Nghiên cứu đặc điểm sinh học và chẩn đoán virus gây bệnh hại chanh leo

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ NHƯ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH HẠI CHANH LEO Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62 01 12 Người hướng dẫn: PGS.TS Hà Viết Cường NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Tác giả luận văn Lê Thị Như Quỳnh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Hà Viết Cường Trong trình làm luận văn, nhận quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, tâm huyết Trong suốt q trình học tập, tơi xin có tri ân sâu sắc tới tập thể thầy giáo môn Bệnh Cây – Khoa Nông học, Ban quản lý đào tạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho Để hồn thiện luận này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Trung tâm Nghiên cứu bệnh nhiệt đới, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khố học thực đề tài nghiên cứu Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến tất bạn bè, người thân gia đình ln động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập thực luận văn Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Tác giả luận văn Lê Thị Như Quỳnh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận văn xii Thesis abstract xiv Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Cây chanh leo 2.1.1 Phân loại phân bố 2.1.2 Đặc điểm thực vật học 2.1.3 Sản xuất chanh leo giới Việt Nam 2.2 Thành phần bệnh hại chanh leo 2.2.1 Bệnh vi khuẩn 2.2.2 Bệnh nấm 2.2.3 Bệnh tuyến trùng 2.2.4 Bệnh virus 2.3 Potyvirus chanh leo 2.3.1 Đặc điểm chung potyvirus 2.3.2 Potyvirus chanh leo 10 2.3.3 Passion fruit woodines virus (PWV) 12 2.3.4 East Asian Passiflora virus (EAPV) 12 2.3.5 Telosma mosaic virus (TelMV) 13 2.3.6 Passiflora mottle virus (PaMoV) 14 2.4 Chẩn đoán potyvirus 16 iii 2.4.1 Chẩn đoán potyvirus RT-PCR 16 2.4.2 Chẩn đoán potyvirus kỹ thuật miễn dịch 16 2.4.3 Kỹ thuật que thử nhanh (lateral flow) 19 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Đối tượng nội dung nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng 21 3.1.2 Thời gian 21 3.1.3 Địa điểm 21 3.1.4 Nội dung nghiên cứu 21 3.2 Vật liệu dùng nghiên cứu 21 3.2.1 Vật liệu lây nhiễm nhân tạo 22 3.2.2 Vật liệu ELISA 22 3.2.3 Vật liệu PCR, RT-PCR 23 3.2.4 Vật liệu que thử nhanh 26 3.3 Thiết bị nghiên cứu 26 3.4 Phương pháp nghiên cứu 27 3.4.1 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu bệnh 27 3.4.2 Dòng hóa giải trình tự 28 3.4.3 Lây nhiễm nhân tạo tiếp xúc học 28 3.4.4 Lây nhiễm nhân tạo rệp 29 3.4.5 Phản ứng PTA-ELISA 29 3.4.6 Phản ứng RT-PCR 29 3.4.7 Tạo que thử nhanh 30 3.4.8 Xác định nồng độ AuNP (Haiss et al , 2007) 32 3.4.9 Liên kết kháng thể IgG thỏ với hạt AuNP 32 3.4.10 Tạo que thử nhanh 33 3.4.11 Đánh giá khả phát virus que thử nhanh 33 Phần Kết thảo luận 34 4.1 Xác định nguồn bệnh nhiễm potyvirus 34 4.1.1 Xác định nhiễm East Asian Passiflora virus (EAPV) 35 4.1.2 Xác định nhiễm Telosma mosaic virus (TelMV) 37 4.1.3 Xác định nhiễm Passiflora mottle virus (PaMoV) 38 iv 4.2 Đặc điểm sinh học Potyvirus Chanh leo 39 4.2.1 Kết lây nhiễm nhân tạo TelMV tiếp xúc học 40 4.2.2 Kết lây nhiễm nhân tạo PaMoV tiếp xúc học 40 4.2.3 Kết lây nhiễm nhân tạo EAPV-IB tiếp xúc học 42 4.2.4 Kết lây nhiễm potyvirus chanh leo rệp theo kiểu không bền vững 43 4.3 Đánh giá tính đặc hiệu kháng huyết đa dòng thỏ tạo Protein CP Pamov 44 4.3.1 Đánh giá hiệu giá tính đặc hiệu kháng huyết PaMoV bệnh 44 4.3.2 Đánh giá tính đặc hiệu kháng huyết PaMoV khỏe 46 4.3.3 Đánh giá tính đặc hiệu PaMoV protein tác nhân khóa miễn dịch potyvirus chanh leo 48 4.3.4 Đánh giá chung kháng huyết PaMoV 48 4.3.5 Ứng dụng kháng huyết PaMoV chẩn đoán potyvirus chanh leo thu thập năm 2020 49 4.4 Thử nghiệm tạo que thử nhanh chẩn đoán PaMoV 54 4.4.1 Tạo kháng thể gà đặc hiệu kháng thể thỏ 54 4.4.2 Tạo hạt nano vàng 54 4.4.3 Liên kết IgG với hạt AuNP 59 4.4.4 Thử nghiệm tạo que thử nhanh chẩn đoán PaMoV 66 Phần Kết luận đề nghị 71 5.1 Kết Luận 71 5.2 Đề NGHỊ 72 Tài liệu tham khảo 73 Phụ lục 79 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AP Alkaline phosphate Amp Ampicilin APS Amonium persulfate BSA Bovine Serum Albumine BVTV Bảo vệ thực vật Cam Chloraphenicol CP Coat protein CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid E.coli Escherichia coli EAPV-AO East Asian passiflora virus – Amami – O – Shima EAPV-IB East Asian passiflora virus – Ibusuki – Isolate ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay EtBr Ethidiumbromide g gravity gr Gram IgG Immunoglobulin gamma IgY Immonoglobulin Yolk IPTG Isopropyl – b, D – thiogalactoside Kan Kanamycine Kb Kilo base kDa Kilo dalton LB Luria Bertani Broth ꞵME Beta - Mecaptoethanol ml Mililiter mM Milimole NPP Nytrophenyl Phosphate OD Optical density ORF Open reading frame PaMoV Passiflora mottle virus vi PBS-T Phosphate Buffer Salin – Tween PCR Polymerase Chain Reaction PEG 6000 Polyethylene glycol 6000 PTA-ELISA Plate trapped antigen - ELISA PTS Phosphate Buffer Salin RE Restriction enzyme RNA Ribonucleic acid rpm Revolution per minute RT-PCR Reverse transcriptase - PCR SDS - PAGE Sodium dedecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis SOC Super Optimal Catabolite TAE Tris-acetate-EDTA TB Terrific Broth TBS Tris Buffer Salin TBS-T Tris Buffer Salin – Tween TelMV Telosma mosaic virus TEMED Tetramethyl ethylenediamine Tet Tetracyclin URT Untranslated region μg Microgram μl Microliter vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần potyvirus công bố nhiễm chanh leo 11 Bảng 2.2 Các cặp mồi chung công bố để phát potyvirus 16 Bảng 3.1 Các thí nghiệm sử dụng nghiên cứu lây nhiễm nhân tạo 22 Bảng 3.2 Các mồi sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 4.1 Phản ứng RT-PCR phát potyvirus chanh leo thu Lộc Bình – Lạng Sơn 35 Bảng 4.2 Kết tìm kiếm BLAST mẫu chanh leo LB4 dựa trình tự đoạn CI giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm RT-PCR 36 Bảng 4.3 Kết tìm kiếm BLAST mẫu chanh leo LB4 dựa trình tự đoạn Nib3’End giải trình tự từ plasmid (clone1) 37 Bảng 4.4 Kết tìm kiếm BLAST mẫu chanh leo SL7 dựa trình tự đoạn CI giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm RT-PCR 38 Bảng 4.5 Kết tìm kiếm BLAST mẫu chanh leo TL2 dựa trình tự đoạn CI giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm RT-PCR 39 Bảng 4.6 Kết lây nhiễm nhân tạo TelMV (mẫu SL7) tiếp xúc học 40 Bảng 4.7 Kết lây nhiễm nhân tạo PaMoV-TL2 tiếp xúc học 41 Bảng 4.8 Kết lây nhiễm nhân tạo EAPV-IB tiếp xúc học 43 Bảng 4.9 Kết lây nhiễm potyvirus chanh leo rệp (Aphis gossypii) theo kiểu không bền vững 44 Bảng 4.10 Đánh giá tính đặc hiệu KHT PaMoV PTA-ELISA dựa mẫu nhiễm PaMoV 45 Bảng 4.11 Đánh giá tính đặc hiệu KHT PaMoV PTA-ELISA dựa mẫu chanh leo khỏe 47 Bảng 4.12 Đánh giá tính đặc hiệu KHT PaMoV PTA-ELISA potyvirus chanh leo (EAPV-IB TelMoV) protein (BSA Skim milk) 48 Bảng 4.13 RT-PCR PTA-ELISA phát potyvirrus mẫu chanh leo thu Việt Nam năm 2020 51 Bảng 4.14 Đặc tính quang học miền xuất cộng hưởng dao động plasma lượng tử bề mặt (surface plasmon resonance, SPR) công thức AuNP 56 viii Kết kiểm tra (Bảng 4.19) cho thấy tất loại đệm, vạch đối chứng hình thành, chứng tỏ khả liên kết kháng thể gà IgY kháng thể thỏ IgG không bị ảnh hưởng đệm Tuy nhiên, đệm DSMZ xuất băng vạch kiểm tra mẫu bệnh không xuất băng kiểm tra đối chứng khỏe Bảng 4.19 Đánh giá đệm chuẩn bị mẫu cho thử nghiệm que thử nhanh PaMoV Cây nhiễm PaMoVb Đệm Thành phầna PBS-TTP Tris-EPM DSMZ Cây khỏec Vạch đối chứng Vạch kiểm tra Vạch đối chứng Vạch kiểm tra PBS, 0.1% Tween 20, 0.5% Triton X-100, 1% PVP (Byzova et al., 2010) + - + - 0.2 M Tris/HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA-Na2, 0.1% PVP, 0.1% Mercaptoethanol (Zhang et al , 2015) + - + + Đệm que thử nhanh (DSMZ, Đức) + + + - Ghi chú: a) PVP (polyvinyl polypyrrolidone) b) Cây chanh leo nhiễm PaMoV kiểm tra RT-PCR c) Cây khỏe: chanh leo non trồng từ hạt 4.4.4.3 Đánh giá tính đặc hiệu que thử nhanh PaMoV Vì kháng thể PaMoV chứng tỏ phát TelMV EAPV-IB nên thí nghiệm này, que thử nhanh tạo dùng kháng thể PaMoV đánh giá khả phát TelMV EAPV-IB Đệm nghiền mẫu sử dụng đệm DSMZ Kết kiểm tra (Bảng 4.20, Hình 4.14) cho thấy que thử phát mẫu nhiễm PaMoV khơng có phản ứng mẫu nhiễm TelMV EAPV đối chứng khỏe 68 Bảng 4.20 Đánh giá tính đặc hiệu que thử nhanh PaMoV Mẫu Xuất Băng Vạch đối chứng Vạch kiểm tra Chanh leo nhiễm PaMoV (ĐL, A13-34, H40) + + Chanh leo nhiễm TelMV (SL7) + - Chanh leo nhiễm EAPV-IB (LB4) + - Chanh leo khỏe + - Ghi chú: (+) : xuất băng, (-) khơng xuất băng Hình 4.14 Đánh giá tính đặc hiệu que thử nhanh PaMoV 4.4.4.4 Đánh giá độ hịa lỗng mẫu thử nghiệm que thử nhanh PaMoV Độ hịa lỗng mẫu phản ánh độ nhạy thử nghiệm Trong thí nghiệm này, mẫu chanh leo nhiễm PaMoV nghiền đêm DSMZ với tỷ lệ 1/10 (w/v) Dịch nghiền hịa lỗng với đệm DSMZ để độ hịa lỗng 1/100, 1/200 1/500 Kết kiểm tra (bảng 4.21, hình 15) cho thấy độ hịa lỗng 1/200, que thử pháts PaMoV, băng kiểm tra mờ Kết phù hợp nhìn chung độ nhạy que thử nhanh thường ELISA 69 Do độ hịa lỗng mẫu khuyến cáo tất thử nghiệm miễn dịch, kể que thử nhanh 1/10 nên kết chứng tỏ que thử hồn tồn áp dụng thực tiễn đồng ruộng Bảng 4.21 Đánh giá độ hịa lỗng mẫu thử nghiệm que thử nhanh PaMoV Độ hịa lỗng (g/mL Xuất Băng Vạch đối chứng Vạch kiểm tra 1/10 + +++ 1/100 + + 1/200 + ± 1/500 + - Ghi chú: (+) : xuất băng, (-) không xuất băng; mức +++, +, ± vạch kiểm tra dựa độ đậm băng phản ứng; mẫu kiểm tra nhiễm PaMoV (ĐL) Hình 4.15 Đánh giá độ hịa lỗng mẫu thử nghiệm que thử nhanh PaMoV 70 5PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Giải trình tự vùng gen mã hóa đoạn CI trực tiếp từ sản phẩm RT-PCR vùng gen NIb-3’End dịng hóa vector pTZ57 xác định xác mẫu chanh leo TL2 (thu Mộc Châu – Sơn La) nhiễm Passiflora mottle virus (PaMoV), mẫu SL7 (thu Mộc Châu – Son La) nhiễm Telosma mosaic virus (TelMV) mẫu LB4 (thu Lộc Bình – Lạng Sơn) nhiễm East Asian Passiflora virus - chủng IB (EAPV-IB) Lây nhiễm nhân tạo potyvirus PaMoV, TelMV EAPV-IB tiếp xúc học cho thấy chúng nhiễm hệ thống chanh leo nhiễm cục thị rau muối đỏ Ba virus không nhiễm thuốc giống K326 thuốc cảnh, không nhiễm họ đậu (Pisum sativum, Phaseolus vulgaris Vigna unguiculata) Trong virus, PaMV dễ dàng nhiễm lạc tiên ( Passiflora foetida) tạo triệu chứng khảm điển hình Lây nhiễm nhân tạo potyvirus PaMoV, TelMV EAPV-IB chanh leo rệp (Aphis gossypii) cho thất tất virus truyền qua rệp theo kiểu khơng bền vững Kết thí nghiệm PTA-ELISA phân tích thống kê (t test) cho thấy kháng huyết đa dòng thỏ gây miễn dịch với protein CP PaMoV không phản ứng với protein chanh leo, protein tác nhân khóa phản ứng miễn dịch gồm BSA Skim milk phát dễ dàng PaMoV mẫu chanh leo bệnh Kháng huyết PaMoV phản ứng với hai potyvirus gây hại chanh leo Việt Nam TelMV EAPV-IB ứng dụng để chọn tạo giống chanh leo potyvirus Kết kiểm tra PTA-ELISA với kháng huyết PaMoV RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu potyvirus cặp mồi đặc hiệu PaMoV, TelMV, EAPV-IB EAPV-AO 55 mẫu chanh leo thu năm 2020 11 địa điểm thuộc Đức Trọng - Lâm Đồng, Mộc Châu - Sơn La, Vân Hồ - Sơn La Quế Phong - Nghệ An cho thấy 52 mẫu (94,5 %) nhiễm PaMoV, 17 mẫu (30,9 %) nhiễm TelMV, 47 mẫu (85,5 %) nhiễm EAPV-IB 20 mẫu (36,4 %) nhiễm EAPV-AO Đáng ý, kết kiểm tra RT-PCR cho thấy nhiễm hỗn hợp potyvirus chanh leo Việt Nam phổ biến Trong tổng số 55 mẫu kiểm tra có mẫu nhiễm virus, 71 có tới 26 mẫu nhiễm virus, 20 mẫu nhiễm virus, chí có mẫu nhiễm potyvirus Đã tổng hợp hạt AuNP (nano vàng) có chất lượng tốt với kích thước phạm vi 28 – 33.3 nm phù hợp để tạo que thử nhanh Kết thí nghiệm tối ưu cho thấy khả liên kết kháng thể IgG (PaMoV) vào hạt AuNP không phụ thuộc pH lượng kháng thể tối ưu để liên kết ổn định hệ keo AuNP ~ µg IgG/mL AuNP Hai loại kháng thể tạo gồm IgG thỏ đặc hiệu PaMoV IgY gà đặc hiệu IgG thỏ hạt AuNP sử dụng để tạo que thử nhanh Kết thí nghiệm cho thấy que thử phát PaMoV với đệm chiêt mẫu đệm chuyên dùng cho que thử nhanh viện DSMZ cung cấp Que thử phát PaMoV mẫu chanh leo với độ hịa lỗng 1/200 Que thử PaMoV không phản ứng với TelMV EAPV-IB 5.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục thử nghiệm nhằm tối ưu hóa việc sản xuất que thử nhanh nhằm chẩn đoán PaMV, chủ yếu xác định đệm chiết mẫu cần thiết làm tăng độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng Đánh giá khả nhiễm chéo ác potyvirus chanh leo nhằm xác định ảnh hưởng chúng đến mức độ biểu triệu chứng 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Acevedo-Rodríguez P (2005) Vines and climbing plants of Puerto Rico and the Virgin Islands Contributions from the United States National Herbarium 51: 1-483 Akamine E K., Aragaki M., Beaumont J H., Bowers F., Hamilton R A., Nishida T., Sherman G D., Shoji K., Storey W & Martinez A P (1974) Passion fruit culture in Hawaii Cooperative Extension Service University of Hawaii; Revised edition Amata R., Otipa M., Waiganjo M., Wabule M., Thuranira E., Erbaugh M & Miller S (2009) Incidence, prevalence and severity of passion fruit fungal diseases in major production regions of Kenya Journal of Applied Biosciences 20: 1146-1152 Ariffin N., Yusof N A., Abdullah J., Abd Rahman S F., Ahmad Raston N H., Kusnin N & Suraiya S (2020) Lateral Flow Immunoassay for Naked Eye Detection of Mycobacterium tuberculosis Journal of Sensors Arocha Y., Piñol B., Acosta K., Almeida R., Devonshire J., Van de Meene A., Boa E & Lucas J (2009) Detection of phytoplasma and potyvirus pathogens in papaya (Carica papaya L.) affected with ‘Bunchy Top Symptom’(BTS) in eastern Cuba Crop Protection 28(8): 640-646 Arogundade O., Oyekanmi J., Oresanya A., Ogunsanya P., Akinyemi S & Lava Kumar P (2018) First report of passion fruit woodiness virus associated with passion fruit woodiness disease of passion fruit in Nigeria Plant Disease 102(6): 1181 Arous S., Harmon C., Capobianco H & Polston J (2018) Comparison of genus-specific primers in RT-PCR for the broad-spectrum detection of viruses in the genus Potyvirus by plant diagnostic laboratories Journal of virological methods 258: 29-34 Bahadır E B & Sezgintürk M K (2016) Lateral flow assays: Principles, designs and labels TrAC Trends in Analytical Chemistry 82: 286-306 Benscher D., Pappu S., Niblett C., Varón de Agudelo F., Morales F., Hodson E., Alvarez E., Acosta O & Lee R (1996) A strain of soybean mosaic virus infecting Passiflora spp in Colombia Plant Disease 80(3): 258-262 Bernacci L C., Soares-Scott M D., Junqueira N T V., Passos I R d S & Meletti L M M (2008) Passiflora edulis Sims: the correct taxonomic way to cite the yellow passion fruit (and of others colors) Revista Brasileira de fruticultura 30(2): 566-576 Bin Y., Li Z., Wu J., Wang X., Zhou Y., Li T., Yang F., Zhou C & Song Z (2018) Development of an immunochromatographic strip test for rapid detection of citrus yellow vein clearing virus Archives of virology 163(2): 349-357 Braun-Kiewnick A., Altenbach D., Oberhänsli T., Bitterlin W & Duffy B (2011) A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis Journal of microbiological methods 87(1): 1-9 Byzova N A., Safenkova I V., Slutskaya E S., Zherdev A V & Dzantiev B B (2017) Less is more: A comparison of antibody–gold nanoparticle conjugates of different ratios Bioconjugate chemistry 28(11): 2737-2746 Byzova N., Safenkova I., Chirkov S., Avdienko V., Guseva A., Mitrofanova I., Zherdev A., Dzantiev B & Atabekov J (2010) Interaction of plum pox virus with specific colloidal gold-labeled antibodies and development of immunochromatographic assay of the virus Biochemistry (Moscow) 75(11): 1393-1403 CABI (2013) Passiflora edulis (passionfruit) [original text by Christopher E Buddenhagen, Florida State University, USA] In: Invasive Species Compendium Wallingford, UK: CAB International Retrieved from www.cabi.org/isc on October, 2020 73 Cerqueira-Silva C., Conceiỗóo L., Souza A & Corrêa R (2014) A history of passion fruit woodiness disease with emphasis on the current situation in Brazil and prospects for Brazilian passion fruit cultivation European Journal of Plant Pathology 139(2): 261-270 Chang S., Puryear J & Cairney J (1993) A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees Plant molecular biology reporter 11(2): 113-116 Chen B., Wu D., Zheng H., Li G., Cao Y., Chen J., Yan F., Song X & Lin L (2021a) Complete genome sequence of passiflora virus Y infecting passion fruit in China Archives of virology 1-5 Chen J & Adams M (2001) A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several members of the family Archives of virology 146(4): 757-766 Chen L J., Zhang X X., Lu Y L & An Y X (2021b) First report of turnip mosaic virus on yellow passion fruit in China Journal of Plant Pathology 103(1): 401-401 Chen S., Yu N., Yang S., Zhong B & Lan H (2018) Identification of Telosma mosaic virus infection in Passiflora edulis and its impact on phytochemical contents Virology journal 15(1): 1-8 Chiemsombat P., Prammanee S & Pipattanawong N (2014) Occurrence of Telosma mosaic virus causing passion fruit severe mosaic disease in Thailand and immunostrip test for rapid virus detection Crop Protection 63: 41-47 Chong Y H., Cheng Y H., Cheng H W., Huang Y C & Yeh S D (2018) The virus causing passionfruit woodiness disease in Taiwan is reclassified as East Asian passiflora virus Journal of General Plant Pathology 84(3): 208-220 Clark M F & Adams A (1977) Characteristics of the microplate method of enzymelinked immunosorbent assay for the detection of plant viruses Journal of General Virology 34(3): 475-483 Coutts B & Jones R (2015) Potato virus Y: Contact transmission, stability, inactivation, and infection sources Plant Disease 99(3): 387-394 Coutts B A., Kehoe M A., Webster C G., Wylie S J & Jones R A (2011) Indigenous and introduced potyviruses of legumes and Passiflora spp from Australia: biological properties and comparison of coat protein nucleotide sequences Archives of virology 156(10): 1757 Coutts B., Kehoe M & Jones R (2013) Zucchini yellow mosaic virus: Contact transmission, stability on surfaces, and inactivation with disinfectants Plant Disease 97(6): 765-771 Davis R., Thomas J., McMichae L., Dietzgen R., Callaghan B., James A., Gumia T & Rahamma S (2002) Plant virus surveys on the island of New Guinea and adjacent regions of northern Australia Australasian Plant Pathology 31(4): 385-390 Dijkstra J & de Jager C (2012) Practical plant virology: protocols and exercises Springer Science & Business Media Do D H., Chong Y H., Ha V C., Cheng H W., Chen Y K., Bui T N L., Nguyen T B N & Yeh S D (2021) Characterization and detection of Passiflora mottle virus and other two potyviruses causing passionfruit woodiness disease in Vietnam Phytopathology (ja) Dong J., Carpinone P L., Pyrgiotakis G., Demokritou P & Moudgil B M (2020) Synthesis of precision gold nanoparticles using Turkevich method KONA Powder and Particle Journal 37: 224-232 74 Fischer I H & Rezende J A (2008) Diseases of passion flower (Passiflora spp.) Pest technology 2(1): 1-19 Frens G (1973) Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions Nature physical science 241(105): 20-22 Fukumoto T., Nakamura M., Rikitake M & Iwai H (2012) Molecular characterization and specific detection of two genetically distinguishable strains of East Asian Passiflora virus (EAPV) and their distribution in southern Japan Virus genes 44(1): 141-148 Gadhave K R., Gautam S., Rasmussen D A & Srinivasan R (2020) Aphid Transmission of Potyvirus: The Largest Plant-Infecting RNA Virus Genus Viruses 12(7): 773 Geoghegan W D (1988) The effect of three variables on adsorption of rabbit IgG to colloidal gold Journal of Histochemistry & Cytochemistry 36(4): 401-407 Gerbaud P (2013) Passion Fruit FruitTrop Cirad.: FruiTrop Gibbs A & Mackenzie A (1997) A primer pair for amplifying part of the genome of all potyvirids by RT-PCR Journal of virological methods 63(1-2): 9-16 Green S K (1984) Guidelines for diagnostic work in plant virology The Asian Vegetable Research and Development Center Ha C., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M & Dale J (2008a) Design and application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic characterization of potyviruses Archives of virology 153(1): 25-36 Ha C., Revill P., Harding R M., Vu M & Dale J L (2008b) Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam Archives of virology 153(1): 45-60 Hà Viết Cường, Lê Thị Tuyết, Trần Nguyễn Hà, Nguyễn Đức Huy & Đỗ Tấn Dũng (2021) Tạo kháng huyết đa dòng protein vỏ tái tổ hợp Passiflora mottle virus nhiễm chanh leo Việt Nam Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 19(2): 195-205 Haiss W., Thanh N T., Aveyard J & Fernig D G (2007) Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV− Vis spectra Analytical chemistry 79(11): 4215-4221 Hermanson G T (2013) Bioconjugate techniques Academic press Hull R (2013) Plant virology Fifth edition Academic press Iwai H., Ohmori T., Kurokawa Y., Muta T & Arai K (1996) New record of passionfruit woodiness virus in Japan Japanese Journal of Phytopathology 62(5): 459-465 Iwai H., Terahara R., Yamashita Y., Ueda S & Nakamura M (2006a) Complete nucleotide sequence of the genomic RNA of an Amami-O-shima strain of East Asian Passiflora potyvirus Archives of virology 151(7): 1457-1460 Iwai H., Yamashita Y., Nishi N & Nakamura M (2006b) The potyvirus associated with the dappled fruit of Passiflora edulis in Kagoshima prefecture, Japan is the third strain of the proposed new species East Asian Passiflora virus (EAPV) phylogenetically distinguished from strains of Passion fruit woodiness virus Archives of virology 151(4): 811-818 Koczula K M & Gallotta A (2016) Lateral flow assays Essays in biochemistry 60(1): 111-120 Koenig R & Paul H (1982) Variants of ELISA in plant virus diagnosis Journal of virological methods 5(2): 113-125 75 Kranthi K., Davis M., Mayee C., Russell D., Shukla R., Satija U., Kshirsagar M., Shiware D & Kranthi S (2009) Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for ‘quality-control’assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format Crop Protection 28(5): 428-434 Langeveld S A., Dore J M., Memelink J., Derks A F., van der Vlugt C I., Asjes C J & Bol J F (1991) Identification of potyviruses using the polymerase chain reaction with degenerate primers Journal of General Virology 72(7): 1531-1541 Lima J A A., Nascimento A K Q., Radaelli P & Purcifull D E (2012) Serology applied to plant virology Serological diagnosis of certain human, animal and plant diseases Rijeka, Croatia: InTech 1: 71-94 Ma L., Li M Y., Chang C Y., Chen F F., Hu Y & Liu X D (2019) The host range of Aphis gossypii is dependent on aphid genetic background and feeding experience PeerJ 7: e7774 Manicom B., Ruggiero C., Ploetz R & Goes A d (2003) Diseases of passion fruit Diseases of tropical fruit crops 413-441 Mowat W & Dawson S (1987) Detection and identification of plant viruses by ELISA using crude sap extracts and unfractionated antisera Journal of virological methods 15(3): 233-247 Nakamura M & Iwai H (2020) Effects of coinfection with East Asian Passiflora virus and East Asian Passiflora distortion virus on Passiflora foetida Journal of General Plant Pathology 1-8 Nguyen H D., Tran H T N & Ohshima K (2013) Genetic variation of the Turnip mosaic virus population of Vietnam: a case study of founder, regional and local influences Virus Research 171(1): 138-149 Nguyen T., Burgess T., Dau V., Le V., Trinh T., Pham T & Burgess L (2015) Phytophthora stem rot of purple passionfruit in Vietnam Australasian Plant Disease Notes 10(1): 1-4 Noveriza R., Suastika G., Hidayat S H & Kartosuwondo U (2012) POTYVIRUS ASSOCIATED WITH MOSAIC DISEASE ON PATCHOULI (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) PLANTS IN INDONESIA J ISSAAS 18(1): 131-146 Noveriza R., Suastika G., Hidayat S H & Natsuaki K T (2016) Molecular Cloning and Sequencing of Telosma Mosaic Virus (TeMV) Causing Mosaic Disease on Patchouli Plant Pathology Journal 15(2): 65 Ochwo-Ssemakula M., Sengooba T., Hakiza J., Adipala E., Edema R., Redinbaugh M., Aritua V & Winter S (2012) Characterization and distribution of a Potyvirus associated with passion fruit woodiness disease in Uganda Plant Disease 96(5): 659-665 Omatsu N., Iwai H., Setokuchi O & Arai K (2004) Immigrating aphid species and their importance as vectors of Passionfruit woodiness virus in the fields of Amami Oshima Island, Japan Memorial Faculty Agriculture Kagoshima University 39: 1-5 Pappu S., Brand R., Pappu H., Rybicki E., Gough K H., Frenkel M J & Niblett C (1993) A polymerase chain reaction method adapted for selective amplification and cloning of 3'sequences of potyviral genomes: application to dasheen mosaic virus Journal of virological methods 41(1): 9-20 Parry J., Davis R & Thomas J (2004) Passiflora virus Y, a novel virus infecting Passiflora spp in Australia and the Indonesian Province of Papua Australasian Plant Pathology 33(3): 423-427 76 Ribeiro J & Dias M (2005) Diseases of passion fruit Informe Agropecuario 26(228): 36-39 Rodrigues L K., Silva L A., Garcêz R M., Chaves A L., Duarte L M., Giampani J S., Colariccio A., Harakava R & Eiras M (2015) Phylogeny and recombination analysis of Brazilian yellow passion fruit isolates of Cowpea aphid-borne mosaic virus: origin and relationship with hosts Australasian Plant Pathology 44(1): 31-41 Sato Y., Inudo K., Nakamura M., Fukumoto T., Takushi T., Fuji S.-i & Iwai H (2019) East Asian Passiflora distortion virus: a novel potyvirus species causing deformation of passionfruits in Japan Journal of General Plant Pathology 85(3): 221-231 Selvarajan R., Kanichelvam P S., Balasubramanian V & Subramanian S S (2020) A rapid and sensitive lateral flow immunoassay (LFIA) test for the on-site detection of banana bract mosaic virus in banana plants Journal of virological methods 284: 113929 Shukla D D., Lauricella R & Ward C W (1992) Serology of potyviruses: current problems and some solutions In: Potyvirus Taxonomy Springer: 57-69 pages Simmons H E & Munkvold G P (2014) Seed transmission in the Potyviridae In: Global perspectives on the health of seeds and plant propagation material Springer: 3-15 Souiri A., Zemzami M., Amzazi S & Ennaji M M (2014) Polyclonal and monoclonal antibody-based methods for detection of plant viruses Eur J Sci Res 123(3): 281-295 Taylor R & Greber R (1973) Passionfruit woodiness virus CMI/AAB Descriptions of plant viruses 122(4) Turkevich J., Stevenson P C & Hillier J (1951) A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold Discussions of the Faraday Society 11: 55-75 Van Regenmortel M H (2014) Specificity, polyspecificity and heterospecificity of antibody-antigen recognition Journal of Molecular Recognition 27(11): 627-639 Vieira M L C & Carneiro M S (2005) 17.1 Passiflora spp Passionfruit General Editor: Gabrielle J Persley, The Doyle Foundation, Glasgow, Scotland.: 436 Wang Y., Wang L., Zhang J., Wang G., Chen W., Chen L & Zhang X (2014) Preparation of colloidal gold immunochromatographic strip for detection of Paragonimiasis skrjabini PloS one 9(3): e92034 Wylie S J & Jones M G (2011) The complete genome sequence of a Passion fruit woodiness virus isolate from Australia determined using deep sequencing, and its relationship to other potyviruses Archives of virology 156(3): 479-482 Wylie S J., Adams M., Chalam C., Kreuze J., López-Moya J J., Ohshima K., Praveen S., Rabenstein F., Stenger D & Wang A (2017) ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae The Journal of general virology 98(3): 352 Xie L., Gao F., Shen J., Zhang X., Zheng S., Zhang L & Li T (2020) Molecular characterization of two recombinant isolates of telosma mosaic virus infecting Passiflora edulis from Fujian Province in China PeerJ 8: e8576 Xie L., Gao F., Zheng S., Zhang X., Zhang L & Li T (2019) Molecular characterization of a new potyvirus infecting passion fruit Archives of virology 164(7): 1903-1906 Xie L., Zhang X., Zheng S., Zhang L & Li T (2017) Molecular identification and specific detection of Telosma mosaic virus infecting passion fruit Scientia Agricultura Sinica 50(24): 4725-4734 77 Yang K., Yan H., Song L., Jin P., Miao W & Cui H (2018) Analysis of the complete genome sequence of a potyvirus from passion fruit suggests its taxonomic classification as a member of a new species Archives of virology 163(9): 2583-2586 Yao L., Li X., Wang J., Chen S & Wang X (2019) First Report of Telosma Mosaic Virus Infecting Emperor’s Candlesticks (Senna alata) in China Plant Disease 103(3): 594-594 Zhang Y., Wang Y., Meng J., Xie Z., Wang R., Kutcher H R & Guo Z (2015) Development of an immunochromatographic strip test for rapid detection of lily symptomless virus Journal of virological methods 220: 13-17 Zheng L., Rodoni B., Gibbs M & Gibbs A J (2010) A novel pair of universal primers for the detection of potyviruses Plant pathology 59(2): 211-220 Zibadi S & Watson R R (2004) Passion fruit (Passiflora edulis) Evidence-Based Integrative Medicine 1(3): 183-187 78 PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự mẫu potyvirus chanh leo >LB4 (CI, giải trình tự trực tiếp) AAGGAAGGGAAGTCCTCCTTCTTGAACCAACAAGGCCACTTGCGGAAAACGTGAGTAAACAATTGAAT GGTGACCCTTTTTATCAGATGGTAACACTGAGAATGAGGGGTCTTAGCAAATTTGGTTCAAGCAACATT ACAGTAATGACTAGTGGATTTGCTTTTCATTATTATGTAAATAATCCTAATCAATTAGCAGAGTTTGATTT TATAATCATAGATGAGTGTCATGTGTTAGATAGTTCAACCATAGCCTTTAATTGTGCCTTGAAGGAATAT GAGTTTTCAGGTAAATTAATAAAAGTCTCGGCTACACCTCCAGGCAGAGAGTGTGAATTCACCACCCAG CATCCAGTTAAACTCAAAATGGAGGACCAGATTTCGTTTCAACATTTTGTAAATGCTCAAGGAACGGGG TCAAATGCTGATATGGTCCAACATGGTCATAATTTGCTGGTTTATGTAGCTAGCTACAACGAGGTTGAT CAATTGTCGCGTCTACTGATAGAGCGTCAATTCAAAGTGACTAAAGTCGATGGCAGGACAATGCAGAA AGGAAATGTTGAGATAGTCACTTCGGGTGTGGAAGGAAAACCACATTTTATAGTAGCCACCAACATCA TCGAGAACGGCGT >LB4 (CI, giải trình tự từ plasmid pTZ-57 clone 1, mồi SeqF T7-Ter) ATTGAAAAACGTCTTGTCTTCTTTGCAAATGGGGATGATATAATTTTAGCTGTGCGGGAGGAGGACTCG TGGTTGTATGATAAGTTGGGTCCTTCATTTGCTGAACTTGGATTGAACTACACTTTTGATGATCGCTCGA AAAAGCGTGAAGATTTGTGGTTTATGTCTCACACAGCTATTGAAGTGGAAGGCATGTACATCCCTAAGC TTGAACCTGAACGGATTGTTTCAATCCTTGAATGGGATAGGAGCAAAGAGATTATGCATAGGACAGAG GCAATTTGCGCAGCTATGATTGAAGCATGGGGCTACACTGATTTACTGCGTGAAATTCGAAAGTTTTAC TTGTGGCTTGTTCAGAAAGATGAATTCAAAGAACTTGCAGCAGTTGGCAAAACGCCATACATTGCAGA AACAGCTTTGAAGAAGCTTTACACAGACAAGAATGCCAGTTTGGACGAGCTACAAGAATATTTGCGT GTCCTAGATTTCGAGCACACGGAAGGTTGCTGTGAATCCGTGTCCCTCCAGTCATTCACTGGAAAAGAT AAAGAGGAGGAAAACAAAGACACCATCGATGCTGGAGGCGATGGGGGAAGAAAAGATAAAGGAAAA GAGACGAAAACAGGAACTCTAGCAACCCTTGAAAATCCAAATCCCAAGAATCCAAATGACGGTGGCGG CTTGTCTCTATCTAGAGACAAAGATGTTAATGCCGGCTCAAAAGGCAGCATAGTGCCCCGACTGCAAAA GATCACCAAGAAGATGAATCTGCCAACTGTTAAAGGGAGAGTGATACTCAACTTGGATCATTTGATCG AATACGCTCCAAATCAGGTGAATTTATACAATACTAGGGCAACCAAGTCACAATTTGAGTCCTGGTATT CTGCAGTCCAAAAAGAATATGAGCTGGATGACAATCAAATGAGCGTCATCATGAATGGTTTCATGGTTT GGTGCATTGATAATGGCACCTCACCAAATACTAATGGCATGTGGGTGATGATGGACGGAGATGAGCAG ATCGAATACCCATTAAAGCCATTAGTTGAAAATGCTCAGCCCACTCTGAGACAGATAATGCACCATTTTT CTGATGCGGCTGAGGCATATATAGAGATGAGAAATTCCAAAGAGCCGTACATGCCTAGGTATGGTACT CTGCGGAATTTGAGGGACTTGAGTTTGGCTCGCTATGCTTTTGACTTTTATGAGGTCACATCCAAAACG CCAAACAGAGCAAGAGAAGCGGTAGCTCAGATGAAGGCCGCTGCCCTCGCGAACGTTTCCACTAGGTT GTTTGGCCTTGATGGAAACGTTTCAACAAACAGCGAGAATACTGAAAGGCACACTGCAAGGGACGTTA ATCAAAATATGCATACCCTTTTGGGAATGGGTCATCCGCAGTAAAGGTTAGGTAAACTGACCACAGTTA GCATCTCGCATCGCCTTTAAATATCTATAGTAGTATAGCTTTCACTCTCTTTAAGTTTAGTGTGGTTATAC CACCTTCCGTCATGCTTATTGTGATAGTGTGGCTTTGCCACCAGTGTCTGTGATATCTATAGAATAGAGT CGGGGCAGGGAGAACCATTGCAACGCCGGAGCTTTCAGAGTGGGTCACCCACGCGCACTGACCGAGG TTTGGCAATGTTTGTTGTCCG >SL7 (CI, giải trình tự trực tiếp) AAGGAAAGTCCTACTATTGGAACCTACAAGACCTTTGGCTGAAAATGTTAGTAGGCAGTTGAGTGGTG ATCCTTTTTACCAAAATGTTACACTCAGGATGAGAGGTTTGAGTAAGTTTGGGTCCAGCAATATCACAG TGATGACTAGTGGATTCGCGTTTCATTATTATGTCAACAACCCACAGCAACTATGTGATTTTGATTACAT AATCATTGATGAATGTCATGTCATGGATAGCTCAACTATAGCCTTCAATTGTGCTCTAAAGGAATTTTCA 79 TATGCTGGTAAGTTATTGAAGGTTTCCGCAACACCACCAGGGAGGGAATGTGAATTCGCAACTCAACAT CCAGTCAAGCTCAAAATTGAAGAGCATCTCTCATTTCAGCAGTTCGTTCAAGCTCAAGGAAGTGGTGCA AATGCTGACATGATTCAACATGGGTGCAATGTTCTGGTTTATGTGGCGAGCTATAATGAGGTGGATCA GCTCTCTAGATTGTTGTCAGAGAAGCAATTCAAAGTTACAAAAGTGGATGGCCGCACAATGCAAATGG GCAATGTTGAAATTTCAACATCAGGCACTTCAGCTAAACCACACTTTATTGTAGCCACCAACATAATAGA AAACGGCGTA >TL2 (CI, giải trình tự trực tiếp) GCTTCTCGAACCAACACGACCATTGGCAGAAAATGTAAGCAAGCAACTCGGTTGTGACCCGTTTTACCA CACAGTGACGCTCAGGATGAGAGGTTTGAGTAAATTTGGCTCAAGTAACATTACAGTAATGACAAGTG GCTTCGCTTTTCATTATTATGCAAACAACCCATCACAGTTGGCAGATTTTGACTTTATAATTATAGATGAA TGTCACGTCTTGGACAGTTCCACAATCGCTTTCAATTGCGCTCTCAAAGAGTACTCATATGCGGGAAAG CTGATAAAAGTATCTGCCACACCACCAGGTAGAGAGTGTGAATTCACAACCCAACATCCAGTCAAACTT AAAATTGAGGATCAATTATCTTTCCAAAGTTTTGTTCAAGCTCAAGGAACTGGTGCAAATGCAGACATG ATACAACACGGACATAACATACTTGTCTATGTCTCCAGCTACAATGAGGTTGATCAACTCACAAGGTTG TTAACAGAGAGACAGTACAAGGTCACTAAAGTCGATGGAAGAACTATGCAAATGGGTAACACTGAGAT TATGACAACTGGAGTTGAAGGAAAACCGCATTTTGTTGTAGCCACCAACAT 80 81 82