Phân lập và thiết kế vector chỉnh sửa gen waxy kiểm soát hàm lượng amylose ở giống lúa khang dân 18 (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHỈNH SỬA GEN WAXY KIỂM SOÁT HÀM LƯỢNG AMYLOSE Ở GIỐNG LÚA KHANG DÂN 18” Tên sinh viên : Nguyễn Thị Hồng Thu Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Duy Phương TS Bùi Thị Thu Hương Hà Nội, tháng 2/ 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan báo cáo thời gian qua Những số liệu kết nghiên cứu trung thực, hồn tồn thực phịng Bệnh học Phân tử Viện Di truyền Nông nghiệp, không chép nguồn khác Ngoài ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn nguồn thích rõ ràng Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên thực Nguyễn Thị Hồng Thu i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, tơi cịn nhận quan tâm giúp đỡ nhiều tập thể cá nhân Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Duy Phương − Phòng Bệnh học Phân tử − Viện Di truyền Nông nghiệp cô TS Bùi Thị Thu Hương − Bộ môn Sinh học − Khoa Công nghệ Sinh học − Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện cho tôi, hướng dẫn tận tình, chu đáo giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, tơi xin chân cảm ơn giúp đỡ quý báu, nhiệt tình tập thể cán thuộc môn Bệnh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp, nơi tiến hành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn Sinh học − Khoa Công nghệ Sinh học − Học viện Nơng nghiệp Việt Nam có ý kiến đóng góp để tơi hồn thành khóa luận cách hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên thực Nguyễn Thị Hồng Thu ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu ý nghĩa đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung tinh bột 2.1.1 Cấu tạo tinh bột .3 2.1.2 Con đường sinh tổng hợp tinh bột 2.1.3 Ảnh hưởng hàm lượng tinh bột đến chất lượng gạo .4 2.2 Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 2.2.1 Giới thiệu công nghệ chỉnh sửa gen 2.2.2 Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 2.3 Chuyển gen thực vật hệ thống vector chuyển gen 10 2.3.1 Phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A.tumerfaciens 10 2.3.2 Hệ thống vector chuyển gen 11 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tượng, vật liệu hóa chất nghiên cứu 13 3.1.1 Đối tượng 13 3.1.2 Vật liệu 13 3.1.3 Hóa chất, thiết bị 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu 14 iii 3.2.1 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn kit Fermentas 14 3.2.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp xử lí với enzym cắt giới hạn 15 3.2.3 Điện di DNA gel agarose 1% .15 3.2.4 Tinh DNA từ gel agarose 15 3.2.5 Ghép nối DNA T4 DNA ligase 16 3.2.6 Nhân đoạn DNA đặc hiệu kỹ thuật PCR .16 3.2.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn .16 3.2.8 Thiết kế trình tự gRNA đặc hiệu chỉnh sửa gen Waxy−KD 18 17 3.2.9 Giải trình tự DNA 17 3.2.10 Thiết kế vector cho biểu crRNA đặc hiệu chỉnh sửa gen Wx−KD 18 .17 3.2.11 Thiết kế vector chuyển gen tế bào thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa gen Wx−KD 18 19 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .21 4.1 Phân lập giải trình tự đầy đủ đoạn gen Wx−KD 18 21 4.1.1 Phân lập gen Wx−KD 18 21 4.1.2 Giải trình tự gen Waxy 21 4.2 Thiết kế trình tự crRNA chỉnh sửa gen Waxy 22 4.3.Thiết kế cấu trúc biểu crRNA chỉnh sửa gen Wx−KD 18 26 4.4 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa gen Wx−KD 18 30 4.5 Biến nạp vector biểu vào A tumerfaciens LBA4404 33 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO .36 iv DANH MỤC VIẾT TẮT A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Bp base pair (cặp bazơ) CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (nhóm đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên) Cas CRISPR associated protein (protein liên kết CRISPR) crRNA CRISPR RNA CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DBS Double–stranded break (đứt gãy sợi đôi) dNTP Deoxynucleotide triphosphate E coli Escherichia coli RS Resistant Starch (Tinh bột kháng) GBSS Granule bound starch synthase (Con đương sinh tổng hợp tinh bột) EtBr Ethidium bromide HR Homologous recombination (tái tổ hợp tương đồng) Kb Kilobase SEB Starch Branching Enzymes (Enzym phân nhánh tinh bột) NHEJ Non–homologous end–joining (ghép nối điểm cuối không tương đồng) NST Nhiễm sắc thể Nu Nucleotide PAM Protospacer adjacent motif (motif liền kề protospacer) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) RNAi RNA interference (can thiệp RNA) sgRNA single guide RNA (RNA dẫn đường) v TAL Transcription activator–like (tương tự yếu tố hoạt hóa phiên mã) TALEN TAL effector nuclease (nuclease tác động tương tự yếu tố hoạt hóa phiên mã) T–DNA Transfer–DNA (DNA chuyển) Ti–plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) tracrRNA trans–encoded CRISPR RNA ZFN Zinc finger nuclease (nuclease ngón tay kẽm) Wx−KD 18 Waxy−Khang dân 18 HDR homologous directed recombination (sửa chữa theo hướng tương đồng) SDN Site-directed nucleases (Nuclease đặc hiệu) ZFP protein zinc-finger PEG polyethylene glycol NLS nuclear localization signal (tín hiệu định vị hạt nhân) TAE Tris acetate (đệm điện di) vi DANH MỤC BẢNG Bảng : Một số hệ vector CRISPR/Cas9 dùng cho chuyển gen thực vật [18] 11 Bảng 1: Trình tự oligonucleotide sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 1: Đặc điểm crRNA chỉnh sửa Waxy-KD 18 23 Bảng 2: Trình tự crRNA chỉnh sửa Wx−KD 18 25 vii DANH MỤC HÌNH Hình Cấu trúc thành phần hạt tinh bột: amylose amylopectin [34] Hình 2: Cơ chế cắt DNA phức hệ protein CRISPR/Cas9 [18] Hình 1: Sơ đồ thiết kế vector cho biểu crRNA 19 Hình 2: Sơ đồ thiết kế vector chỉnh sử gen Waxy 20 Hình 1: PCR nhân DNA Waxy 21 Hình 2: So sánh trình tự DNA Waxy với giống lúa 22 Hình 3: Cắt giới hạn pENTR4 enzym cắt giới hạn BtgZI 26 Hình 4: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pENTR4/crRNA1−Wx 27 Hình 5: PCR cắt giới hạn vector pENTR4/crRNA1−Wx 28 Hình 6: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx 29 Hình 7: PCR cắt giới hạn vector pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx 30 Hình 8: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx 31 Hình 9: : PCR cắt giới hạn vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx 32 Hình 10: PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx 34 viii TĨM TẮT Ngũ cốc có hàm lượng amylose tinh bột kháng (RS) mang lại lợi ích sức khỏe tiềm Các nghiên cứu trước sử dụng phương pháp gây đột biến hóa học can thiệp RNA chứng minh gen Waxy đóng vai trị việc làm giảm hàm lượng amylose gạo Trong nghiên cứu này, gen Waxy phân lập từ DNA tổng số lúa chủ lực KD 18 Trình tự DNA phân lập có kích thước 1,2 kb, chứa hai trình tự bám để chỉnh sửa gen Dựa trình tự DNA phân lập, cấu trúc crRNA (5’−GCGCGACGCCCAAGCAGCAG−3’ 5’−TGAGGCCCTGGAACCCGTGG−3’) chèn vào vị trí cắt BtgZI BsaI thiết kế với vị trí bám đặc hiệu vào hệ vector mang cấu trúc biểu gRNA công nghệ CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/ associated protein 9) Từ đó, tạo hệ vector mang cấu trúc chỉnh sửa gen Waxy làm giảm hàm lượng amylose giống lúa KD 18 Nghiên cứu sở cho việc tạo giống lúa có suất cao công nghệ gen Việt Nam ix Để đảm bảo khả trì hoạt tính tính đặc hiệu phức hệ CRISPR/Cas9 nhân tế bào, gRNA phải có hàm lượng GC trình tự crRNA từ 30 – 80%, có khả hình thành cấu trúc bậc II ổn định, tổng số cặp bazơ (TBP – total base pairs) < 13, số cặp bazơ liên tục (CBP – consecutive base pairs) < số cặp bazơ bên cấu trúc crRNA (IBP–internal base pairs) < [21] Kết phân tích bảng 4.1 cho thấy crRNA−14 có TBP = 13 khơng chọn để phân tích Cịn lại, sgRNA đảm bảo việc hình thành phức hệ CRISPR/Cas9 ổn định có hoạt tính nhân tế bào thực vật (Bảng 4.1) Bên cạnh ưu điểm tính đơn giản, thuận tiện khả ứng dụng lớn, hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 có nhược điểm so với hệ thống chỉnh sửa gen khác (TALEN, ZFN ) tính đặc hiệu, sgRNA nhận biết 20 nucleotide Cas9 hoạt động dù trình tự DNA đích có vài nucleotide sai khác so với crRNA [1, 2] Nhằm giảm thiểu khả nhận biết sai vị trí (off target) phức hệ Cas9/sgRNA, trình tự crRNA tiếp tục phân tích cơng cụ CRISPR phần mềm Benchling để dự đốn tính đặc hiệu trình tự crRNA Các crRNA có điểm đặc hiệu cao trì hoạt tính tính đặc hiệu phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa DNA Waxy cao so với trình tự crRNA cịn lại Kết phân tích bảng 4.1 cho thấy, crRNA−1 crRNA−2 có điểm đặc hiệu >0.5 lựa chọn để tiếp tục phân tích Để hạn chế ảnh hưởng tiêu cực xảy trường hợp nhận biết sai vị trí phức hệ chỉnh sửa gen, yếu tố khác cần quan tâm trình tự Nu gần giống với trình tự crRNA khơng nên nằm trùng hay gần với vùng mã hóa gen Do đó, trình tự vị trí xác hệ gen lúa đoạn DNA gần giống với crRNA chọn tiếp tục xác định phần mềm CCTop 24 Bảng 2: Trình tự crRNA chỉnh sửa DNA Wx−KD 18 Tên Trình tự đoạn DNA giống/gần giống crRNA hệ gen lúa Vị trí nhận biết Khoảng cách đến Exon gần Mã số gen đích crRNA–1 TGAGGCGA[TTGAACTCGTGG] – 80128 Os10g0152801 TGAGCTCC[TGGATCTCGTGG] – 1994 Os01g0269800 TGAGCTCC[TGGATCTCGTGG] − 5410 Os01g0269550 TGAGGCAG[TGGAGCCGGTGG] – 402 Os10g0470100 TGAGGCAG[TGGAGCCGGTGG] − 1483 Os01g0804150 TGAGGCCA[AGGAACCCGTCG] − 1171 Os10g0404566 GTCCTCAA[CGTCGTCTTCGT] − 1222 Os12g0601800 crRNA−2 GTCCTCAA[CGTCGTCTTCGT] − 1592 Os08g0108925 GTCCTCAA[CGTCGTCTTCGT] − 2472 Os06g0166900 Ghi chú: Chữ ngoặc [] thể trình tự tương đồng với vùng lõi (12 nu) crRNA; chữ in đậm thể vị trí sai khác so với vị trí Nu tương ứng sgRNA; (–):khơng thuộc vùng exon hay intron Kết phân tích cho thấy crRNA−1, crRNA−2 có số trình tự DNA tương đồng hệ gen lúa (Bảng 4.1) Trong đó, tất trình tự tương đồng với crRNA−1 crRNA−2 nằm cách xa vùng mã hóa (Exon) gen chức (Bảng 4.1); đồng thời khơng có trình tự tương đồng nằm Exon gen mã hóa protein nên có khả gây ảnh hưởng đế hoạt động chức tế bào xảy đột biến sai vị trí mong muốn (off-target) Bên cạnh đó, trình tự DNA tương đồng với crRNA–1 crRNA–2 có Nu sai khác, crRNA−1 có Nu sai khác, crRNA−2 có Nu sai khác nằm vùng lõi (seed region) crRNA nên có khả xảy đột biến sai Như vậy, tổng hợp kết phân tích dự đốn cấu trúc tính đặc hiệu xác định crRNA sử dụng cho nghiên cứu gây đột biến chỉnh sửa Waxy theo chế ghép nối điểm cuối không tương đồng NHEJ hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9, bao gồm: crRNA–1, crRNA-2 gây đột biến gen Waxy giống lúa KD 18 Nhiều nghiên cứu tiến hành tối ưu quy tắc để thiết kế trình tự crRNA củng cố sở liệu họ tracrRNA họ gen Cas9 để tối ưu hóa 25 hệ thống CRISPR/Cas9 [29, 30] Bên cạnh đó, nhiều phần mềm tin sinh thiết lập cho phép thiết kế sgRNA cho đối tượng nghiên cứu, phân tích khả nhắm mục tiêu sgRNA… [31, 32] Qua nhà nghiên cứu dễ dàng thiết lập cơng cụ chỉnh sửa hệ gen đối tượng sinh vật Trong nghiên cứu này, công cụ tin sinh học sử dụng để xác định crRNA hiệu quả/đặc hiệu cho việc gây đột biến Wx−KD 18 công nghệ CRISPR/Cas9 Kết sở cho nghiên cứu tạo cấu trúc chỉnh sửa Wx−KD 18 phục vụ mục tiêu kiểm soát hàm lượng amylose giống lúa KD 18 4.3.Thiết kế cấu trúc biểu crRNA chỉnh sửa gen Wx−KD 18 Hệ vector mang cấu trúc biểu gRNA pENTR4 sau cắt enzym cắt giới hạn vị trí BtgZI BsaI chèn thêm crRNA thiết kế Lần lượt ghép nối crRNA−1 crRNA−2 vào vị trí vector cắt biến nạp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α Thể biến nạp khuẩn lạc màu trắng xuất môi trường chọn lọc có bổ sung chất kháng sinh kana sàng lọc để kiểm tra có mặt plasmid tái tổ hợp mang đoạn cần nhân Đối với thí nghiệm ghép nối crRNA−1 vào vị trí cắt BtgZI, mồi BtgZI−gRNA1–Rw thiết kế chứa trình tự crRNA−1 đầu 5’ bổ sung trình tự cắt enzym BtgZI (Bảng 2.2) với mục đích chèn thêm trình tự crRNA−1 vào vị trí cắt enzym BtgZI pENTR4/gRNA (Hình 4.3) Kết điện di sản phẩm cắt vector pENTR4 enzym cắt giới hạn BtgZI cho thấy có băng kích thước 3,2kb (Hình 4.3, giếng 2) phù hợp với kích thước lí thuyết vector pENTR4 Hình 3: Cắt giới hạn pENTR4 enzym cắt giới hạn BtgZI 26 Ghi chú: Sản phẩm cắt giới hạn điện di gel agarose 1%; giếng M: Marker 1Kb, giếng 1: plasmid pENTR4 nguyên bản, giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn pENTR4 BtgZI Sau có khuẩn lạc biến nạp, tiến hành PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi pENTR4−Fw/BtgZI−gRNA1−Wx−Rv Kết điện di sản phẩm gel agarose 1% cho thấy xuất băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,55 kb (Hình 4.4, giếng 1) tương ứng với kích thước tính tốn lý thuyết Ngược lại, sản phẩm phản ứng đối chứng âm (với khuôn khuẩn lạc không biến nạp DNA) khơng thu băng DNA (Hình 4.4, giếng 2) Kết cho phép bước đầu kết luận thu nhận khuẩn lạc dương tính có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn pENTR4/crRNA1−Wx Hình 4: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pENTR4/crRNA1−Wx Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi pENTR4−Fw/BtgZI−gRNA1−Wx−Rv điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 1: khuẩn lạc biến nạp pENTR4/gRNA1−Wx; đối chứng âm (khuẩn lạc không biến nạp DNA) Một khuẩn lạc trắng có kết PCR dương tính sau chọn ngẫu nhiên để nuôi cấy, tách chiết DNA plasmid kiểm tra phương pháp PCR cắt enzyme giới hạn (Hình 4.5) Kết điện di gel agarose 1% hình 4.5 A cho thấy sản phẩm PCR từ khuôn plasmid với cặp mồi pENTR4−Fw/pENTR4−Rv cho băng DNA có kích thước khoảng 1,4 kb (Hình 4.5 A, giếng 1), sản phẩm 27 PCR với cặp mồi BtgZI−Wx−gRNA1−Fw/Ter−R U6.1−F (gRNA1−Fw)/BtgZI−Wx−gRNA1−Rv; (gRNA2−Rv) đặc hiệu cho vector pENTR4−crRNA1−Wx) cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,45 kb 0,6 kb (Hình 4.5, giếng 3,5), phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn DNA cần nhân Tương tự, kết điện di sản phẩm cắt giới hạn plasmid pENTR4/crRNA1−Wx BamHI (có vị trí cắt tren vector pENTR4/crRNA1−Wx) (Hình 4.5 B, giếng 2) cho băng DNA có kích thước khoảng 3,2 kb tương ứng với vector pENTR4/crRNA1−Wx mạch thẳng Ngoài ra, sản phẩm cắt giới hạn vector pENTR4 enzym BamHI (có vị trí nhận biết pENTR4) thu băng DNA với tính toán theo lý thuyết, vector bị cắt thành mảnh có kích thước khoảng 2,9 kb 0,35 kb xấp xỉ kích thước lí thuyết (Hình 4.5 B, giếng 4) Các kết thu cho phép khẳng định chắn việc ghép nối thành công đoạn trình tự crRNA1−Wx vào vector pENTR4/gRNA Hình 5: PCR cắt giới hạn vector pENTR4/crRNA1−Wx Ghi chú: Sản phẩm PCR cắt giới hạn pENTR4/crRNA1−Wx điện di gel agarose 1% (A) PCR plasmid tái tổ hợp; giếng M: Marker 1Kb; giếng 1−2: mồi pENTR4−Fw/pENTR4−Rv; giếng 3−4: mồi U6.1−F/BtgZI−Wx−gRNA1−Rv; giếng 5-6:mồi BtgZI−Wx−gRNA1−Fw/Ter−Rv; giếng 2,4,6: ĐC (−), khuôn H O; giếng 1, 3, 5: khuôn vector pENTR/crRNA1−Wx; (B) Cắt plasmid tái tổ hợp enzym cắt giới hạn; Giếng M: Marker 1Kb; gếng 1: pENTR4/gRNA1−Wx nguyên bản; giếng 2: 28 pENTR4/gRNA1−Wx cắt enzym BamHI; giếng 3: pENTR4 nguyên bản; giếng 4: pENTR4 cắt enzym BamHI Sau có vector pENTR4/crRNA1−Wx, tiếp tục chèn crRNA−2 vào vị trí cắt BsaI hệ vector pENTR4 Kết điện di vector enzym BsaI gel agarose 1% cho kích thước 3,2kb tương ứng với kích thước cắt giới hạn enzym BamHI Sau biến nạp, khuẩn lạc màu trắng xuất PCR cặp mồi BtgZI−gRNA1−Wx Fw/BsaI−gRNA2−Wx −Rv để kiểm tra có mặt plasmid tái tổ hợp pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx Kết điện di gel agarose 1% cho thấy có băng kích thước 0,45 kb (Hình 4.6 , giếng 2,3) tương ứng với kích thước lý thuyết đoạn DNA cần nhân Đồng thời, đối chứng âm không chứa vector pENTR4/gRNA1−gRNA2−Wx không cho băng Như vậy, chúng tơi thu khuẩn lạc mang đoạn vector Hình 6: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx Ghi chú: Giếng M: Marker 1Kb; giếng 1: ĐC (−); giếng 2−3: Khuôn khuẩn lạc biến nạp pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx Sau có khuẩn lạc mang vector pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx, tiếp tục tiến hành tách plasmid kiểm tra cặp mồi khác Kết điện di gel agarose 1% với khuôn vector pENTR4/gRNA1−gRNA2−Wx cho thấy, với cặp mồi BsaI−Wx−gRNA2−Fw/Ter−R; BtgZI−gRNA1−Wx−Fw/BsaI−gRNA2−Wx−Rv; U6.1−Fw/BtgZI−gRNA1−Wx−Rv đặc hiệu cho vector pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx cho băng sáng với kích thước 0,19kb; 0,44kb; 0,36kb (Hình 4.7 A, giếng 1, 3, phù hợp với đoạn kích thước lí thuyết đoạn 29 DNA cần nhân Như vậy, đoạn DNA mong muốn (chứa cấu trúc biểu RNA chèn thêm trình tự crRNA−1và crRNA−2) khuếch đại thành công kỹ thuật PCR từ vật liệu ban đầu vector pENTR4/gRNA Hình 7: PCR cắt giới hạn vector pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx Ghi chú: : Sản phẩm PCR cắt giới hạn pENTR4/crRNA1− crRNA2−Wx điện di gel agarose 1%.; (A) Sản phẩm PCR; Giếng M: Marker 1Kb; giếng 1−2: Mồi BsaI−Wx−gRNA2−F/Ter−R; BtgZI−gRNA1−Wx−Fw/BsaI−gRNA2−Wx−Rv; giếng giếng 3−4: 5−6: Mồi Mồi U6.1−F/BtgZI−gRNA1−Rv; giếng 1, 3, 5: Khuôn vector pENTR4/crRNA1/crNRA2 Wx; giếng 2, 4, 6: ĐC (−), khuôn H O; (B) Sản phẩm cắt giới hạn vector pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx; giếng 1: pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx nguyên bản; giếng 2: vector pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx cắt enzym HindIII; Giếng M: Marker 1Kb 4.4 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa gen Wx−KD 18 Hệ thống CRIPSR/Cas phát lần vi khuẩn vi khuẩn cổ với khả làm suy giảm chất ngoại sinh Hệ thống sau phát triển để trở thành công cụ chỉnh sửa hệ gen ứng dụng rộng rãi nhiều đối tượng sinh vật với mục đích khác nhau, ví dụ tạo đột biến gen, điều hòa phiên mã, chèn gen ngoại lai, bất hoạt (knock–out) gen… [5] Tuy nhiên, nghiên cứu chỉnh sửa gen thực vật sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 khiêm tốn so với nghiên cứu tương tự đối tượng động vật, vi khuẩn Năm 2013, ba 30 nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời công bố kết nghiên cứu sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen thực vật [24, 25, 10] Sau đó, hàng loạt nghiên cứu chứng minh hiệu tiềm công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen mơ hình ngũ cốc Trong nghiên cứu này, với mục tiêu chỉnh sửa gen Waxy hệ thống CRISPR/Cas9 Hai vector pENTR4/crRNA1−crRNA2−Waxy pCas9 sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng Gateway (mục 3.2.10) Hỗn hợp phản ứng Gateway sau biến nạp vào tế bào E coli DH5α Các thể biến nạp xuất mơi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh spectinomycin sàng lọc PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI−gRNA1−Wx−Fw/BsaI−gRNA2−Wx−Rv (đặc hiệu cho cấu trúc chứa crRNA−1 crRNA−2) Kết thu cho thấy số sản phẩm PCR từ khuẩn lạc điện di gel agarose 1% cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,45 kb (Hình 4.8, giếng 2−6) tương ứng với kích thước theo lý thuyết bao gồm đoạn cấu trúc.Tương tự, phản ứng đối chứng dương (khuôn vector pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx) cho sản phẩm chứa băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,45 kb (Hình 4.8, giếng 2) với kích thước theo tính tốn lý thuyết Ngược lại, phản ứng đối chứng âm (khuôn khuẩn lạc không biến nạp vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx) không cho sản phẩm DNA Kết chứng tỏ thể biến nạp thu mang vector tái pCas9/gRNA1−gRNA2−Wx Hình 8: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx 31 tổ hợp Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI−gRNA1−Wx−Fw/BsaI−gRNA2−Wx−Rv điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 1: đối chứng âm (khuẩn lạc không biến nạp vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx; giếng 2: đối chứng dương: khuôn pENTR4/crRNA1−crRNA2−Wx; giếng – 7: khuôn khuẩn lạc biến nạp vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx Sau có khuẩn lạc dương tính mang cấu trúc pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx, ni tách plasmid kiểm tra có mặt đoạn DNA đích phương pháp PCR phương pháp xử lý với enzyme cắt giới hạn Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tinh cặp mồi U6.1−Fw/BtgZI−gRNA1−Wx−vR; BsaI−gRNA2−Wx−Fw/Ter−Rv (đặc hiệu cho cấu trúc chứa crRNA−1 crRNA−2) cặp mồi Ubi−Fw/Cas9−t−Rv (đặc hiệu cho vector pCas9) điện di gel agarose 1% cho băng DNA có kích thước khoảng 0,36 kb; 0,19 kb 0,44 kb (Hình 4.9 A, giếng 2, 4, 6) Kích thước băng DNA thu hoàn toàn phù hợp với kích thước theo tính tốn lý thuyết đoạn DNA cần nhân Mặt khác, xử lý plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn HindIII, kết điện di cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,94 kb 2,5 kb 15,8 kb (Hình 4.9 B, giếng 4) tương ứng với kích thước cấu trúc chứa crRNA−1 crRNA−2 khung vector pCas9 Các kết chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx thu có mang đồng thời cấu trúc biểu gen Cas9 (điều khiển promoter Ubiquitin) cấu trúc biểu gRNA−crRNA1−Wx gRNA−crRNA2−Wx (được điều khiển promoter U6.1 U6.2) Hình 9: : PCR cắt giới hạn vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx 32 Ghi chú: Sản phẩm PCR cắt giới hạn điện di gel agarose 1% (A) PCR vector tái tổ hợp; giếng 2: PCR với cặp mồi U6.1−Fw/BtgZI− gRNA1−Wx−Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi BsaI −gRNA2−Wx−Fw/Ter−Rv; giếng 5−7: PCR với cặp mồi Ubi−Fw/Cas9−t−R; giếng 1, 3, : đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2, 4, 6: khuôn vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx; giếng 7: Đối chứng dương (khuôn pCas9) (B) Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn; ; Giếng 1: vector pCas9 nguyên bản; giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn vector pCas9 HindIII giếng 3: vector pCas9/gRNA1−gRNA2−Wx nguyên bản; giếng 4: sản phẩm cắt giới hạn pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx HindIII Giếng M: thang chuẩn DNA kb 4.5 Biến nạp vector biểu vào A tumerfaciens LBA4404 Để tạo vật liệu phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen vào lúa, vector pCas9/gRNA1−gRNA2−Wx biến nạp vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens LBA4404 phương pháp xung điện Bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc sử dụng cặp mồi BtgZI−gRNA1−Wx−Fw/BsaI−gRNA2−Wx−Rv, số dòng tế bào vi khuẩn A tumefaciens có mang Ti–plasmid chứa cấu trúc chèn guide1 guide2 xác định Cụ thể, sản phẩm PCR với khuôn khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx cho băng DNA có kích thước khoảng 0,45 kb điện di (Hình 4.10, giếng 3–7), với kích thước theo tính tốn lý thuyết, tương tự sản phẩm PCR đối chứng dương sử dụng khn vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx (Hình 4.10, giếng 2) Ngược lại, sản phẩm PCR từ vi khuẩn A tumefaciens không biến nạp vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx không thu DNA (Hình 4.10, giếng 1) Hơn nữa, PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi Ubi−Fw/Cas9−t−R cho băng cho kích thước 0,44 kb (Hình 4.10, giếng 9-14), đối chứng dương sử dụng vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx với kích thước tính tốn lí thuyết Dựa kết này, kết luận vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx biến nạp thành công vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens Các thể biến nạp có kết PCR dương tính bảo quản để sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen vào giống lúa KD 18 sau 33 Hình 10: PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI−gRNA1− Wx−Fw/BsaI−gRNA2−Wx−Rv Ubi−Fw/Cas9−t−R điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 1−7: PCR khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI−gRNA1−Wx−Fw/BsaI−gRNA2−Wx−Rv; giếng 8−14: PCR khuẩn lạc với cặp mồi Ubi−Fw/Cas9−t−Rv; giếng 1,8: đối chứng âm (khuẩn lạc không biến nạp DNA); giếng 2,9: đối chứng dương (khuôn vector pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx); giếng 3−7, 10−14: khuôn khuẩn pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx 34 lạc biến nạp vector PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết đưa kết luận sau: Đã phân lập giải trình tự đầy đủ đoạn gen mục tiêu Waxy liên quan đến kiểm soát hàm lượng amylose giống lúa Khang dân 18 Vùng trình tự phân lập dài 1,2 kb, có độ tương đồng 100% so với Waxy giống Shuhui 498 (Indica, mã số CP018162.1) Nipponbare (Japonica, mã số AP014962.1) công bố GenBank Đã thiết kế crRNA (20 Nu) phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa gen Waxy giống lúa KD công nghệ CRISPR/Cas9 Thiết kế cấu trúc biểu gRNA chỉnh sửa gen mục tiêu liên quan đến trình sinh tổng hợp amylose giống lúa KD 18 Vector chuyển gen thực vật mang pCas9/crRNA1−crRNA2−Wx cấu trúc biểu phức hệ gRNA chỉnh sửa đồng thời hai vị trí crRNA−1 crRNA−2 thiết kế thành công Vector tái tổ hợp kiểm tra PCR, cắt enzyme giới hạn giải trình tự Nu Đã tạo chủng vi khuẩn A tumerfaciens LBA4404 tái tổ hợp mang cấu trúc biểu phức hệ CRISPR chỉnh sửa gen Waxy làm giảm hàm lượng amylose giống lúa Khang dân 18 5.2 Kiến nghị Trên sở kết luận thu được, đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen Wx−KD 18 vào giống lúa Khang dân 18 Từ xác định có mặt cấu trúc biểu phức hệ chỉnh sửa gen Wx−KD 18 PCR Các dịng lúa chuyển gen tiếp túc phân tích sâu đặc điểm kiểu gen kiểu hình để chứng minh khả hoạt động cấu trúc thiết kế 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arora L., Narula A (2017), “Gene editing and crop improvement using CRISPR–Cas9 system”, Frontiers in Plant Science, 8, pp 1932 Bortesi L., Fischer R (2015), “The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond”, Biotechnology Advances, 33(1), pp 41–52 Chen H., Lin Y J., Zhang Q F (2011), “Review and prospect of transgenic rice research”, Chinese Science Bulletin, 54(22), pp 4049–4068 Farasat I., Salis H M (2016), “A biophysical model of CRISPR/Cas9 activity for rational design of genome editing and gene regulation”, PLoS Computational Biology, 12(1), pp e1004724 Liu X., Wu S., Xu J., Sui C., Wei J., (2017), “Application of CRISPR/Cas9 in plant biology”, Acta Pharmaceutica Sinica B, 7(3), pp 292–302 Ma X., Zhang Q., Zhu Q., Liu W., Chen Y., Qiu R., Wang B., Yang Z., Li H., Lin Y., Xie Y., Shen R., Chen S., Wang Z., Chen Y., Guo J., Chen L., Zhao X., Dong Z., Liu Y G (2015), “A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants”, Molecular Plant, 8(8), pp 1274–1284 Pogulis R J., Vallejo A N., Pease L R (2000), “Recombination and mutagenesis by overlap extension PCR”, The Nucleic Acid Protocols Handbook, pp 857–864 Prykhozhij S V., Rajan V., Gaston D., Berman J N (2015), “CRISPR multitargeter: a web tool to find common and unique CRISPR single guide RNA targets in a set of similar sequences”, PLoS One, 10(3), pp e0119372 Rousseau C., Gonnet M., Le–Romancer M., Nicolas J (2009), “CRISPI: a CRISPR interactive database”, Bioinformatics, 25, pp 3317–3318 10 Shan Q., Wang Y., Li J (2013), “Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR–Cas system”, Nature Biotechnology, 31, pp 686–688 11 Sun Y, Jiao G, Liu Z, et al Generation of High-Amylose Rice through CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis of Starch Branching Enzymes Front Plant Sci 2017;8:298 Published 2017 Mar 12 Tsaftaris A S., Polidoros A N., Karavangeli M., Nianiou–Obeidat I., Madesis P., Goudoula C (2000), “Biological resource management–connecting science and policy”, Transgenic crops: recent developments and prospects, Springer, pp 187–203 13 Tzfira T., Citovsky V (2007), Agrobacterium: From biology to biotechnology, Springer, Berlin 14 Wang K (2007), Agrobacterium Protocols, 2nd ed., in Methods Mol Biol., Humana Press, New Jersey 15 Weeks D P., Yang B (2017), Gene Editing in Plants, Academic Press, California 36 16 Zhang J, Zhang H, Botella JR, Zhu JK Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the Waxy gene in elite rice varieties J Integr Plant Biol 2018;60(5):369-375 17 Jun Li, Yan Li, and Ligeng Ma, CRISPR/Cas9-Based Genome Editing and its Applications for Functional Genomic Analyses in Plants, Small Methods 2019, 1800473 18 Ma X., Zhu Q., Chen Y., Liu Y G (2016), “CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: Developments and applications”, Molecular Plant, 9(7), pp 961–974 19 Tsaftaris A S., Polidoros A N., Karavangeli M., Nianiou–Obeidat I., Madesis P., Goudoula C (2000), “Biological resource management–connecting science and policy”, Transgenic crops: recent developments and prospects, Springer, pp 187–203 20 Ali Razzaq et al., Modern Trends in Plant Genome Editing: An Inclusive Review of the CRISPR/Cas9 Toolbox, Int J Mol Sci 2019, 20, 4045 21 Liang G., Zhang H., Lou D., Yu D (2016), “Selection of highly efficient sgRNAs for CRISPR/Cas9–based plant genome editing”, Scientific Reports, 6, pp 21451 22 Jobling S Improving starch for food and industrial applications Curr Opin Plant Biol 2004;7:210–218 doi: 10.1016/j.pbi.2003.12.001 23 Sun Y., Li J., Xia L (2016a) Precise genome modification via sequence-specific nucleases-mediated gene targeting for crop improvement Front Plant Sci 7:1928 10.3389/fpls.2016.01928 24 Li J., Norville J E., Aach J., McCormack M., Zhang D., Bush J., Church G M., Sheen J (2013), “Multiplex and homologous recombination–mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9”, Nature Biotechnology, 31, pp 688–691 25 Nekrasov V., Staskawicz B., Weigel D., Jones J.D., Kamoun S (2013), “Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA–guided endonuclease”, Nature Biotechnology, 31(8), pp 691–693 26 Tổ chức Nông lương [FAO] (2004) Năm quốc tế lúa gạo (Trực tuyến) Có tại: http://www.fao.org/rice2004/en/rice-us.htm (truy cập ngày 12 tháng năm 2021) 27 Smith L M., Sanders J Z., Kaiser R J., Hughes P., Dodd C., Connell C R., Heiner C., Kent S B., Hood L E (1986), “Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis”, Nature, 321(6071), pp 674–679 28 Jun Li, Yan Li, and Ligeng Ma, CRISPR/Cas9-Based Genome Editing and its Applications for Functional Genomic Analyses in Plants Small Methods 2019, 1800473 29 Chylinski K., Le Rhun A., Charpentier E (2013), “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR–Cas immunity systems”, RNA Biology, 10(5), pp 726–37 30 Gao Z., Herrera–Carrillo E., Berkhout B (2018), “Improvement of the CRISPR–Cpf1 system with ribozyme–processed crRNA”, RNA Biology, 15(12), pp 1458–1467 31 Farasat I., Salis H M (2016), “A biophysical model of CRISPR/Cas9 activity for rational design of genome editing and gene regulation”, PLoS Computational Biology, 12(1), pp e1004724 37 32 Prykhozhij S V., Rajan V., Gaston D., Berman J N (2015), “CRISPR multitargeter: a web tool to find common and unique CRISPR single guide RNA targets in a set of similar sequences”, PLoS One, 10(3), pp e0119372 33 Chen L Q., Qu X Q., Hou B H., Sosso D., Osorio S., Fernie A R., Frommer W B (2012), “Sucrose efflux mediated by SWEET proteins as a key step for phloem transport”, Science, 335(6065), pp 207–211 34 Adélaïde Raguin, Oliver Ebenhöh (2017), “Design starch: stochastic modeling of starch granule biogenesis”, Biochem Soc Trans 45(4): 885–893 38