Nghiên cứu xác định điểm đa hình gen cyld và otubain 1 trên bệnh nhân bạch cầu tủy cấp (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐA HÌNH GEN CYLD VÀ OTUBAIN TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU TỦY CẤP HÀ NỘI, 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐA HÌNH GEN CYLD VÀ OTUBAIN TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU TỦY CẤP Họ tên sinh viên Mã sinh viên Lớp Giảng viên hướng dẫn : Phạm Ngọc Duy : 620479 : K62CNSHB : TS Nguyễn Thị Xuân ThS Nguyễn Thanh Huyền HÀ NỘI, 2021 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan luận văn khóa luận tốt nghiệp em thời gian qua Những số liệu kết nghiên cứu trung thực,hoàn toàn thực Phịng Hệ gen học miễn dịch Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn nguồn thích rõ ràng Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước môn, khoa nhà trường cam đoan LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Xuân, Phòng Hệ gen học miễn dịch, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nguời huớng dẫn, bảo tận tình suốt q trình tơi thực luận án Đó tảng, hành trang giúp em tự tin vững bước đường khoa học sau Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, cô Th.S Nguyễn Thanh Huyền, thầy cô khoa Công nghệ sinh học không truyền thụ cho em nhiều kiến thức chun mơn mà cịn giúp em bồi đắp lịng say mê, nghiêm túc, tính cẩn thận nghiên cứu khoa học Em xin trân trọng cảm ơn anh chị: Anh Nguyễn Hoàng Giang, chị Đỗ Thị Trang, chị Bùi Kiều Trang Phòng Hệ gen học miễn dịch, số anh chị khác Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam hướng dẫn tận tình cho em làm thí nghiệm phương pháp thực nghiệm trình bày kết quả, anh chị động viên dành cho em nhiều lời khuyên quý báu trong suốt thời gian làm luận án Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy phịng Đào tạo học viện Nơng nghiệp Việt Nam nói chung, khoa Cơng nghê sinh học nói riêng ln hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập thực luận án Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen, tạo điều kiện động viên giúp đỡ để em hoàn thành tốt nhiệm vụ làm luận án tốt nghiệp Với tất lịng biết ơn, em xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè đặc biệt bố mẹ em tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn suốt thời gian qua, giúp tơi hồn thành tốt luận án MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU ………………………………………………………………1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan bệnh bạch cầu 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Phân loại bệnh bạch cầu 2.1.3 Nguyên nhân gây bệnh 2.2 Bệnh bạch cầu tủy cấp 2.2.1 Định nghĩa nguyên nhân bệnh bạch cầu tủy cấp 2.2.2 Triệu chứng bệnh bạch cầu tủy cấp 2.3 Cấu trúc chức gen CYLD OTUB1 2.3.1 Gen CYLD 2.3.2 Gen otubain 11 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Nguyên liệu 12 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 3.1.2 Các cặp mồi cho phản ứng PCR 13 3.1.3 Hóa chất 13 3.1.4 Trang thiết bị 14 3.2 Phương pháp 14 3.2.1 Tách chiết DNA từ máu người 14 3.2.2 Phương pháp điện di DNA gel agarose 15 3.2.3 Phương pháp định lượng DNA máy quang phổ 15 3.2.4 Nhân đoạn DNA phản ứng PCR 16 3.2.5 Tinh sản phẩm PCR 18 3.2.6 Giải trình tự 19 3.2.7 Xác định đa hình/đột biến điểm 19 3.2.8 Phương pháp phân tích thống kê 19 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân BCTC người khỏe mạnh 21 4.2 Kết phân tích tần số điểm đa hình gen CYLD Otubain1 21 4.2.1 Nhân trình tự nucleotide đoạn gen CYLD Otubain1 21 4.2.2 Xác định trình tự đoạn gen CYLD 23 4.3 Xác định trình tự đoạn gen Otubain 25 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25 5.1 Kết luận 25 5.2 Kiến Nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Bệnh bạch cầu với tế bào bạch cầu máu tăng cao Hình 2: Hình ảnh tế bào hồng cầu (đỏ) bạch cầu (trắng) động mạch Hình 3: Một số triệu chứng bạch cầu cấp dịng tủy Hình 4: Hình ảnh chuỗi sợi gen CYLD Hình 5: Vị trí nhiễm sắc thể số 16 gen CYLD Hình 6: Cấu trúc gen CYLD Hình 7: Vị trí nhiễm sắc thể số 11 gen otubain1 Hình 8: Ảnh điện di đồ sản phẩm DNA tổng số gel agarose Hình 9: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen CYLD gel agarose Hình 10: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen Otubain1 gel agarose Hình 11: Trình tự nucleotide gen CYLD điểm đa hình c.2483+53G>A Hình 12: Trình tự nucleotide gen CYLD điểm đa hình c.2483+121G>A CHỮ VIẾT TẮT BCTC: Bạch cầu tủy cấp SNP: single-nucleotide polymorphism CYLD: Cylindromatosis OTUB1:Otubain1 PCR: Polymerase Chain Reaction PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ung thư nhóm bệnh liên quan đến việc tăng sinh tế bào cách kiểm soát tế bào có khả xâm lấn mơ khác cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận di chuyển đến phận khác thể (di căn) Không phải tất khối u ung thư, có số khối u thuộc vào nhóm lành tính, tức khối u khơng xâm lấn phận khác thể Một số dấu hiệu triệu chứng khối u ác tính bao gồm chảy máu bất thường, ho kéo dài không rõ nguyên nhân, sụt cân bất thường đại tiểu tiện Mặc dù triệu chứng dấu hiệu ung thư, chúng có nguyên nhân khác Hiện có khoảng 100 loại ung thư ảnh hưởng đến sống người Việc sử dụng thuốc nguyên nhân gây 22% số ca tử vong ung thư Ngồi cịn có thêm 10% khác béo phì, ăn, lười vận động sử dụng thức uống có cồn mức Một số nguyên nhân khác ung thư bao gồm số dạng phơi nhiễm, tiếp xúc với xạ ô nhiễm môi trường Ở nước phát triển, gần 20% bệnh ung thư phơi nhiễm với vi khuẩn virus Helicobacter pylori, viêm gan B, viêm gan C, virus Epstein–Barr, nhiễm virus papilloma người HIV Các nhân tố tác động cách, góp phần, làm thay đổi gen tế bào Thơng thường, tế bào cần tích lũy lượng không nhỏ biến đổi gen trước phát triển thành ung thư Cũng có khoảng 5-10% bệnh ung thư di truyền khuyết tật gen từ gia đình Ung thư thường phát nhờ vào dấu hiệu triệu chứng từ tầm soát ung thư Những kết tầm soát ban đầu thường đánh giá kỹ chẩn đốn hình ảnh xác nhận sinh thiết Bệnh bạch cầu tủy cấp loại ung thư máu xảy lứa tuổi, thường gặp người trưởng thành Hơn nửa bệnh nhân bạch cầu dòng tủy phát 60 tuổi, với tuổi mắc bệnh trung bình bệnh nhân 64 Bệnh bạch cầu cấp thường có triệu chứng điển hình Việc điều trị cho bệnh nhân bạch cầu cấp chủ yếu thực biện pháp hóa trị xạ trị Tuy nhiên tỷ lệ lui bệnh sau hóa trị liệu thời gian ổn định bệnh giảm, đồng thời tác dụng phụ việc điều trị lại tăng đáng kể người bệnh lớn tuổi Cụ thể là, sau hóa trị liệu bệnh nhân lớn tuổi có tỷ lệ lui bệnh đạt khoảng 20 – 50%, người trẻ tuổi 70 – 80%; Hơn nữa, thời gian ổn định bệnh bệnh nhân 60 tuổi nửa so với người bệnh trẻ tuổi Hiện nay, bệnh ung thư nói chung bệnh bạch cầu cấp nói riêng nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn giới Theo thông kê gần rằng, tỷ lệ người mắc bệnh bạch cầu cấp ngày tăng, với việc điều trị bệnh lý gặp nhiều khó khăn Các nhà khoa học giới Việt Nam tập trung nghiên cứu sử dụng nhiều kỹ thuật khác phục vụ công tác chẩn đoán điều trị bệnh hiệu nhất, có nghiên cứu xác định số đột biến gen liên quan đến bệnh bạch cầu tủy cấp 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài Xác định tần suất allen số điểm đa hình đơn nucleotide (SNP) gen CYLD gen Otubain liên quan đến bệnh bạch cầu tủy cấp người Việt Nam PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan bệnh bạch cầu 2.1.1 Định nghĩa Bệnh bạch cầu, hay bệnh ung thư máu loại ung thư ác tính Bệnh xảy lượng bạch cầu thể người bệnh tăng đột biến Hiện nay, nguyên nhân gây bệnh chưa xác định cụ thể người bệnh sống mơi trường bị nhiễm chất hóa học, chất phóng xạ yếu tố di truyền Khi phát bệnh, tế bào bạch cầu tích tụ nhiều tủy xương khiến cho tất bạch cầu, hồng cầu tiểu cầu khơng có vị trí trú ngụ khơng thể phát triển Khi đó, tủy xương khỏe mạnh bị thay tế bào non, cuối tế bào khắp thể Vì vậy, số lượng tế bào cịn non tăng, số lượng hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu giảm bớt Do đó, bệnh nhân ung thư máu có triệu chứng loại tế bào máu Ví dụ, thiếu hồng cầu khiến cho bệnh nhân mệt mỏi xanh xao; Thiếu bạch cầu, bệnh nhân bị nhiễm trùng; Thiếu tiểu cầu, da bệnh nhân bị mẩn đỏ, bầm nhiều chỗ thể, chảy máu mũi Hình 1: Bệnh bạch cầu với tế bào bạch cầu máu tăng cao (Nguồn: Viện sốt rétKý sinh trùng – Quy Nhơn) 2.1.2 Phân loại bệnh bạch cầu Dựa vào tốc độ gây hại loaị tế bào bạch cầu bị ảnh hưởng, bệnh bạch cầu phân loại thành: Bạch cầu cấp tính mạn tính: bệnh bạch cầu cấp phát triển nhanh 3.1.4 Trang thiết bị Tủ lạnh sâu -200C, -840C (Sanyo); Pipetman loại (Gilson); Cân phân tích (Mettler Toledo); Máy đo pH (Mettler); Máy ly tâm (Sorvall, Eppendorf…); Máy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad); Máy chụp ảnh GelDoc (Amersham BioSciences); Máy GeneAmp PCR System 9700 (ABI); Các máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI PRISM Genetic Analyzer (ABI) 3.2 Phương pháp 3.2.1 Tách chiết DNA từ máu người Kit Dneasy blood Hãng sử dụng để tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu Quy trình tách chiết DNA thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Máu chống đông EDTA rửa kỹ để dung giải tế bào hồng cầu lysis buffer Dung dịch SDS proteinase K (Sigma-Aldrich) sử dụng để phá vỡ nhân tế bào bạch cầu phân hủy protein DNA tổng số phân tách kết tủa DNA sau tách chiết đo nồng độ kiểm tra chất lượng trước giữ -20oC Sử dụng kit thương mại (QIAmp DNA Maxi Kit (QIAGEN) tách DNA từ máu để đảm bảo đủ lượng DNA tổng số khoảng 10-30 µg, độ tinh A260/280≥1,8 để tiến hành thí nghiệm cho giải trình tự gen Sử dụng Kit Dneasy blood để tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân Quy trình tách chiết DNA thực theo bước sau: − Lấy mẫu máu cất -20oC ủ tủ ấm 37oC thời gian từ 30 đến 60 phút − Hút 200 μl máu vào ống Eppendorf Bổ sung 200 μl dung dịch BL 20 μl proteinase K Sau đó, trộn vortex pipet − Ủ mẫu 56oC 30 phút Mẫu lắc nhẹ tay thời gian ủ, lần lắc cách 10 phút, ly tâm ngắn − Bổ sung 200 μl ethanol (96-100%) mix pipet vortex − Chuyển toàn mẫu ống eppendorf lên cột Ly tâm 13.000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch lọc ,chuyển Spin Column sang tube ml − Bổ sung 700 μl Buffer WA vào cột lọc Ly tâm 13.000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch lọc va giữ lại Collection tube 14 − Bổ sung 700 μl Buffer WB vào cột lọc Ly tâm 13.000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch lọc đặt cột sang ống Eppendorf 1,5 ml Tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút phút để làm khô màng lọc Bỏ dịch lọc collection tube Bổ sung 50 μl CE vào màng lọc lọc ủ nhiệt độ phịng 3-5 phút ,sau ly tâm 13.000 vòng/phút phút, thu DNA − Sử dụng μl sản phẩm DNA sau tinh để điện di kiểm tra gel agarose 0,8% − Cất mẫu -20oC 3.2.2 Phương pháp điện di DNA gel agarose Các bước tiến hành Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cho 0,8g agarose vào 100 ml đệm TAE 1X, đem đun lị vi sóng agarose tan hoàn toàn Để nguội đến khoảng 40oC đổ dung dịch agarose vào khn điện di cài lược sẵn Bề dày gel khoảng mm thích hợp Sau 30-40 phút agarose polyme hóa hồn tồn điện di Tra mẫu DNA vào giếng điện di: DNA trộn với đệm tra mẫu, sau tra vào giếng gel Mẫu DNA chạy điện di với marker DNA để xác định kích thước phân tử DNA Chạy điện di: Chạy điện di với chương trình: Hiệu điện (U =100 V), cường độ dòng điện (I = 300 mA) Nhuộm DNA: Sau kết thúc điện di, gel lấy nhuộm dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µg/ml khoảng 5-6 phút Sau lấy gel rửa cách ngâm nước khoảng 1-2 phút Quan sát chụp ảnh: Bản gel quan sát ánh sáng tử ngoại UV 254 nm chụp ảnh hệ thống chụp ảnh gel tự động 3.2.3 Phương pháp định lượng DNA máy quang phổ - Lấy µl dung môi (TE pH 8,0 nước khử ion vô trùng) để làm Blank 15 - Sử dụng µl mẫu để xác định nồng độ DNA bước sóng 260 nm 280 nm - Ghi lại kết nồng độ DNA cho mẫu nghiên cứu sau lần đo Phương pháp đo quang phổ kế xác định nồng độ, độ tinh DNA Xác định hàm lượng DNA dung dịch phân tích dựa vào mức độ hấp thụ cực đại ánh sáng tia tử ngoại bước sóng 260 nm base nitơ axit nucleic Giá trị mật độ quang bước sóng 260 nm mẫu đo cho phép xác định nồng độ axit nucleic mẫu Phương pháp xác định độ mẫu phân tích dựa tỉ số OD260/OD280 Mẫu DNA tinh có tỉ số OD260/OD280 ≈ 1.8 Do mẫu DNA đem phân tích có giá trị chấp nhận khoảng từ 1.8 – Nếu mẫu phân tích có tỉ số OD260/OD280 thấp 1.8 mẫu phân tích có thành phần protein, phenol chất mà hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại có bước sóng gần với 260nm 280nm 3.2.4 Nhân đoạn DNA phản ứng PCR Cơ sở lý thuyết PCR PCR phát triển vào năm 1983 Kary Mullis trở nên phổ biến toàn giới với phát triển xử lý nhiệt PCR cơng cụ có giá trị phổ biến phịng thí nghiệm phân tử PCR phóng đại đoạn DNA lên hàng nghìn đến hàng triệu chuỗi DNA cụ thể Phương pháp liên quan đến việc sử dụng chuỗi DNA ngắn gọi đoạn mồi để chọn phần gen cần khuếch đại Nhiệt độ mẫu nâng lên hạ xuống nhiều lần để giúp enzyme chép DNA chép chuỗi DNA đích Kỹ thuật tạo hàng tỷ chuỗi mục tiêu vài Một chu kỳ phản ứng PCR gồm giai đoạn sau: − Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép ban đầu tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ cao (94-95oC) thời gian ngắn 16 − Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ thích hợp (khoảng 50-60oC), hai mồi oligonucleotide dài từ 15-30 nucleotide bám vào hai đầu đoạn DNA đích theo nguyên tắc bổ sung − Giai đoạn kéo dài chuỗi: Nhiệt độ hỗn hợp phản ứng tăng lên khoảng 70-80oC nhiệt độ thích hợp để Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi, tránh tượng tiếp hợp không đặc hiệu Thành phần phản ứng: − Một mẫu phản ứng PCR tiến hành − Trong tổng thể tích 25 μl gồm có thành phần sau: Thành phần Thể tích (μl) H2O (17,35 – X) Dung dịch đệm (10x) 2,5 dNTP (2,5 mM) 2,5 MgCl (25 mM) 2,0 Mồi xuôi (10 pmol) 0,5 Mồi ngược (10 pmol) 0,5 DNA khuôn X Pfu polymerase 0,15 X thường để mặc định Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: − Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn DNA gen CYLD với cặp mồi (CYLD_F/ CYLD_R) với chu kì 35 vịng sau: 96 độ C- biến tính 94 độ C -biến tính 62 độ C -gắn mồi 17 72 độ C - kéo dài 72 độ C - kéo dài phút 30 giây phút phút 30 giây phút − Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn DNA gen Otubain1 với cặp mồi (OTUB1_F/ OTUB1_R) với chu kì 40 vịng sau: 96 độ C- biến tính 94 độ C -biến tính 62 độ C -gắn mồi 72 độ C - kéo dài 72 độ C - kéo dài phút 30 giây phút phút 30 giây phút 3.2.5 Tinh sản phẩm PCR Quá trình tinh sản phẩm PCR thực theo hướng dẫn Kit E.Z.N.A.® Cycle-Pure hãng Sigma: - - Xác định thể tích sản phẩm PCR cần tinh Hút tồn thể tích sản phẩm PCR sang ống eppendorf 1,5 ml Bổ sung lần thể tích dung dịch CP so với thể tích sản phẩm PCR cần tinh vào ống eppendorf 1,5 ml có sản phẩm PCR Ví dụ, 100 µl sản phẩm PCR cần bổ sung 500 µl dung dịch CP Vortex nhẹ nhàng 20 giây spindown Đặt cột HiBind® DNA lên ống collection ml Chuyển tồn phần dung dịch mẫu lên cột HiBind® DNA ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút thời gian phút nhiệt độ phòng Loại bỏ phần dịch sau ly tâm đặt cột HiBind® DNA trở lại ống collection Bổ sung 700 µl dung dịch DNA Wash ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút thời gian phút nhiệt độ phòng Loại bỏ phần dịch sau ly tâm đặt cột HiBind® DNA trở lại ống collection Bổ sung 700 µl dung dịch DNA Wash ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút thời gian phút nhiệt độ phòng - Loại bỏ phần dịch sau ly tâm đặt cột HiBind® DNA trở lại ống collection - Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút thời gian phút nhiệt độ phịng 18 - Bổ sung 30-50 µl đệm TE nước đề ion, để nhiệt độ phòng thời gian phút Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút thời gian phút nhiệt độ phòng - Sử dụng µl để điện di kiểm tra gel agarose 1% 3.2.6 Giải trình tự Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR máy GenAmp® PCR System 9700 sau: 96oC – phút; (96oC – 10 giây; 50oC – giây; 60oC – phút) x 25 chu kỳ Sau giữ sản phẩm 4oC  Tinh sản phẩm PCR phương pháp EtOH/EDTA Bổ sung vào sản phẩm PCR μl EDTA 125 mM, 60 μl EtOH 100% để hỗn hợp nhiệt độ phịng 15 phút Sau đó, ly tâm 12.000 vịng/phút 15 phút để tủa DNA có Loại bỏ EtOH, rửa tủa 60 μl EtOH 70% Ly tâm 10.000 vịng/phút 10 phút Làm khơ tủa bổ sung 10 μl Hi-DiTM Formamide để biến tính 95oC phút Sau bước này, nguyên liệu đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer Các ống điện di ống vi mao quản 80 cm x 50 μl Kết thu nhận xử lý phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant Data Collection v2.0 DNA Sequencing Analysis 5.2 3.2.7 Xác định đa hình/đột biến điểm Sau thu trình tự nucleotide đoạn gen, đem so sánh chúng với trình tự chuẩn công bố GenBank Kết so sánh trình tự nucleotide gen phân tích thơng qua phần mềm: Bioedit 7.0; Seqscape 2.6 3.2.8 Phương pháp phân tích thống kê Sử dụng phần mềm phân tích R để phân tích thống kê Tần số alen kiểm tra phân bố theo định luật cân Hardy – Weinberg So sánh tần số alen nhóm bệnh nhóm chứng kiểm định Fisher Exact Test 19 Phương trình Hardy-Weinberg Phương trình Hardy-Weinberg phương trình tốn học sử dụng để tính tốn biến đổi di truyền quần thể trạng thái cân Nó nói số lượng biến đổi di truyền quần thể không đổi từ hệ sang hệ khác khơng có yếu tố gây rối loạn Phương trình Hardy-Weinberg biểu thị sau: p2 + 2pq + q2 = q = - p Trong trường hợp đơn giản locus đơn có hai alen kí hiệu A a với tần số f (A) = p f (a) = q, tần số kiểu gen dự kiến f (AA) = p2 thể đồng hợp tử AA, f (aa) = q2 thể đồng hợp tử aa f (Aa) = 2pq thể dị hợp tử Tỷ lệ kiểu gen p2, 2pq q2 gọi tỷ lệ HardyWeinberg Tỉ lệ kiểu gen mong đợi đời sau hệ: f1 (AA) = p2 = f0 (A) f1 (Aa) = 2pq = f0 (A) f0 (a) f1 (AA) = q2 = f0 (a) Kiểm định Chi-square (χ2) phương pháp thống kê sinh học để xác định giống nhau, độc lập ngẫu nhiên tần số mong đợi tần số quan sát Công thức Chi-Square là: Trong “O” biểu thị tần số quan sát “E” biểu thị tần số mong đợi 20 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân BCTC người khỏe mạnh DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân BCTC người khỏe mạnh thực theo hướng dẫn Kit Dneasy blood and tissue hãng Qiagen Sau tách chiết, DNA tổng số xác định nồng độ đánh giá độ phương pháp quang phổ kế bước sóng 260 nm 280 nm Bên cạnh đó, sử dụng kỹ thuật điện di gel agarose để kiểm tra đánh giá sản phẩm DNA tổng số (Hình 8) Hình 8: Ảnh điện di đồ sản phẩm DNA tổng số gel agarose 0,8% 1-17: DNA tổng số 17 mẫu bệnh nhân bạch cầu tủy cấp đại diện Kết quả: Hình cho thấy DNA tổng số mẫu biểu băng sáng, rõ nét không xuất smear Như vậy, DNA tổng số đảm bảo chất lượng nồng độ cho thí nghiệm Sau đó, DNA tổng số sử dụng làm nguyên liệu để phục vụ cho bước nhân đoạn DNA gen CYLD Otubain1 với cặp mồi đặc hiệu kỹ thuật PCR 4.2 Kết phân tích tần số điểm đa hình gen CYLD Otubain1 4.2.1 Nhân trình tự nucleotide đoạn gen CYLD Otubain1 Trong phản ứng khuếch đại trình tự nucleotide gen CYLD Otubain1, nghiên cứu tối ưu nhiệt độ thích hợp cho việc gắn mồi 62 độ C Sau đó, sản phẩm PCR mẫu nghiên cứu tinh trước đem đọc trình tự trực tiếp máy giải trình tự ABI 3500 Kết sản phẩm PCR sau tinh kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 10) Trình tự đoạn gen CYLD exon 14 intron 15 Trình tự đoạn gen Otubain1 exon intron 10 21 Hình 9: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen CYLD gel agarose 0,8% Marker kb plus (Thermo) sản phẩm PCR nhân gen CYLD 16 mẫu bệnh nhân ung thư bạch cầu tủy cấp đại diện Hình 10: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen Otubain1 gel agarose 0,8% Marker kb plus (Thermo) sản phẩm PCR nhân gen Otubain1 27 mẫu bệnh nhân ung thư bạch cầu tủy cấp người khỏe đại diện Kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR nhân gen CYLD Otubain1 thu tất giếng xuất băng DNA đặc hiệu có kích thước 546 572 bp phù hợp với kích thước tính tốn lý thuyết đoạn DNA nhân lên từ gen CYLD Otubain1 Các băng sáng đậm, rõ nét khơng có băng phụ cho thấy chu trình, nồng độ phản ứng lựa chọn phù hợp Sau đó, tồn 22 sản phẩm PCR nhân gen CYLD Otubain1 từ mẫu nghiên cứu tinh để giải trình tự trực tiếp 4.2.2 Xác định trình tự đoạn gen CYLD Để khẳng định xác sản phẩm PCR đoạn gen CYLD, sản phẩm PCR sau tinh tiếp tục xác định trình tự nucleotide Trước tiên, tiến hành đọc trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR gen CYLD mẫu bệnh nhân mẫu người khỏe Sau phân tích so sánh trình tự đoạn gen thu với trình tự GenBank, sản phẩm PCR thu xác đoạn gen CYLD Kết thu đoạn gen có chiều dài 546 bp tương ứng với tính tốn lý thuyết Sau so sánh trình tự đoạn gen với trình tự gen cơng bố GenBank, kết thu vị trí có đa hình gen mẫu bệnh đối chứng Thống kê chi tiết điểm đa hình, tần số liệt kê mô tả Bảng Bảng 1: Thống kê điểm thay đổi nuleotide tần số biến đổi gen CYLD Đa hình gen Mẫu bệnh nhân Mẫu đối chứng c.2483+53G>A 21/25 (84%) 26/52 (50%) c.2483+121G>A 4/25 (16 %) 0/52 (0%) 23 4.2.2.1 Điểm biến đổi c.2483+53G>A Hình 11: Trình tự nucleotide gen CYLD điểm đa hình c.2483+53G>A Hình trên: Trình tự gen CYLD bình thường Hình dưới: Trình tự gen CYLD biến đổi Sau so sánh trình tự thu mẫu bệnh với trình tự chuẩn tìm thấy điểm biến đổi c.2483+53G>A 21/25 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 84% (Hình 11) Tuy nhiên, sau nhân gen, giải trình tự so sánh kết thu mẫu đối chứng nghiên cứu tìm thấy điểm biến đổi mẫu đối chứng người khỏe mạnh với tỷ lệ chiếm 50%, với khác biệt tỷ lệ điểm đa hình mẫu người khỏe mẫu bệnh có ý nghĩa thơng kê (P=0.0067) Vì vậy, điểm biến đổi c.2483+53G>A gen CYLD liên quan đến bệnh BCTC 4.2.2.2 Điểm biến đổi c.2483+121G>A 24 Hình 12 Trình tự nucleotide gen CYLD điểm đa hình c.2483+121G>A Chú thích: Hình trên: Trình tự gen CYLD bình thường Hình dưới: Trình tự gen CYLD biến đổi Trên 25 mẫu bệnh sau phân tích chúng tơi phát có 4/25 bệnh nhân ung thư BCTC có điểm biến đổi c.2483+121G>A gen này, chiếm tỷ lệ 16% (Hình 12) Chúng tơi khơng tìm thấy điểm biến đổi xuất mẫu người khỏe mạnh Hai điểm đa hình phát bệnh nhân BCTC nghiên cứu mới, chưa có nghiên cứu cơng bố hai điểm đa hình gen Các nghiên cứu khác giới có điểm đa hình khác gen CYLD bệnh nhân ung thư máu bệnh ung thư hạch đột biến đoạn nucleotide exon đột biến thay nucleotide exon 10 (Arora M., 2015; Johari T., 2018) 4.3 Xác định trình tự đoạn gen Otubain Để xác định xác sản phẩm PCR đoạn gen Otubain 1, sản phẩm PCR sau tinh tiếp tục xác định trình tự nucleotide mẫu bệnh nhân mẫu người khỏe Sau phân tích so sánh trình tự đoạn gen thu với trình tự GenBank, sản phẩm PCR thu xác đoạn gen Otubain Kết thu đoạn gen có chiều dài 572 bp tương ứng với tính tốn lý thuyết Sau so sánh trình tự đoạn gen với trình tự gen cơng bố GenBank, chúng tơi khơng tìm thấy điểm đa hình đoạn gen Otubain hai loại mẫu bệnh đối chứng PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận + Đã thu thập tách chiết DNA tổng số chất lượng tốt 25 mẫu bệnh nhân BCTC 52 mẫu đối chứng khỏe mạnh + Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn DNA gen CYLD với kích thước 546 bp gen Otubain1 với kích thước 572 bp 25 + Đã tinh sản phẩm PCR nhân đoạn DNA gen CYLD 25 mẫu nghiên cứu xác định tồn trình tự mẫu nghiên cứu Kết phân tích trình tự nucleotide thu hai điểm đa hình chưa cơng bố bao gồm c.2483+53G>A c.2483+121G>A intron 15 gen CYLD với tần số tương ứng nhóm bệnh nhân BCTC (84% 16%) nhóm đối chứng (50% 0%) + Đã tinh sản phẩm PCR nhân đoạn DNA gen Otubain1 25 mẫu nghiên cứu xác định tồn trình tự mẫu nghiên cứu Kết phân tích trình tự nucleotide khơng tìm thấy điểm đa hình đoạn gen Otubain1 phân tích 5.2 Kiến Nghị Phát triển nghiên cứu để tiến hành nghiên cứu bệnh ung thư máu khác với cỡ mẫu lớn mở rộng nghiên cứu thêm số gen khác có liên quan tới bệnh ung thư máu 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ikezoe T, Kojima S, Furihata M, et al Expression of p-JAK2 predicts clinical outcome and is a potential molecular target of acute myelogenous leukemia Int J Cancer 2011; 129:2512-21 Beyar-Katz O, Gill S Novel Approaches to Acute Myeloid Leukemia Immunotherapy Clin Cancer Res 2018; 24:5502-15 Morales ML, Arenas A, Ortiz-Ruiz A, et al MEK inhibition enhances the response to tyrosine kinase inhibitors in acute myeloid leukemia Sci Rep 2019; 9:18630 Binder S, Luciano M, Horejs-Hoeck J The cytokine network in acute myeloid leukemia (AML): A focus on pro- and anti-inflammatory mediators Cytokine Growth Factor Rev 2018; 43:8-15 Arora M, Kaul D, Varma N Functional nature of a novel mutant CYLD observed in pediatric lymphoblastic B-cell leukemia Pediatr Blood Cancer 2015; 62:1066-9 Johari T, Maiti TK Catalytic domain mutation in CYLD inactivates its enzyme function by structural perturbation and induces cell migration and proliferation Biochim Biophys Acta Gen Subj 2018; 1862:2081-9 Khosravi M, Taghvaye Masoumi H, Gholami K, et al The Relationship between Fatigue and Cytokine Levels in Patients with Acute Myeloid Leukemia Int J Hematol Oncol Stem Cell Res 2018; 12:318-21 Caliskan C, Pehlivan M, Yuce Z, Sercan O Dishevelled proteins and CYLD reciprocally regulate each other in CML cell lines Mol Biol Rep 2017; 44:391-7 Mulas F, Wang X, Song S, et al The deubiquitinase OTUB1 augments NFkappaB-dependent immune responses in dendritic cells in infection and inflammation by stabilizing UBC13 Cell Mol Immunol 2020; Xu X, Kalac M, Markson M, et al Reversal of CYLD phosphorylation as a novel therapeutic approach for adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) Cell Death Dis 2020; 11:94 27 Goncharov T, Niessen K, de Almagro MC, et al OTUB1 modulates c-IAP1 stability to regulate signalling pathways EMBO J 2013; 32:1103-14 Liu X, Jiang WN, Wang JG, Chen H Colon cancer bears overexpression of OTUB1 Pathol Res Pract 2014; 210:770-3 Nishanth G, Deckert M, Wex K, et al CYLD enhances severe listeriosis by impairing IL-6/STAT3-dependent fibrin production PLoS Pathog 2013; 9:e1003455 28