học Se dao động giãn Se=O C-O-Se đỉnh hấp vô cấp thiết Trong nghiên cứu này, thu đặc trưng Do vậy, kết chứng tỏ tiến hành ni cấy O sinensis mơi trường có O sinensis có khả chuyển hóa Se vơ thành bổ sung Se vô 4+ 6+ từ 0–30 mg/L, sau dạng Se hữu q trình phát triển lập hợp chất chứa Se bao gồm: seleniumchúng, tạo tiền đề sở khoa học cho exopolysaccharide (Se-EPS), seleniumnghiên cứu sâu hoạt chất giàu Se có polysaccharide (Se-PS) selenium-protein (Setrong nấm O sinensis Pr) Kết cho thấy, nấm O sinensis phát triển tích lũy Se tốt mơi trường Se6+ 25 mg/L với Từ khóa: Ophiocordyceps sinensis, phổ hồng ngoại FT-IR, selenium-exopolysaccharide, seleniumpolysaccharide, selenium-protein MỞ ĐẦU Selenium (Se) nguyên tố vi lượng thiết yếu cho người, có ý nghĩa sinh học to lớn Se thành viên nhóm VIA bảng hệ thống tuần hồn có tính chất hóa học gần giống lưu huỳnh (S) Vì vậy, thực vật nấm thay Se cho S sinh tổng hợp methionine tạo thành selenomethionine (SeMet) SeMet chuyển hóa thành selenocysteine (SeCys) chất chuyển hóa Ở người, Se thành phần selenoprotein số enzyme glutathione perxosidase (GSHPx), dehydrogenase, thioredoxin reductase iodothyronine deiodinase… chúng có chức sinh lý quan trọng kháng oxy hóa, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, ức chế HIV chống Trang 53 Science & Technology Development, Vol 19, No.T6-2016 lão hóa… [1] Sự thiếu hụt Se có liên quan đến số bệnh Kashin-Beck, Keshan ung thư Gần đây, hợp chất Se thu hút ý rộng rãi hoạt tính sinh học quan trọng chúng Độc tố dược tính số hợp chất Se nghiên cứu nhiều kết cho thấy hình thức tồn Se quan trọng Các hợp chất Se hữu (như SeMet methylselenocysteine) tốt an toàn so với Se vơ (như selenate selenite) sử dụng để bổ sung thích hợp phần ăn người nhằm nâng cao sức khỏe hay điều trị số bệnh liên quan Do vậy, việc bổ sung Se nuôi cấy vi sinh vật thu hút nhiều ý nhà khoa học giới nhằm chuyển hóa Se vơ thành Se hữu Nhiều báo cáo nuôi trồng nấm men nấm lớn C militaris, G lucidum… môi trường dinh dưỡng giàu Se selenite (Na2SO3), để chuyển hóa thành dạng Se hữu dạng Se-PS hay Se-Pr công bố Kết nghiên cứu Zhao cộng (2004) cho thấy, G lucidum chuyến hóa selenite vơ chất thành Se hữu dạng protein (56–61%) polysaccharide (11–18 %) thành phần khác [16] Dong cộng (2012) chứng minh Se nâng cao chất lượng protein, chất béo, carbohydrate, khoáng chất, polysaccharide, mannitol, amino acid, cordycepin adenosine C militaris, nhiên chế tác động Se chưa hiểu rõ [1] Ophiocordyceps sinensis (tên thường gọi Đơng trùng hạ thảo) lồi nấm dược liệu quý hiếm, biết đến y học cổ truyền Trung Quốc cách 700 năm Nghiên cứu đại chứng minh, O sinensis có nhiều hoạt tính sinh học đáng q kháng oxy hóa, tăng cường điều hòa hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm đường huyết, kháng ung thư chống di căn… Những tác dụng có lợi có đa dạng thành phần hợp chất có hoạt tính sinh học adenosine, cordycepin, Trang 54 polysaccharide, amino acid nguyên tố vi lượng… Tuy nhiên, hoạt động khai thác mức phá hủy môi trường sống người biến đổi khí hậu làm cho nguồn O sinensis trở nên khan có nguy tuyệt chủng [7] Do vậy, giải pháp khả thi bền vững để sản xuất nấm dược liệu quý công nghệ nuôi cấy sợi nấm O sinensis mơi trưởng lỏng Chính lẽ đó, nhà khoa học muốn biết: liệu O sinensis sử dụng đối tượng tích lũy hiệu Se ni cấy nhân tạo hay khơng? Nếu lồi nấm dược liệu quý chuyển hóa Se từ dạng vô môi trường thành dạng hữu tích lũy thể nấm, O sinensis giàu Se trở thành nguồn bổ sung Se phần ăn sở hữu tác dụng đáng quý cho thể người Mục tiêu nghiên cứu xác định khả hấp thu Se nấm O sinensis thu nhận hợp chất Se hữu bao gồm: polysaccharide ngoại bào chứa Se (Se-exopolysaccharide), polysaccharide nội bào chứa Se (Se-polysaccharide) protein chứa Se (Se-protein) có nấm O sinensis giàu Se VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Chủng nấm O sinensis cung cấp Tiến sĩ Trương Bình Ngun (Đại học Đà Lạt Việt Nam) Ni cấy O sinensis môi trường giàu Se Chủng nấm O sinensis hoạt hóa mơi trường PGA (khoai tây 200 g/L, glucose 20 g/L agar 15 g/L ) 10-15 ngày 25 0C, sau chuyển khoanh giống (Ø = cm) vào 200 mL môi trường PG (khoai tây 200 g/L, glucose 20 g/L) ủ 25 0C ngày Tiếp theo, giống chuyển sang môi trường lỏng (khoai tây 200 g/L, saccharose 50 g/L, KH2PO4 g/L, MgCl2.3H2O g/L Na2SeO3.5H2O/Na2SeO4.12H2O với nồng độ Se4+/Se6+ từ 0–30 mg/L) theo tỷ lệ 1:12,5 (v/v), ủ 25 0C 40 ngày TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T6- 2016 Xác định đường kính sợi nấm Nhỏ giọt nước lên lame kính, sau tách sợi nấm đặt lên tiến hành đo đường kính sợi nấm phương pháp quan sát trắc vi thị kính (vật kính 100 X) Thu nhận sinh khối nấm Sinh khối nấm tách khỏi dịch nuôi cấy cách cho qua rây nhựa rửa vòi nước nhằm loại bỏ Se cịn lại mơi trường bám vào Sau đó, nấm sấy khơ 60 0C đến trọng lượng không đổi xác định khối lượng khô sinh khối nấm Phân tích hàm lượng Se Hàm lượng Se có sinh khối xác định phương pháp phổ hấp thu nguyên tử với hydride hóa HG-AAS [4] Thu nhận hợp chất selenium hữu Thu nhận Se-exopolysaccharide (Se-EPS) Dịch nuôi cấy nấm thu nhận cách lọc qua giấy lọc Whatman, cô đặc tủa với ethanol theo tỷ lệ 1:4 (v/v) 0C 24 h Rửa tủa với ethanol, acetone ether, sau đơng khơ Sử dụng HG-ASS để xác định hàm lượng Se có tủa nhóm chức đặc trưng phổ hồng ngoại FTIR [13] Thu nhận Se-polysaccharide (Se-PS) 20 g bột nấm chiết với lần nước 60 C theo tỷ lệ 1:30 (w/v) h Thu nhận dịch chiết, cô đặc loại protein TCA Dịch tủa với ethanol theo tỷ lệ 1:4 (v/v) Ly tâm rửa tủa nhiều lần với ethanol, acetone, ether, đông khô tủa Xác định hàm lượng Se HG0 AAS nhóm chức đặc trưng phổ hồng ngoại FTIR [9] Thu nhận Se-protein (Se-Pr) 10 g bột nấm chiết lần với NaOH 0,25M 50 0C theo tỷ lệ 1:10 (w/v) h Dịch chiết thu nhận tủa với (NH4)2SO4 (95 % bão hòa) 0C 12 h Tủa thu nhận ly tâm 4000 vịng/phút 10 phút Sau đó, hòa tủa với mL đệm Tris-HCL (pH 8,0), thực thẩm tách với Tris-HCl (pH 8,0) 24 h Hàm lượng Se xác định HG-AAS nhóm chức đặc trưng phổ hồng ngoại FTIR [9] Phân tích liệu Tất liệu phân tích ANOVA đơn yếu tố (one-way) phần mềm thống kê SPSS Dữ liệu thể giá trị trung bình độ lệch chuẩn Mức ý nghĩa % (P < 0,05) sử dụng xác suất chấp nhận tối thiểu cho khác biệt giá trị trung bình KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình thái đường kính sợi nấm Khi quan sát sợi nấm kính hiển vi, chúng tơi nhận thấy hình thái đường kính sợi nấm nghiệm thức chứa Se khơng có khác biệt so với mẫu đối chứng (Hình 1) Tất sợi nấm khơng có vách ngăn, không phân nhánh, thuôn đều, đặc biệt khơng đứt gãy hay phình to bất thường Đường kính sợi nấm khoảng 5-7,5 µm Kết chứng minh, Se khơng ảnh hướng đến đường kính hình thái sợi nấm trình sinh trưởng phát triển nấm O sinensis Trang 55 Science & Technology Development, Vol 19, No.T6-2016 Đối chứng Se6+ 25 mg/L Se4+ 25 mg/L 2,5 µm 100X A 100X B 100 X C Hình Hình thái đường kính sợi nấm kính hiển vi trắc vi thị kính (vật kính 100X) A Đối chứng B Se4+ 25 mg/L ĐC C Se6+ 25 mg/L 10 15 20 25 30 Hình Tác động Se đến phát triển nấm O sinensis Sự ảnh hưởng Se đến phát triển nấm O sinensis Se nguyên tố vi lượng cần thiết cho thể nấm, nhiên, trở thành yếu tố gây độc cho nấm nồng độ cao môi trường Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát hai loại Se vô (Na2SeO3.5H2O Na2SeO4.12H2O) với nồng độ từ – 30 mg/L Kết cho thấy, Se có ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất sinh khối nấm O sinensis nồng độ tăng (p < 0,05), đặc biệt nồng độ Se 30 mg/L hiệu suất thu nhận sinh khối giảm khoảng 80 % so với đối chứng (Hình 2) Hơn nữa, tăng nồng độ Se lớn 40 mg/L, nấm O sinensis bị ức chế hoàn toàn So sánh mức độ gây độc hai loại Se vô nấm O sinensis, thông qua kết hiệu suất thu nhận sinh khối hàm lượng Se có nấm chứng minh Se4+ có độc tính cao so với Se6+ Cụ thể, nồng độ 25 mg/L, nghiệm thức Trang 56 Se6+ cho sinh khối hàm lượng Se tương ứng 14,52 ± 0,82 g/L 1644,83 ± 116,45 µg/g, đó, nghiệm thức Se4+ đạt 11,85 ± 1,52 g/L 1159,65 ± 169,58 µg/g Sự khác biệt đường chuyển hóa hai loại Se thể nấm không giống Mapelli cộng (2012) chứng minh Se hấp thu vào thể vi sinh vật nhờ vào hệ thống sulfate permease [10] Do đó, đường vận chuyển selenate (SeO42-) tương tự sulfate (SO42-) kênh vận chuyển chủ động sulfate-proton; khi, selenite (Se4+) vận chuyển vào thể theo cách tự phát dựa vào GSH (glutathione) [8, 12] Tuy nhiên, khả chuyển hóa thành dạng Se hữu hai loại Se nấm O sinensis chưa sáng tỏ Như vậy, qua thí nghiệm chúng tơi kết luận, nấm O sinensis có khả thích nghi mơi trường giàu Se, đặc biệt nồng độ 25 mg/L thích hợp cho nấm phát triển tích lũy Se TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T6- 2016 Thu nhận hợp chất Se hữu Để đánh giá mức độ chuyển hóa Se nấm O sinensis từ hai loại Se vô trên, tiến hành lập ba hợp chất hữu có chứa Se bao gồm: Se-EPS, Se-PS Se-Pr Bảng cho thấy, hàm lượng ba hợp chất hữu thu từ hai nghiệm thức chứa Se 25 mg/L cao so với nghiệm thức đối chứng (với p