Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm đối kháng trichoderma trên đất trồng bưởi tỉnh bến tre (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM ĐỐI KHÁNG TRICHODERMA TRÊN ĐẤT TRỒNG BƯỞI TỈNH BẾN TRE” Sinh viên thực : Lý Thị Thùy Linh Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Đức Thành : PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh HÀ NỘI – 02/2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày khóa luận trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 28 tháng 01 năm 2021 Sinh viên Lý Thị Thùy Linh i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đức Thành PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ động viên q trình thực đề tài hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Viện Di truyền Nông nghiệp, Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học trực tiếp giảng dạy, trang bị cho kiến thức bổ ích suốt thời gian học đại học Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tất người thân, bạn bè, người bên cạnh động viên giúp đỡ trình học tập thực đề tài Hà Nội, ngày 28 tháng 01 năm 2021 Sinh viên Lý Thị Thùy Linh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược bưởi 2.2 Bưởi Da xanh 2.3 Nấm đối kháng Trichoderma 2.3.1 Tên gọi phân loại 2.3.2 Đặc điểm hình thái 2.3.3 Đặc điểm sinh học nấm đối kháng Trichoderma 2.3.4 Cơ chế đối kháng nấm Trichoderma 2.3.5 Phương pháp định danh nấm Trichoderma 11 2.4 Nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma phòng chống bệnh 12 2.5 Sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng Trichoderma 13 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Vật liệu nghiên cứu 17 iii 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất, phân lập nấm đối kháng 20 3.4.2 Phương pháp đánh giá hiệu lực đối kháng với nấm bệnh gây bệnh 21 3.4.3 Phương pháp định danh chủng nấm đối kháng tuyển chọn dựa vào đặc điểm hình thái kỹ thuật PCR 21 3.4.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến sinh trưởng phát triển nấm đối kháng Trichoderma tuyển chọn 25 3.4.5 Phương pháp nghiên cứu số loại chất rắn để nhân sinh khối nấm đối kháng Trichoderma tuyển chọn 27 3.4.6 Phương pháp đánh giá hiệu bổ sung chế phẩm sinh học nhân sinh khối từ nguồn nấm đối kháng Trichoderma 27 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Phân lập, tuyển chọn nấm đối kháng Trichoderma 29 4.2 Định danh mẫu nấm đối kháng tuyển chọn dựa vào đặc điểm hình thái kỹ thuật PCR 33 4.2.1 Định danh dựa vào đặc điểm hình thái 33 4.2.2 Định danh dựa vào kỹ thuật PCR 34 4.3 Ảnh hưởng số yếu tố đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng Trichoderma tuyển chọn 36 4.3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 36 4.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 38 4.3.3 Ảnh hưởng ngưỡng pH 39 4.3.4 Ảnh hưởng muối NaCl 40 iv 4.3.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon 42 4.3.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ 43 4.4 Nghiên cứu số loại chất rắn để nhân nuôi sinh khối nấm đối kháng Trichoderma tuyển chọn 44 4.5 Đánh giá hiệu bổ sung chế phẩm sinh học nhân sinh khối từ nguồn nấm đối kháng Trichoderma 46 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 57 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Phân lập nấm đối kháng Trichoderma spp phương pháp pha lỗng mẫu đất mơi trường TSM 29 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái tản nấm đối kháng Trichoderma spp mơi trường PDA sau ngày nuôi cấy 30 Bảng 4.3 Đặc điểm hình thái mẫu nấm T-BTR.03 môi trường PDA 33 Bảng 4.4 Kết tìm kiếm trình tự gần gũi Ngân hàng Gen 35 Bảng 4.5 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 37 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 môi trường PDA 38 Bảng 4.7 Ảnh hưởng ngưỡng pH đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 môi trường PDA 39 Bảng 4.8 Ảnh hưởng muối NaCl đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 môi trường PDA 41 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nguồn bon đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 môi trường PDA 42 Bảng 4.10 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 môi trường PDA 43 Bảng 4.11 Khả sinh trưởng hình thành bào tử nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 loại giá thể khác 45 Bảng 4.12 Ảnh hưởng nấm đối kháng T asperllum T.BDX.02 lên bưởi điều kiện chậu vại nhà lưới 47 vi DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Phân lập nấm đối kháng Trichoderma phương pháp pha lỗng mẫu đất mơi trường TSM 31 Hình 4.2 Đánh giá hiệu lực đối kháng mẫu nấm T.BDX.02 với nấm Colletotrichum sp môi trường PDA 32 Hình 4.3 Đánh giá hiệu lực đối kháng mẫu nấm T.BDX.02 với nấm F solani môi trường PDA 32 Hình 4.4 Đặc điểm hình thái mẫu nấm T.BDX.02 34 Hình 4.5 Cây phả hệ dựa trình tự vùng liên gen mẫu nấm Trichoderma spp 36 Hình 4.6 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 38 Hình 4.7 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 39 Hình 4.8 Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 40 Hình 4.9 Ảnh hưởng muối NaCl đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 41 Hình 4.10 Ảnh hưởng nguồn bon đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 42 Hình 4.11 Ảnh hưởng nguồn ni tơ đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 44 Hình 4.12 Khả sinh trưởng hình thành bào tử nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 loại giá thể 46 Hình 4.13 Thí nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng Trichoderma lên bưởi nhà lưới 47 Hình 4.14 Rễ thí nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng Trichoderma lên bưởi nhà lưới 48 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Diễn giải chữ viết tắt Ctv Cộng tác viên CFU Colony forming unit (Số đơn vị khuẩn lạc) CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA Deoxy nucleic acid F solani Fusarium solani ITS Internal transcribed spacer (Vùng liên gen) Nts Nucleotides NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 10 T asperellum Trichoderma asperellum viii TĨM TẮT Với mục đích phân lập xác định số đặc điểm sinh học nấm đối kháng Trichoderma, tiến hành thu thập đánh giá hiệu lực đối kháng nấm Trichoderma với loại nấm bệnh Collectotrichum sp Fusarium solani Nghiên cứu số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển nấm T asperellum T.BDX.02, xác định nấm đối kháng sinh trưởng tốt môi trường PDA , nhiệt độ tối ưu 25°C, pH nồng độ muối 1% NaCl, đồng thời với nguồn cacbon mật gỉ đường nguồn nitơ NaNO nấm đối kháng sinh trưởng nhanh phát triển mạnh Trong thí nghiệm nghiên cứu số loại chất thích hợp để nhân sinh khối nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 với chất thóc nếp nấm sinh lượng bào tử cao Trong điều kiện nhà lưới, chế phẩm nhân nuôi từ nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 đạt hiệu cao việc phòng trừ bệnh thối rễ nấm F.solani gây ix Hình 4.11 Ảnh hưởng nguồn ni tơ đến sinh trưởng, phát triển nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 4.4 Nghiên cứu số loại chất rắn để nhân nuôi sinh khối nấm đối kháng Trichoderma tuyển chọn Nguồn chất để nhân sinh khối nấm đối kháng Trichoderma spp nhằm mục đích tạo chế phẩm sinh học có ý nghĩa quan trọng, vừa có hiệu nhân sinh khối, vừa tạo số lượng bào tử nấm đối kháng cao Trong thí nghiệm này, nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 nhân sinh khối nguồn thóc, bột ngơ, bã cà phê Mỗi cơng thức gồm hộp nhựa (có thể tích 500 ml, có nắp đậy Kết nhân sinh khối nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 trình bày bảng 4.11 44 Bảng 4.11 Khả sinh trưởng hình thành bào tử nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 loại giá thể khác Cơng thức thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 Ngày theo dõi sau nhân nuôi Bào tử nấm xanh nhạt, xuất bào tử trắng lan hết bề mặt chất Bào tử nấm màu xanh nhạt lan xung quanh đĩa Nấm màu xanh đậm, hình nhẫn, bào tử trắng dày, ăn sâu xuống Nấm màu xanh đậm mọc gần hết bề mặt, bào tử trắng Bào tử nấm màu Bào tử trắng dày, xanh vàng xuất có nhiều bào tử màu vàng Bào tử trắng chủ Bào tử trắng mọc yếu lan xung quanh dày, bào tử xanh chất vàng Bào tử xanh nhạt Bào tử xanh và bào tử vàng xuất vàng xuất hiện lan xung nhiều, bào tử quanh chất trắng Bào tử xanh Bào tử nấm màu đậm lan khắp mặt xanh trắng mọc hộp nhiều ngang nhau, có xuất bảo tử màu vàng Bào tử xanh Bào tử trắng mọc trắng dày chủ yếu, bào toàn bề mặt tử xanh chất ngày Nấm màu xanh đậm, hình nhẫn, bào tử trắng dày, ăn sâu xuống Nấm màu xanh đậm mọc hết bề mặt, bào tử trắng Số lượng bào tử/g (CFU/g sau ngày 6,93 x 109 3,51 x 109 Bào tử trắng bào tử màu vàng mọc dày Bào tử trắng mọc nhiều, bào tử xanh vàng Bào tử xanh vàng xuất nhiều, bào tử trắng Bào tử nấm màu xanh trắng mọc nhiều, bảo tử màu vàng 4,22 x 108 Bào tử trắng mọc dày, bào tử xanh 2,17 x 109 3,10 x 108 4,28 x 108 8,14 x 108 Ghi chú:CT1: Thóc nếp (100%); CT2: Bã cà phê (100%); CT3: Bột ngô (100%); CT4: Bột ngô (50%) + bã cà phê (50%); CT5: Bột ngô (49,5%) + bã cà phê (49,5%) + mật rỉ đường (1%); CT6: Bột ngơ (50%) + thóc nếp (50%); CT7: Bột ngơ (49,5%) + thóc nếp (49,5%) + mật rỉ đường (1%) 45 Trên chất thóc nếp luộc, nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 phát triển nhanh mạnh nhất, sợi nấm lan khắp bề mặt ăn sâu đáy hộp, số lượng bào tử cao (6,93 x 109 CFU/g) Môi trường nhân sinh khối có bột ngơ (CT3), sợi nấm mọc thưa nhất, số lượng bào tử đạt 4,22 x 108 CFU/g Khi bổ sung mật rỉ đường, sợi nấm ăn sâu rộng bề mặt nhân sinh khối, số lượng bào tử đạt 2,17 x 109 CFU/g Kết nghiên cứu phù hợp với Nguyễn Đức Huy ctv (2017), sử dụng loại giá thể gồm bã mía, vỏ hoa diêm mạch, bột ngơ, trấu - cám thóc luộc sử dụng để nhân sinh khối nấm T asperellum Kết nghiên cứu cho biết nấm T asperllum phát triển nhanh hình thành sinh khối bào tử phân sinh nhiều chất thóc luộc (7,8 x 109 CFU/g) Hình 4.12 Khả sinh trưởng hình thành bào tử nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 loại giá thể 4.5 Đánh giá hiệu bổ sung chế phẩm sinh học nhân sinh khối từ nguồn nấm đối kháng Trichoderma Trong thí nghiệm này, bưởi Da xanh trồng từ hạt, đem ngâm ủ hạt cho nứt nanh trồng vào giá thể trồng hấp khử trùng Lây nhiễm nấm bệnh F solani giai đoạn bưởi Da xanh có thật mơ tả phần phương pháp Bố trí thí nghiệm có bổ sung chế phẩm sinh 46 học Trichoderma từ chất thóc nếp đối chứng lây nhiễm nấm bệnh F solani nước cất Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Ảnh hưởng nấm đối kháng T asperllum T.BDX.02 lên bưởi điều kiện chậu vại nhà lưới STT Cơng thức thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi Chiều Khối Chiều dài rễ lượng dài (cm) (g) (cm) 15,4 1,7 8,1 CT1 Chiều cao (cm) 9,2 Chiều rộng (cm) 2,7 CT2 8,1 14,0 1,5 5,8 2,5 CT3 5,6 8,2 0,8 4,7 2,2 CT4 7,5 13,2 1,2 5,5 2,4 LSD 0,05 0,62 0,97 0,17 0,58 0,22 Ghi chú: CT1: 50 g chế phẩm sinh học Trichoderma từ chất thóc nếp; CT2: 50 ml dịch nấm bệnh F solani + 50 g chế phẩm sinh học Trichoderma từ chất thóc nếp; CT3: 50 ml dịch nấm bệnh F solani; CT4 (đối chứng trắng): Chỉ tưới nước lã Từ kết thấy nấm đối kháng Trichoderma có hiệu việc trồng bưởi da xanh mẫu có bổ sung Trichoderma phát triển nhanh tốt nhất, mẫu lây nhiễm bệnh F solani mọc yếu nhất, rễ phát triển hẳn so với mẫu cịn lại Hình 4.13 Thí nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng Trichoderma lên bưởi nhà lưới 47 Hình 4.14 Rễ thí nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng Trichoderma lên bưởi nhà lưới 48 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 1) Đã phân lập, tuyển chọn mẫu nấm đối kháng Trichoderma spp từ mẫu đất trồng bưởi Da xanh thu thập 2) Kết định danh mẫu nấm T.BDX.02 tuyển chọn: Dựa vào đặc điểm hình thái phân tích PCR kết hợp giải trình tự xác định xác tên loài Trichoderma asperellum, đặt tên Trichoderma asperellum T.BDX.02 3) Đánh giá số đặc điểm sinh học nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 cho thấy: - Nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 sinh trưởng phát triển loại môi trường nuôi cấy (PDA, CZA, SDA CMA) mơi trường PDA thích hợp cho chủng nấm đối kháng - Nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 sinh trưởng phát triển tốt điều kiện nhiệt độ từ 25oC - 35oC, chịu nồng độ muối NaCl 1% 5% ngưỡng pH thích hợp pH - Nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 có khả đồng hóa loại nguồn cacbon nito khác nhau, với nguồn cacbon mật rỉ đường, mannitol thích hợp cho sinh trưởng, phát triển nấm, với nguồn nito NaNO KNO 4) Nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 sinh trưởng, phát triển tốt giá thể thóc luộc, mật độ bào tử đạt cao (6,93 x 109 CFU/g) Đây loại giá thể phù hợp để nhân sinh khối nấm đối kháng 5) Ở điều kiện chậu vại nhà lưới, bổ sung chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 có hiệu giúp phòng trừ bệnh thối rễ nấm F solani bưởi, giúp tăng tiêu rễ, khối lượng tươi so với đối chứng 49 5.2 Kiến nghị Cần nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân sinh khối nấm đối kháng T asperellum T.BDX.02 nhằm mục đích tạo chế phẩm sinh học để ứng dụng phòng trừ bệnh hại bưởi 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO A) Tài liệu tiếng Việt Dương Đức Hiếu, Lê Công Nhất Phương, Võ Thị Kiều Thanh, Lê Thị Ánh Hồng, Trần Quang Vinh, Phùng Huy Huấn (2012) Sản xuất phân hữu sinh học từ phế phẩm mạt cưa sau thu hoạch nấm chất thải chăn ni Tạp chí Sinh học 34 (3) tr 154-160 Trần Ngọc Hùng Nguyễn Thị Liên Thương (2016) Nghiên cứu tạo chế phẩm từ Trichoderma sp kiểm soát bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây ớt (Capsicum frutescens) Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 45 tr 86 - 92 Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn Văn Viên Nguyễn Tất Cảnh (2017) Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 15(12) tr 1593 - 1604 Nguyễn Đắc Khoa, Dương Minh Phạm Văn Kim (2010) Sản xuất sản phẩm sinh học để quản lý bệnh hại lúa, ăn rau màu theo hướng bền vững khơng nhiễm mơi trường Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ 16b tr 117 - 126 Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Bến Tre (2018) Kỹ thuật bón phân cho bưởi Da xanh giai đoạn kinh doanh Truy cập ngày 20 tháng 11 năm 2020 http://dost-bentre.gov.vn/tin-tuc/2046/ky-thuat-bon-phan-chobuoi-da-xanh-giai-doan-kinh-doanh Vũ Xuân Tảo Trần Văn Tuấn (2020) Phân lập tuyển chọn chủng Trichoderma có khả đối kháng vi nấm gây bệnh cam Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 36 (3) tr 98-104 51 Trần Thị Thuần (1997) Cơ chế đối kháng nấm đối kháng Trichoderma viride nấm gây bệnh hại trồng Tạp chí Bảo vệ thực vật tr 15-19 Phạm Thị Thùy (2004) Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 335 tr Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Bích Tuyền, Tơ Đình Phúc, Lê Thị Ánh Đơng (2016) Khảo sát khả đối kháng sinh học nấm Trichoderma sp nấm gây bệnh vàng thối rễ có múi Tạp chí Khoa học Cơng nghệ thực phẩm tr 42-52 10 Võ Thị Thu Oanh, Lưu Từ Đoan Trang (2017) Đánh giá khả đối kháng số dòng Trichoderma Phytopythium helicoides điều kiện phịng thí nghiệm Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tr 1-8 11 Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Thị Tú Bùi Văn Công (2012) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma viride phòng trừ số bệnh nấm hại củ khoai tây, lạc, đậu tương Tạp chí Khoa học Phát triển 10 (1) tr 95 - 102 B) Tài liệu tiếng Anh 12 Atanasova L., Le Crom, S., Gruber, S., Coulpier, F., Seidl-Seiboth, V., Kubicek, C transcriptomics P., and reveals Druzhinina, different I S (2013) strategies of Comparative Trichoderma mycoparasitism BMC genomics Vol 14 (1) pp 1-15 13 Baiyee B., Ito, S I., and Sunpapao, A (2019) Trichoderma asperellum T1 mediated antifungal activity and induced defense response against leaf spot fungi in lettuce (Lactuca sativa L.) Physiological and Molecular Plant Pathology Vol 106 pp 96-101 14 Bansal R., Sherkhane, P D., Oulkar, D., Khan, Z., Banerjee, K., and Mukherjee, P K (2018) The viridin biosynthesis gene cluster of Trichoderma virens and its conservancy in the bat white‐nose fungus 52 Pseudogymnoascus destructans ChemistrySelect Vol (4) pp 1289 1293 15 Begoude B A D., Lahlali, R., Friel, D., Tondje, P R., and Jijakli, M H (2007) Response surface methodology study of the combined effects of temperature, pH, and aw on the growth rate of Trichoderma asperellum Journal of Applied Microbiology Vol 103 (4) pp 845-854 16 Bissett J., Szakacs, G., Nolan, C A., Druzhinina, I., Gradinger, C., and Kubicek, C P (2003) New species of Trichoderma from Asia Canadian Journal of Botany Vol 81 (6) pp 570-586 17 Bunbury-Blanchette A L., and Walker, A K (2019) Trichoderma species show biocontrol potential in dual culture and greenhouse bioassays against Fusarium basal rot of onion Biological Control Vol 130 pp 127-135 18 Doyle J J and J L Doyle (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus Vol 12 pp 13-15 19 Elad Y., Chet, I., and Henis, Y (1981) A selective medium for improving quantitative isolation of Trichoderma spp from soil Phytoparasitica Vol (1) pp 59-67 20 Guarro J., Gené, J., and Stchigel, A M (1999) Developments in fungal taxonomy Clinical Microbiology Reviews Vol 12 (3) pp 454-500 21 Hall T (2004 ) BioEdit Biological sequence alignment editor for Win95/98/NT/2K/XP 192 pp 22 Harman G E (2006) Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp Phytopathology Vol 96 (2) pp 190-194 23 Harman G E., and Kubicek, C P (2002) Trichoderma and Gliocladium: basic biology, taxonomy and genetics (Vol 1) CRC Press 24 Huang J., Chen, D., Wei, Y., Wang, Q., Li, Z., Chen, Y., and Huang, R (2014) Direct ethanol production from lignocellulosic sugars and 53 sugarcane bagasse by a recombinant Trichoderma reesei strain HJ48 The Scientific World Journal Vol pp 1-7 25 Klein D., Eveleigh, D E (1998) Ecology of Trichoderma In: Kubicek, C P., Harman, G E (dds.): Trichoderma and Gliocladium Basic Biology, Taxonomy and Genetics, vol Taylor and Francis, London, pp 57_73 26 Kubicek C P., Herrera-Estrella, A., Seidl-Seiboth, V., Martinez, D A., Druzhinina, I S., Thon, M., and Grigoriev, I V (2011) Comparative genome sequence analysis underscores mycoparasitism as the ancestral life style of Trichoderma Genome biology Vol 12 (4) pp 1-15 27 Kumar, K., Amaresan, N., Bhagat, S., Madhuri, K., and Srivastava, R C (2012) Isolation and characterization of Trichoderma spp for antagonistic activity against root rot and foliar pathogens Indian journal of microbiology Vol 52 (2) pp 137-144 28 Leylaie S., and Zafari, D (2018) Antiproliferative and antimicrobial activities of secondary metabolites and phylogenetic study of endophytic Trichoderma species from Vinca plants Frontiers in Microbiology Vol pp 1484 29 McWilliam H., Li, W., Uludag, M., Squizzato, S., Park, Y M., Buso, N., and Lopez, R (2013) Analysis tool web services from the EMBLEBI Nucleic acids research Vol 41 (W1) pp W597-W600 30 Mukherjee P K., Horwitz, B A., Singh, U S., Mukherjee, M., and Schmoll, M (Eds.) (2013) Trichoderma: biology and applications CABI 31 Qualhato T F., Lopes, F A C., Steindorff, A S., Brandao, R S., Jesuino, R S A., and Ulhoa, C J (2013) Mycoparasitism studies of Trichoderma species against three phytopathogenic fungi: evaluation of antagonism and hydrolytic enzyme production Biotechnology Letters Vol 35 (9) pp 1461-1468 54 32 Saba H., Vibhash, D., Manisha, M., Prashant, K S., Farhan, H., and Tauseef, A (2012) Trichoderma - a promising plant growth stimulator and biocontrol agent Mycosphere Vol (4) pp 524-531 33 Samuels G J (2006) Trichoderma: systematics, the sexual state, and ecology Phytopathology Vol 96 (2) pp 195-206 34 Seibel C., Gremel, G., Nascimento Silva, R., Schuster, A., Kubicek, C P., and Schmoll, M (2009) Light-dependent roles of the G-protein α subunit GNA1 of Hypocrea jecorina (anamorph Trichoderma reesei) BMC biology Vol (1) pp 1-15 35 Shah S., Nasreen, S., and Sheikh, P A (2012) Cultural and morphological characterization of Trichoderma spp associated with green mold disease of Pleurotus spp in Kashmir Research Journal of Microbiology Vol (2) pp 139-145 36 Shahid M., Singh, A., Srivastava, M., Mishra, R P., and Biswas, S K (2011) Effect of temperature, pH and media for growth and sporulation of Trichoderma longibrachiatum and self life study in carrier based formulations Ann Pl Protec Sci Vol 19 (1) pp 147-149 37 Singh A., Shahid, M., Srivastava, M., Pandey, S., Sharma, A., and Kumar, V (2014) Optimal physical parameters for growth of Trichoderma species at varying pH, temperature and agitation Virol Mycol Vol (127) pp 2161-0517 38 Singh A., Srivastava, S., and Singh, H B (2007) Effect of substrates on growth and shelf life of Trichoderma harzianum and its use in biocontrol of diseases Bioresource Technology Vol 98 (2) pp 470-473 39 Singh V., Singh, P N., Yadav, R L., Awasthi, S K., Joshi, B B., Singh, R K., and Duttamajumder, S K (2010) Increasing the efficacy of Trichoderma harzianum for nutrient uptake and control of red rot in sugarcane Journal of Horticulture and Forestry Vol (4) pp 66-71 55 40 Stappler E., Walton, J D., Beier, S., and Schmoll, M (2017) Abundance of secreted proteins of Trichoderma reesei is regulated by light of different intensities Frontiers in microbiology Vol pp 2586-2595 41 Tamura K., D Peterson, N Peterson, G Stecher, M Nei, and S Kumar (2013) MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods Molecular Biology and Evolution Vol 28 (10) pp 2731-2739 42 Tomah A A., Abd Alamer, I S., Li, B., and Zhang, J Z (2020) A new species of Trichoderma and gliotoxin role: A new observation in enhancing biocontrol potential of T virens against Phytophthora capsici on chili pepper Biological Control Vol 145 pp 104-116 43 Troian R F., Steindorff, A S., Ramada, M H S., Arruda, W., and Ulhoa, C J (2014) Mycoparasitism studies of Trichoderma harzianum against Sclerotinia sclerotiorum: evaluation of antagonism and expression of cell wall-degrading enzymes genes Biotechnology letters Vol 36 (10) pp 2095-2101 44 White T J., Bruns, T., Lee, S J W T., and Taylor, J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics PCR protocols: a guide to methods and applications Vol 18 (1) pp 315-322 45 Wu Q., Sun, R., Ni, M., Yu, J., Li, Y., Yu, C., and Chen, J (2017) Identification of a novel fungus, Trichoderma asperellum GDFS1009, and comprehensive evaluation of its biocontrol efficacy PloS One Vol 12 (6) pp e0179957 56 PHỤ LỤC Bảng Các loài nấm đối kháng Trichoderma spp dùng phân tích phả hệ vùng liên gen ITS T harzianum CBS 226.95T Mã truy cập Ngân hàng Gen AY605713 T harzianum NZOR MT663452 Đất Hoa Kỳ T asperellum T-11-25 MT341772 Đất Thổ Nhĩ Kỳ T asperellum BFyAs3 MT102260 Đất Mexico T asperellum Tasp-SM30 MH215554 Đất Pakistan T asperellum Tasp-SM29 MH215555 Đất Pakistan T asperellum CBS 433.97T AY380912 Đất Hoa Kỳ T asperellum CBS 433.97T NR_130668 Đất Hoa Kỳ T reesei ATCC 1363T NR_120297 Không rõ Solomon T reesei T-GL6 LC596098 Đất Thái Lan T virens TRA3-25 MW325925 Đất Trung Quốc T virens AF222865 Không rõ Australia T virens DAOM 167651T CBS 109339T NR_138428 Gỗ mục Hoa Kỳ T lixii CBS 110080T NR_131264 Đất Thái Lan T lixii JZB3360007 MW008456 Đất Trung Quốc T lixii JZB3360008 MW008457 Đất Trung Quốc T koningii ATCC 64262T NR_138456 Đất Hungary T koningii MI437 MW269138 Đất Đức T koningii MI461 MW269162 Đất Đức Protocrea pallida CBS 299.78T NR_111329 Khơng rõ Australia Tên lồi Mẫu phân lập Nguồn gốc phân lập Đất Hoa Kỳ Ghi chú: T-mẫu chuẩn lồi 57 Quốc gia Kết giải trình tự mẫu nấm T.BDX.02 (560 bp): >T.BDX.02 CATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTG CCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCG CCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTT TACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCT CTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA TTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAG TATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCC GGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCTAAA TACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCG CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATG TTGACCTCGGATCAGGTAGGAATCCCGCTGAACTTAAGCA 58