Nghiên Cứu Khả Năng Hấp Thụ, Tích Lũy Chì (Pb) Và Sự Biểu Hiện Gen Liên Quan Đến Tính Chịu Chì (Pb) Của Cây Phát Tài (Dracaena Sanderiana)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH - HỒ BÍCH LIÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ, TÍCH LŨY CHÌ (Pb) VÀ SỰ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU CHÌ (Pb) CỦA CÂY PHÁT TÀI (Dracaena sanderiana) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí minh - Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH - HỒ BÍCH LIÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ, TÍCH LŨY CHÌ (Pb) VÀ SỰ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU CHÌ (Pb) CỦA CÂY PHÁT TÀI (Dracaena sanderiana) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Bùi Cách Tuyến TS Huỳnh Văn Biết Thành phố Hồ Chí minh - Năm 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tác giả cam đoan cơng trình nghiên cứu tác giả Các số liệu, kết nghiên cứu luận án trung thực không chép từ người hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Tác giả luận án Hồ Bích Liên ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, thực hồn thành luận án này, tơi nhận hướng dẫn, giúp đỡ tận tình tập thể Quý Thầy Cô, quan, anh chị bạn Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến: GS TS Bùi Cách Tuyến TS Huỳnh Văn Biết tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm kiến thức quý báo giúp tơi hồn thành tốt luận án TS Bùi Minh Trí tận tình giúp đỡ, hỗ trợ thiết bị đo diệp lục tố chia nhiều tài liệu chuyên môn quý báu Ban Giám Hiệu Trường Đại học Thủ Dầu Một, Lãnh đạo Khoa Tài nguyên Môi trường, Khoa Khoa học quản lý, Viện Phát triển Ứng dụng, tập thể Giảng viên Bộ môn Khoa học Môi trường hỗ trợ tạo mọi điều kiện để tơi học tập, thực hồn thành tốt luận án Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Khoa Khoa học Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Môi trường Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM giúp đỡ tạo mọi điều kiện tốt giúp đỡ trình thực luận án Tất bạn bè đồng nghiệp người động viên, giúp đỡ chân thành tơi q trình làm luận án Ba Mẹ người thân gia đình, chồng ủng hộ, động viên điểm tựa tinh thần cho tơi suốt q trình thực luận án Nghiên cứu sinh Hồ Bích Liên iii TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu khả hấp thụ, tích lũy chì (Pb) biểu gen liên quan đến tính chịu chì (Pb) Phát tài (Dracaena sanderiana)” thực loài thực vật Dracaena sanderiana Mục tiêu đề tài đánh giá khả sinh trưởng, tích lũy Pb biểu gen chống oxy hóa liên quan đến tính chịu Pb D sanderiana mơi trường thí nghiệm nhiễm Pb nhân tạo, nhằm có sở khoa học chế đáp ứng mức độ phân tử tế bào tính chống chịu Pb để ứng dụng D sanderiana xử lý ô nhiễm Pb Đề tài với nội dung sau thực hiện: (1) Xác định sở khoa học việc chọn lựa vật liệu sinh học pH mơi trường thích hợp cho nghiên cứu; (2) Nghiên cứu khả hấp thụ tích lũy Pb D sanderiana thời gian xử lý nồng độ Pb khác nhau; (3) Đánh giá mức độ biểu gen chống oxy hóa glutathione S-transferase (GST), Cyt-Cu/Zn superoxide dismutase (Cyt-Cu/Zn SOD) glutathione peroxidase (GPX) thời gian nồng độ Pb khác Kết cho thấy: Loài thực vật sử dụng nghiên cứu thích hợp lồi Dracaena Phát tài (Dracaena sanderiana) pH dung dịch Pb thích hợp 4,5 Sự sinh trưởng D sanderiana bị ảnh hưởng không đáng kể nồng độ Pb 200 - 800 ppm (khả chống chịu đạt 80,38 - 114,47%) Nhưng nồng độ Pb môi trường vượt ngưỡng gây độc (1000, 2000, 3000 4000 ppm), sinh trưởng kìm hãm Các tiêu chiều cao cây, chiều dài rễ, sinh khối tươi khô, hàm lượng diệp lục tố hàm lượng nước giảm đáng kể so với đối chứng D sanderiana có khả hấp thụ tích lũy 39235 mg/kg TLK Pb mơi trường có nồng độ Pb = 800 ppm Ngưỡng nồng độ gây độc Pb nước D sanderiana xác định 1000 ppm Biểu ngộ độc Pb D sanderiana xuất tiếp xúc với nước ô nhiễm Pb vượt ngưỡng chịu đựng Các triệu chứng điển khơng tăng trưởng chiều cao, héo khô thân, rễ co ngắn lại iv Phần lớn Pb hấp thụ tích lũy chủ yếu rễ (chiếm 97,5%) Sự tích lũy Pb giảm dần theo thứ tự rễ > thân > D sanderiana xem siêu tích lũy Pb có khả hấp thụ Pb cao 500 lần, tích lũy Pb cao 1% trọng lượng Hàm lượng Pb tích lũy chủ yếu rễ nên D sanderiana phù hợp cho chế phytofiltration phytostabilization để xử lý Pb môi trường ô nhiễm Pb phân bố chủ yếu gian bào vách tế bào Ở mức độ tế bào, D sanderiana có số phản ứng để đối phó với độc tính Pb: Loại bỏ Pb khỏi tế bào chất cách cô lập Pb gian bào; Liên kết Pb với thành phần vách tế bào kết tủa gian bào; Làm dày vách tế bào, trung trụ làm tăng đường kính ống mạch Trên D sanderiana, lần đoạn trình tự gen chống oxy hóa GST, Cyt-Cu/Zn SOD GPX với kích thước tương ứng 362, 221 202 bp xác định Mức độ biểu gen GST, Cyt-Cu/Zn SOD GPX bị ức chế nồng độ Pb vượt ngưỡng chịu đựng (1000 ppm) Sự tăng biểu gen xảy nồng độ Pb 200, 400, 600 800 ppm có thể nguyên nhân giúp chống chịu tốt với tác động bất lợi Pb Gen Cyt-Cu/Zn SOD GPX biểu sớm mạnh phận rễ nơi có hàm lượng Pb tích lũy cao nhằm đáp ứng kịp thời với độc tố Pb Gen GST biểu mạnh thân D sanderiana đáp ứng cho vận chuyển Pb Gen GST biểu mạnh thân có thể lý dẫn đến hàm lượng Pb tích lũy thân nhiều Từ khóa: Biểu hiện gen, Phát tài, chì, gen chống oxy hóa, sự tích lũy chì v SUMMARY The thesis “Study on the lead absorption, accumulation and expression profiles of lead tolerant genes in Dracaena sanderiana” was conducted on Lucky bamboo plant (Dracaena sanderiana) The objective of the research aimed to evaluate the growth, the ability of Pb tolerance, Pb accumulation, and antioxidant gene expression of D sanderiana under artificial Pb poisoning experimental environment to supply scientific footing on molecular and cellular mechanisms of Pb induced plant stress responses to apply D sanderiana in lead pollution treatment Contents of the thesis were carried out: 1) Determining the scientific basis for the selection of suitable biological materials and the pH for research; 2) Examination of the growth and the capacity of Pb absorption and accumulation of D sanderiana under different times and Pb concentrations conditions; 3) Evaluation of expression level of antioxidant genes GST, Cyt-Cu/Zn SOD, and GPX under time, and Pb concentration dependent conditions The results showed that: D sanderiana was the most appropriate plant among three species of Dracaena genus pH 4.5 was the most suitable value for this study The growth of the D sanderiana was not significantly affected at Pb concentrations 200 - 800 ppm (tolerance capacity was from 80.38 to 114.47%) However, when the concentrations of Pb in the medium were higher than the tolerance limit of the plant (1000, 2000, 3000 and 4000 ppm), the growth of D sanderiana could be inhibited Plant height, root length, fresh and dry biomass, chlorophyll content and water content were significantly reduced compared with the control D sanderiana can accumulate up to 39235 mg/kg Pb in the presence of Pb at 800 ppm The threshold limit of Dracaena sanderiana was recorded at 1000 ppm of Pb in water When the concentrations of Pb in the medium were higher than the tolerance limit of the plant, poisoning expressions in Dracaena sanderiana appeared Typical symptoms included reducing plant height growth, withering both leaves and stems, and shortened roots vi The lead was accumulated mainly in the roots (approximately 97.5%), and only a small fraction was translocated to aerial plant parts Pb content in D sanderiana plants decreased in the order of roots > stems > leaves D sanderiana can be considered as a hyperaccumulator plant species because its capacity of Pb absorption was 500 times higher than control, and the Pb accumulation was 1% higher than its weight The Pb content accumulated mainly in the roots, so D sanderiana is suitable for phytofiltration or phytostabilization to treat lead in polluted environments The Pb was deposited mainly in extracellular spaces and the cell wall At the cellular level, D sanderiana could have several various lead detoxification mechanisms to which plants may respond, such as removing Pb from the cytoplasm, sequestering of Pb in extracellular spaces, binding of Pb to components of the cell wall, or precipitation of Pb in extracellular spaces; For the first time, the sequences of the antioxidant genes GST, Cyt-Cu/Zn SOD and GPX with sizes of 362, 221 and 202 bp, respectively, were identified in D sanderiana The expression levels of antioxidant genes GST, Cyt-Cu/Zn SOD and GPX were inhibited at Pb concentrations above a tolerance limit of the plants (1000 ppm) The enhancement of gene expression at Pb 200 - 800 ppm may have evolved as part of the system protecting the cell from oxygen toxicity Cyt-Cu/Zn SOD and GPX genes were early and strongly expressed in the root where accumulation and deposition of Pb were highest This helps D sanderiana respond promptly to lead The significant enhancement of GST expression in stems and leaves of D sanderiana that may be the way to transport lead to aerial plant parts The overexpression of the GST gene may help the Pb concentration on stems greater than in leaves Keywords: Antioxidant gene, Dracaena sanderiana, gene expression, lead, lead accumulation vii MỤC LỤC TRANG LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii SUMMARY v MỤC LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi DANH MỤC CÁC BẢNG xiii DANH MỤC CÁC HÌNH xiv MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Các đặc tính chì (Pb) tình hình ô nhiễm Pb 1.1.1 Các đặc tính Pb 1.1.2 Tình hình nhiễm Pb giới Việt Nam 1.1.2.1 Tình hình nhiễm Pb giới 1.1.2.2 Tình hình nhiễm Pb Việt Nam 1.2 Phương pháp sử dụng thực vật xử lý ô nhiễm (phytoremediation) 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại 10 1.2.2.1 Phương pháp thu hút độc chất (Phytoextraction) 10 1.2.2.2 Phương pháp lọc độc chất (Rhizofiltration) 11 1.2.2.3 Phương pháp bay (Phytovolatilization) 12 1.2.2.4 Phương pháp cố định độc chất (Phytostabilization) 12 1.3 Khả hấp thụ, tích lũy, phân bố chống chịu pb thực vật 13 1.3.1 Khả hấp thụ tích lũy Pb thực vật 13 1.3.1.1 Cơ chế hấp thụ Pb thực vật 13 1.3.1.3 Thực vật siêu hấp thụ 14 1.3.1.4 Khả tích lũy Pb thực vật 16 viii 1.3.2 Khả phân bố Pb thực vật 17 1.3.3 Khả chống chịu Pb thực vật 18 1.3.3.1 Cơ chế làm dày vách tế bào 18 1.3.3.2 Cơ chế cô lập Pb 19 1.3.3.3 Cơ chế chống oxy hóa 21 1.3.3.4 Cơ chế dẫn truyền tín hiệu chống chịu Pb thực vật 23 1.3.4 Ảnh hưởng Pb đến thực vật 24 1.4 Giới thiệu Phát tài (Dracaena sanderiana) 29 1.4.1 Phân loại thực vật nguồn gốc phân bố 29 1.4.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái sinh sản Phát tài 29 1.4.3 Đặc tính đặc biệt Phát tài 30 1.5 Gen, biểu gen liên quan đến chống chịu Pb thực vật kỹ thuật phân tử nghiên cứu biểu gen 31 1.5.1 Các gen có liên quan đến chống chịu Pb thực vật 31 1.5.2 Sự biểu gen liên quan đến chống chịu Pb thực vật 33 1.5.3 Kỹ thuật phân tử nghiên cứu biểu gen 35 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Tiến trình nghiên cứu 38 2.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 39 2.3.3.4 Tạo dòng gen GST, Cyt-Cu/ZnSOD, GPX ACT vi khuẩn Escherichia coli DH5α 51 2.3.3.5 Ly trích DNA plasmid giải trình tự gen 53 2.3.3.6 Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng Real-time PCR 54 2.3.3.7 Phân tích đánh giá kết 55 2.4 Phân tích số liệu 56 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Cơ sở chọn lựa lồi dracaena khảo sát ph thích hợp cho nghiên cứu 57 3.1.1 Sự tăng trưởng khả tích lũy pb ba lồi Dracaena điều kiện nhiễm pb 57 ix 3.1.1.1 Sự tăng trưởng ba loài Dracaena 57 3.1.1.2 Khả hấp thụ tích lũy Pb ba lồi Dracaena 59 3.1.1.3 Khả loại bỏ Pb nước ba loài Dracaena 60 3.1.2 Ảnh hưởng ph đến khả hấp thụ tích lũy pb phát tài 63 3.1.2.1 Ảnh hưởng pH đến tăng trưởng Phát tài nồng độ Pb 100 ppm 63 3.1.2.2 Ảnh hưởng pH đến khả hấp thụ tích lũy Pb D sanderiana 65 3.2 Khả hấp thụ, tích lũy phân bố chì (pb) phát tài mơi trường nhiễm độc Pb 67 3.2.1 Sự sinh trưởng Phát tài 67 3.2.1.1 Sự tăng trưởng chiều cao Phát tài 67 3.2.1.2 Sự tăng trưởng chiều dài rễ Phát tài 69 3.2.1.3 Sự tăng trưởng sinh khối tươi khô Phát tài 70 3.2.1.4 Sự tổng hợp diệp lục tố Phát tài 72 3.2.1.5 Hàm lượng nước Phát tài 73 3.2.1.6 Khả chống chịu Pb Phát tài 74 3.2.2 Khả tích lũy Pb Phát tài 75 3.2.2.1 Hàm lượng Pb tích lũy rễ, thân Phát tài 75 3.2.2.2 Khả vận chuyển Pb từ rễ lên thân, Phát tài 81 3.2.2.3 Sự cân Pb nước và hiệu loại bỏ Pb Phát tài 82 3.2.3 Sự phân bố Pb phạm vi tế bào Phát tài 85 3.2.3.1 Sự phân bố Pb rễ 85 3.2.3.2 Sự phân bố Pb thân 88 3.2.4 Phản ứng mô thực vật Phát tài điều kiện nhiễm độc Pb 91 3.2.4.1 Phản ứng mô rễ 91 3.2.4.2 Phản ứng mô thân 95 3.2.4.3 Phản ứng mô 99 x 3.3 Sự biểu gen chống oxy hóa phát tài môi trường nhiễm độc Pb 104 3.3.1 Kiểm tra sản phẩm RNA ly trích mẫu nghiên cứu 104 3.3.2 Khuếch đại trình tự gen chống oxy hoá Phát tài 104 3.3.3 Tạo dòng gen chống oxy hóa 105 3.3.5 Giải trình tự gen chống oxy hóa 108 3.3.5.1 Trình tự gen GST 108 3.3.5.2 Trình tự gen Cyt-Cu/Zn SOD 111 3.3.5.2 Trình tự gen GPX 113 3.3.6 Đánh giá mức độ biểu gen chống oxy hóa Phát tài 116 3.3.6.1 Đánh giá mức độ biểu gen GST 116 3.3.6.2 Đánh giá mức độ biểu gen Cyt-Cu/Zn SOD 120 3.3.6.3 Đánh giá mức độ biểu gen GPX 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 136 PHỤ LỤC 149 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH - HỒ BÍCH LIÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ, TÍCH LŨY CHÌ (Pb) VÀ SỰ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU CHÌ (Pb) CỦA CÂY PHÁT TÀI (Dracaena. .. trình thực luận án Nghiên cứu sinh Hồ Bích Liên iii TÓM TẮT Đề tài ? ?Nghiên cứu khả hấp thụ, tích lũy chì (Pb) biểu gen liên quan đến tính chịu chì (Pb) Phát tài (Dracaena sanderiana)? ?? thực loài... Phát tài 29 1.4.3 Đặc tính đặc biệt Phát tài 30 1.5 Gen, biểu gen liên quan đến chống chịu Pb thực vật kỹ thuật phân tử nghiên cứu biểu gen 31 1.5.1 Các gen có liên quan