Nghiên cứu xác định hệ protein màng trong huyết thanh của bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Trần Thái Thƣợng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỆ PROTEIN MÀNG TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Trần Thái Thƣợng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỆ PROTEIN MÀNG TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Lê Thị Bích Thảo PGS TS Trịnh Hồng Thái Hà Nội – 2013 Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Bích Thảo PGS TS Trịnh Hồng Thái, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình giảng dạy, dìu dắt tơi thời gian học tập Trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS TS Phan Văn Chi, toàn thể anh chị làm việc Phịng Hóa sinh Protein, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hết lịng định hướng giúp đỡ tơi thực thành công luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội cung cấp mẫu tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực đề tài Cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên, giúp đỡ chỗ dựa vững cho quãng thời gian qua K20 Luận văn thực với hỗ trợ kinh phí từ Đề tài Độc lập cấp Nhà nước số 03/2011 PTNTĐ/HĐ-ĐTĐL Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Học viên – Sinh học thực nghiệm Trần Thái Thượng Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN LỤC iv MỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH v BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT i MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 HUYẾT THANH –i– Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ 1.1.1 Khái niệm huyết 1.1.2 Đặc điểm, thành phần hệ protein huyết 1.1.3 Chức protein huyết .6 1.1.4 Phƣơng pháp proteomics ứng dụng nghiên cứu hệ protein huyết .7 1.2 PROTEIN MÀNG VÀ CÁCH TIẾP CẬN PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU 12 1.2.1 Vai trò protein màng 12 1.2.2 Ứng dụng proteomics nghiên cứu protein màng 15 1.3 HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP 17 1.3.1 Bệnh động mạch vành hội chứng mạch vành cấp 17 1.3.2 Các phƣơng pháp chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp 18 1.4 CÁC NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY VỀ PROTEIN MÀNG VÀ TIM MẠCH 19 1.4.1 Những nghiên cứu giới 19 1.4.2 Những nghiên cứu Việt Nam 20 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .21 2.1 NGUYÊN LIỆU 21 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP 22 2.2.1 Loại albumin IgG huyết “Aurum™Serum Protein Mini Kit” 23 2.2.2 Xác định hàm lƣợng protein tủa để tinh mẫu 24 2.2.3 Điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) 25 2.2.4 Thủy phân protein trypsin gel 26 2.2.5 Sắc kí đa chiều phân tích khối phổ .26 2.2.6 Nhận diện protein qua phổ khối lƣợng thu đƣợc .27 2.2.7 Nhận diện phân loại protein màng huyết bệnh nhân mạch vành cấp 29 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 KẾT QUẢ 31 3.1.1 Loại albumin IgG huyết 31 3.1.2 Tủa protein huyết 32 3.1.3 Phân tách protein huyết SDS-PAGE 34 3.1.4 Nhận diện protein màng huyết .35 3.1.5 Phân tích liệu vị trí dƣới tế bào protein màng 40 3.1.6 Phân tích liệu chức protein màng 42 K20 – Sinh học thực nghiệm – ii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ 3.1.7 Phân tích liệu q trình sinh học mà protein màng tham gia 44 3.1.8 Phân tích liệu khối lƣợng cải biến sau dịch mã protein màng 47 3.1.9 Dự đốn vùng xun màng qua chƣơng trình tin sinh học .49 3.2 THẢO LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC .I Phụ lục Danh sách bệnh nhân I Phụ lục Danh sách protein màng nhận diện đƣợc huyết bệnh nhân ACS kết dự đoán số vùng xuyên màng .III K20 – Sinh học thực nghiệm – iii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các hóa chất đƣợc sử dụng nghiên cứu 21 Bảng Các thành phần tạo gel 25 Bảng Phân loại protein theo vị trí dƣới tế bào 40 Bảng Phân loại protein theo chức 42 Bảng Phân loại protein theo trình sinh học 45 Bảng Phân loại protein theo khối lƣợng 47 Bảng Phân loại protein theo cải biến sau dịch mã 48 Bảng Kết dự đoán vùng xuyên màng (TMD) 53 Bảng Kết dự đoán số lƣợng protein theo số vùng xuyên màng (TMD) .54 K20 – Sinh học thực nghiệm – iv – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Một số kiểu định vị protein màng 14 Hình Quy trình phân tích mẫu huyết 23 Hình Quy trình nhận diện protein màng từ liệu phổ khối lƣợng thu đƣợc 28 Hình Thơng số tra cứu liệu protein phần mềm Mascot 29 Hình Kết loại albumin IgG Aurum™ Serum Protein Mini Kit 32 Hình Hình ảnh điện di SDS-PAGE kết tủa protein acetone 33 Hình Hình ảnh điện di mẫu huyết bệnh nhân ACS sau tủa protein acetone 34 Hình Hình ảnh minh họa phân đoạn huyết bệnh nhân ACS đƣợc cắt gel SDS – PAGE 35 Hình Hình ảnh minh họa kết nhận diện protein phần mềm Mascot 37 Hình 10 Hình ảnh minh họa thông số protein đƣợc nhận diện phƣơng pháp khối phổ 37 Hình 11 Hình ảnh minh họa thông tin protein sở liệu UniProt 38 Hình 12 Hình ảnh minh họa kết tìm kiếm thơng tin protein từ sở liệu UniProt 38 Hình 13 Hình ảnh minh họa thông tin chi tiết protein màng 39 Hình 14 Tỉ lệ phân bố dƣới tế bào protein màng huyết bệnh nhân mạch vành cấp 41 Hình 15 Tỉ lệ theo chức protein màng huyết bệnh nhân mạch vành cấp 43 Hình 16 Tỉ lệ tham gia vào trình sinh học protein màng huyết bệnh nhân mạch vành cấp 46 Hình 17 Tỉ lệ theo khối lƣợng protein màng huyết bệnh nhân mạch vành cấp 47 Hình 18 Tỉ lệ loại cải biến sau dịch mã protein màng huyết bệnh nhân mạch vành cấp 49 K20 – Sinh học thực nghiệm –v– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ Hình 19 Hình ảnh minh họa kết dự đốn vùng xuyên màng chƣơng trình TMHMM 50 Hình 20 Hình ảnh minh họa kết dự đốn vùng xuyên màng chƣơng trình SOSUI 51 Hình 21 Hình ảnh minh họa kết dự đốn vùng xuyên màng chƣơng trình Phobius 52 Hình 22 Hình ảnh so sánh kết dự đốn TMD chƣơng trình tin sinh học 53 Hình 23 Hình ảnh so sánh kết dự đốn số lƣợng TMD chƣơng trình tin sinh học 55 K20 – Sinh học thực nghiệm – vi – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN Trần Th B Kí hiệu Tên Tiế ACN Acetoni ACS Acute C amu Atomic APS Ammon BSA Bovine CK Creatine Da Dalton DTT Dithioth ESI Electros FA Formic a gi GenInfo GO Gen Ont HBPP Human H-FABP Heart-ty protein HLPP Human HPPP Human HPLC High Pe Chroma K20 – Sinh học thực nghiệm –i– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN HUPO IAA KB LC LNCaP MDLC MS NCBI NGEP_L Nr PIR PSI RP SCX SDS SDS-PAGE SIB TEMED TFA K20 – Sinh học thực nghiệm – ii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN 1074 Protocadherin-12 precursor 1075 Immunoglobulin heavy chain variant 1076 Serine protease inhibitor Kazal type 1077 Phospholipase C beta 1078 RecName: Full=Anoctamin-2; AltName: Full=Transmembrane protein 16B 1079 Nogo-A protein short form 1080 Poliovirus receptor-related K20 – Sinh học thực nghiệm Trần Thái Thượng 1081 1082 RecName: Full=Cyclic nucleotide-gated cation channel beta-3; Short=CNG channel beta-3; Short=Cyclic nucleotide-gated channel beta-3; AltName: Full=Cone photo RecName: Full=Baculoviral IAP repeat-containing protein 6; 1083 AltName: Full=Ubiquitin-conjugating BIR RecName: Full=Scavenger receptor cysteine-rich type protein M160; 1084 AltName: Full=CD163 antigen-like Mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase IC 1085 APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor 1086 Carbohydrate sulfotransferase 12 1087 1088 RecName: Full=Spectrin beta chain, brain 4; AltName: Full=Spectrin, non-erythroid beta chain 4; AltName: Full=Beta-V spectrin; AltName: Full=BSPECV NADH/NADPH thyroid oxidase p138-tox 1089 Dual oxidase precursor 1090 Zinedin 1091 Vacuolar protein sorting 1092 Alpha1A-voltage-dependent calcium channel 1093 Receptor for egg jelly-like protein precursor 1094 RecName: Full=Probable phospholipid-transporting ATPase IB; AltName: Full=ATPase class I type 8A member 2; AltName: K20 – Sinh học thực nghiệm 1095 Full=ML-1 RecName: Full=Semaphorin-4G; Flags: Precursor 1096 Exocyst complex component isoform 1097 Transmembrane protein 30A isoform 1098 Phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains Trần Thái Thượng 1099 RecName: Full=Testis-expressed sequence 10 protein 1100 Unnamed protein product 1101 RecName: Full=SID1 transmembrane family member 1; Flags: 1102 Precursor Stabilin-1 1103 Dipeptidyl-peptidase 1104 Toll-like receptor 1105 Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 1106 RecName: Full=Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3; 1107 AltName: Full=Flamingo homolog 1; Shor RecName: Full=Protocadherin Fat 2; Short=hFat2; AltName: 1108 Full=Multiple epidermal growth factor-like Pleckstrin 1109 Formin variant 1110 1111 RecName: Full=Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3; AltName: Full=PRKR-like endoplasmic reticulum kinase; AltName: Full=Pancreatic eIF2-alpha kinase; Short=HsPEK; Flags: Precursor Myoferlin isoform a 1112 Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member K20 – Sinh học thực nghiệm 1113 Low density lipoprotein-related protein 1B precursor 1114 Brain protein 1115 KIAA1529 protein 1116 Phospholipase C, epsilon 1117 RecName: Full=Contactin-3; AltName: Full=Brain-derived 1118 immunoglobulin superfamily protein 1; Short= RecName: Full=Probable phospholipid-transporting ATPase VD; Trần Thái Thượng Short=ATPVD; AltName: Full=ATPase class 1119 SEMA5B 1120 KIAA1417 protein 1121 ES/130 1122 Immunoglobulin superfamily, member isoform b 1123 KIAA1255 protein 1124 Neurexin isoform alpha-1 precursor 1125 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like 1126 Brush border myosin-I 1127 Xenotropic and polytropic retrovirus receptor isoform 1128 Spastin isoform 1129 Gamma-aminobutyric acid (GABA) B receptor isoform c precursor 1130 Membrane protein CH1 1131 X104 1132 Klotho 1133 Macrophage receptor K20 – Sinh học thực nghiệm 1134 Calcium channel flower homolog isoform a 1135 Amiloride-sensitive cation channel isoform c 1136 TANK-binding kinase 1137 Transmembrane protein isoform a 1138 Leucyl/cystinyl aminopeptidase isoform 1139 NOV/plexin-A1 protein 1140 Cadherin 22 precursor 1141 Aralar2 Trần Thái Thượng 1142 RecName: Full=N-acetylglucosamine-1-phosphodiester alpha-N- 1143 acetylglucosaminidase; AltName: Full=Pho TRHDE 1144 Tenascin-M1 1145 Transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 1146 KIAA1288 protein 1147 Solute carrier family 39 (zinc transporter), member 10 1148 KIAA1254 protein 1149 KIAA1250 protein 1150 KIAA1249 protein 1151 RecName: Full=Transmembrane and coiled-coil domains protein 1152 Hypothetical protein 1153 RecName: Full=Myosin-Vb 1154 1155 RecName: Full=Neurogenic locus notch homolog protein 3; Short=Notch 3; Contains: RecName: Full=Notch extracellular truncation; Contains: RecName: Full=Notc Anaplastic lymphoma kinase Ki-1 variant 1156 Autoantigen K20 – Sinh học thực nghiệm 1157 Protocadherin 43 1158 GM3 synthase; ST-I sialyltransferase; ST3Gal V 1159 Transferrin receptor protein isoform 1160 Component of oligomeric golgi complex 1161 Trabeculin-alpha 1162 Phospholipase C-like isoform b 1163 Exocyst complex component isoform Trần Thái Thượng 1164 Similar to sperm specifc protein 1165 RecName: Full=SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 2; 1166 Short=Shank2; AltName: Full=Cortac RecName: Full=Regulating synaptic membrane exocytosis protein 2; 1167 AltName: Full=Rab3-interacting molecule 2; Short=RIM Mannosyl (alpha-1,3-)-glycoprotein beta-1,4-N- 1168 acetylglucosaminyltransferase, isoenzyme B SPG7 protein 1169 Multidrug resistance protein 1170 Voltage-gated sodium channel alpha subunit 1171 Structural maintenance of chromosomes 1172 Leucine zipper, putative tumor suppressor 1173 Myelin gene regulatory factor isoform 1174 Fibronectin type III domain containing 3A isoform 1175 KIAA0973 protein 1176 RecName: Full=FYVE finger-containing phosphoinositide kinase; 1177 AltName: Full=PIKfyve; AltName: Full= RecName: Full=Axin-2; AltName: Full=Axis inhibition protein 2; AltName: Full=Conductin; AltName: Fu 1178 LEM domain containing 1179 DNb-5 1180 Hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel 1181 ADAM metallopeptidase domain 18 preproprotein 1182 RecName: Full=Glutamate receptor-interacting protein 1; Short=GRIP1 protein K20 – Sinh học thực nghiệm Trần Thái Thượng 1183 Hypothetical protein 1184 RecName: Full=Serine/threonine-protein kinase WNK2; AltName: Full=Protein kinase with no lysine 2; 1185 Talin 1186 Zonadhesin isoform 1187 Dishevelled-associated activator of morphogenesis 1188 RecName: Full=Plexin-D1; Flags: Precursor 1189 KIAA0614 protein 1190 FERM, RhoGEF, and pleckstrin domain protein isoform 1191 Talin 1192 Insulin receptor substrate 1193 Unnamed protein product 1194 1195 RecName: Full=SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 1; Short=Shank1; AltName: Full=Somatostatin receptor-interacting protein; Short=SSTR-interactin Protocadherin beta 15 1196 Protocadherin gamma subfamily C, isoform precursor 1197 Protocadherin gamma subfamily B, isoform precursor 1198 Protocadherin gamma subfamily A, isoform precursor 1199 Protocadherin gamma subfamily A, isoform precursor 1200 Protocadherin gamma subfamily A, 11 isoform precursor 1201 Protocadherin alpha isoform precursor 1202 KIAA1124 protein 1203 Heparan sulfate D-glucosaminyl 3-O-sulfotransferase 3B1 1204 Dolichyl-phosphate beta-glucosyltransferase isoform K20 – Sinh học thực nghiệm Trần Thái Thượng 1205 Patched 1206 Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 1207 Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 1208 2'-5'oligoadenylate synthetase 1209 Liver specific transporter 1210 Sodium bicarbonate cotransporter2 1211 RecName: Full=Laminin subunit gamma-3; AltName: Full=Laminin 12 gamma subunit; Flags: Precursor 1212 Roundabout isoform a 1213 Cadherin-10 1214 RecName: Full=Protein piccolo; AltName: Full=Aczonin 1215 Myosin heavy chain Myr 1216 Zinc fingers and homeoboxes *Ghi chú: n – Số mẫu mà protein xuất N – Tổng số mẫu nghiên cứu (N=30) K20 – Sinh học thực nghiệm – LVIII – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN ... 15 1.3 HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP 17 1.3.1 Bệnh động mạch vành hội chứng mạch vành cấp 17 1.3.2 Các phƣơng pháp chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp 18 1.4 CÁC NGHIÊN CỨU GẦN... tích hệ protein thể Tại Việt Nam, nghiên cứu proteomics đƣợc tiến hành số năm qua đạt đƣợc kết định Trên sở thực đề tài ? ?Nghiên cứu xác định hệ protein màng huyết bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành. .. KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Trần Thái Thƣợng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỆ PROTEIN MÀNG TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114