Phân lập và thiết kế vector chỉnh sửa gen osnramp2 liên quan đến tích lũy sắt ở giống lúa tbr225

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHỈNH SỬA GEN OSNRAMP2 LIÊN QUAN ĐẾN TÍCH LŨY SẮT Ở GIỐNG LÚA TBR225” Hà Nội, tháng 10/2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHỈNH SỬA GEN OSNRAMP2 LIÊN QUAN ĐẾN TÍCH LŨY SẮT Ở GIỐNG LÚA TBR225” Tên sinh viên : Nguyễn Văn Tồn Ngành : Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Duy Phương TS Bùi Thị Thu Hương Hà Nội, tháng 10/2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan báo cáo thời gian qua Những số liệu kết nghiên cứu trung thực, hoàn toàn thực môn Bệnh học Phân tử Viện Di truyền Nông nghiệp, không chép nguồn khác Ngoài ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn nguồn thích rõ ràng Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà nội, ngày 15 tháng năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Văn Toàn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, tơi cịn nhận quan tâm giúp đỡ nhiều tập thể cá nhân Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Duy Phương, ThS Phùng Thị Thu Hương – Bộ môn Bệnh học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp cô TS Bùi Thị Thu Hương - Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ Sinh học  Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện cho tơi, hướng dẫn tận tình, chu đáo giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, xin chân cảm ơn giúp đỡ quý báu, nhiệt tình tập thể cán thuộc môn Bệnh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp, nơi tơi tiến hành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam có ý kiến đóng góp để tơi hồn thành khóa luận cách hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Văn Toàn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu, ý nghĩa đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Dinh dưỡng vi chất lúa gạo 2.1.1 Một số vi chất quan trọng 2.1.2 Nghiên cứu cải thiện vi chất lúa gạo 2.2 Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 2.2.1 Giới thiệu công nghệ chỉnh sửa gen 2.2.2 Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 2.3 Chuyển gen thực vật hệ thống vector chuyển gen 11 2.3.1 Phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A.tumerfaciens 11 2.3.2 Hệ thống vector chuyển gen 12 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Đối tượng, vật liệu hóa chất nghiên cứu 15 3.1.1 Đối tượng 15 3.1.2 Vật liệu 15 iii 3.1.3 Hóa chất, thiết bị 15 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn kit Fermentas 16 3.2.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp xử lí với enzym cắt giới hạn 17 3.2.3 Điện di DNA gel agarose 1% 17 3.2.4 Tinh DNA từ gel agarose 17 3.2.5 Ghép nối DNA T4 DNA ligase 18 3.2.6 Nhân đoạn DNA đặc hiệu kỹ thuật PCR 18 3.2.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn 18 3.2.8 Thiết kế trình tự gRNA đặc hiệu chỉnh sửa gen Ram2-TBR 19 3.2.9 Giải trình tự DNA 19 3.2.10 Thiết kế vector cho biểu gRNA đặc hiệu chỉnh sửa Ram2-TBR 20 3.2.11 Thiết kế vector chuyển gen tế bào thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa gen Ram2 21 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Phân lập giải trình tự đầy đủ đoạn gen Ram2-TBR 23 4.1.1.Phân lập Ram2-TBR 23 4.1.2 Giải trình tự Ram2-TBR 24 4.2 Thiết kế trình tự crRNA chỉnh sửa gen Ram2-TBR 25 4.3.Thiết kế cấu trúc biểu gRNA chỉnh sửa gen RAM2-TBR 29 4.4 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa gen RAM2-TBR 33 4.5 Biến nạp vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 vào A tumerfaciens LBA4404 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 iv DANH MỤC VIẾT TẮT A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Bp base pair (cặp bazơ nitơ) CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (nhóm đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên) Cas CRISPR associated protein (protein liên kết CRISPR) crRNA CRISPR RNA CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DBS Double–stranded break (đứt gãy sợi đôi) dNTP Deoxynucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EtBr Ethidium bromide HR Homologous recombination (tái tổ hợp tương đồng) Kb Kilobase Ram2 OsNramp2 Ram2-TBR OsNramp2-TBR225 Fe Sắt Zn Kẽm Mn Mangan NHEJ Non–homologous end–joining (ghép nối điểm cuối không tương đồng) NST Nhiễm sắc thể Nu Nucleotit PAM Protospacer adjacent motif (motif liền kề protospacer) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) RNAi RNA interference (can thiệp RNA) v sgRNA single guide RNA (RNA dẫn đường) TAL Transcription activator–like (tương tự yếu tố hoạt hóa phiên mã) TALEN TAL effector nuclease (nuclease tác động tương tự yếu tố hoạt hóa phiên mã) T–DNA Transfer–DNA (DNA chuyển) Ti–plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) tracrRNA trans–encoded CRISPR RNA ZFN Zinc finger nuclease (nuclease ngón tay kẽm) HDR homologous directed recombination (sửa chữa theo hướng tương đồng) SDN Site-directed nucleases (Nuclease đặc hiệu) ZFP protein zinc-finger PEG polyethylene glycol NLS nuclear localization signal (tín hiệu định vị hạt nhân) TAE Tris acetate (đệm điện di) vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số hệ vector CRISPR/Cas9 dùng cho chuyển gen thực vật (Ma et al, 2016) 13 Bảng 1: Trình tự oligonucleotide sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 4.1: Đặc điểm crRNA chỉnh sửa Ram2-TBR 26 Bảng 2: Trình tự DNA tương đồng với crRNA chỉnh sửa Ram2-TBR hệ gen lúa 28 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cơ chế cắt DNA phức hệ protein CRISPR/Cas9 (Ma et al, 2016) 10 Hình 1: Sơ đồ thiết kế vector pENTR- gRNA 21 Hình 2: Sơ đồ thiết kế vector pCas9/gRNA- Ram2 chỉnh sửa gen OsNramp2 22 Hình PCR phân lập Ram2-TBR 23 Hình 2: Trình tự promoter Ram2–TBR (5’ – 3’) 24 Hình So sánh trình tự DNA Ram2-TBR với giống lúa 25 Hình 4: Phản ứng cắt vector pENTR4 BsaI 30 Hình 5: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pENTR4/gRNA-Ram2 31 Hình 6: PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pENTR4/gRNARam2 32 Hình 7: Cắt giới hạn vector pENTR4/gRNARam2 33 Hình 8: Sơ đồ vector pENTR4/gRNA-Ram2 vị trí liên quan 33 Hình 9: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp vector pCas9/gRNARam2 Error! Bookmark not defined Hình 10: PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2Error! Bookmark not de Hình 11: Cắt giới hạn vector pcas9/gRNA-Ram2Error! Bookmark not defined Hình 12: Hình 4.10: Trình tự đoạn cấu trúc pENTR4/gRNA-Ram2 vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 (5’ – 3’)Error! Bookmark not defined Hình 13: Trình tự gRNA vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2Error! Bookmark n Hình 14: Tóm tắt sơ đồ thiết kế vector pCas9/gRNA-Ram2 chỉnh sửa vi chất Fe Error! Bookmark not defined Hình 15: Sơ đồ vector pCas9/gRNA-Ram2 vị trí liên quanError! Bookmark not Hình 16: PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp vector pCas9/gRNA-Ram2 40 viii 5' AAAC[CTTGGCTTTGTTTCACCAAAC] 3' đặt tên BsaI-gRNARam2-Fw BsaI-gRNA-Ram2-Rv (phần chữ ngoặc [] thể trình tự crRNA, chữ bên ngồi [] thể trình tự BsaI) Hai oligonucleotide sau ghép nối với tiếp tục ghép nối vào vector pENTR4/gRNA cắt giới hạn tinh Sản phẩm ghép nối gRNA đem biến nạp vào vi khuẩn E.coli nuôi cấy môi trường có bổ sung kháng sinh kanamycin Sau có khuẩn lạc biến nạp, tiến hành PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI Fw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv Kết điện di sản phẩm gel agarose 1% cho thấy phản ứng sử dụng khuôn khuẩn lạc xuất băng DNA có kích thước xấp xỉ 450 bp (Hình 5, giếng 2-5) tương ứng với kích thước tính tốn lý thuyết đoạn DNA từ vị trí BtgZI đến BsaI gắn gRNA Ngược lại, sản phẩm phản ứng đối chứng âm (với khuôn khuẩn lạc không biến nạp DNA) không thu băng DNA (Hình 4.4, giếng 1) Kết cho phép bước đầu kết luận thu nhận khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn pENTR4/gRNA-Ram2 Hình 5: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pENTR4/gRNA-Ram2 Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI-Fw/BsaIgRNA-Ram2-Rv điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 1: đối chứng âm (khuẩn lạc không biến nạp DNA); giếng 2-5: bốn mẫu khuẩn lạc biến nạp pENTR4/gRNA-Ram2 Khuẩn lạc trắng số hình 4.4 lựa chọn ni cấy có kết PCR dương tính (vạch sáng rõ) sau ni cấy, tách chiết DNA plasmid 31 kiểm tra phương pháp PCR (Hình 6) Kết điện di gel agarose 1% cho thấy sản phẩm PCR từ khuôn plasmid với cặp mồi BsaI-gRNA-Ram2Fw/gRNA2-Rv gRNA1-Fw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv (đặc hiệu cho vector pENTR4-gRNA-Ram2) cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,19 kb (giếng 1) (đoạn trình tự từ vị trí mồi gRNA1-Fw đến vị trí BsaI có gắn gRNA, phụ lục 1) 0,78 kb ( giếng 4) (đoạn trình tự từ vị trí BsaI có gắn gRNA đến vị trí mồi gRNA-Rv, phụ lục 1), phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn DNA cần nhân Hình 6: PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pENTR4/gRNARam2 Ghi chú: Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pENTR4/gRNA-Ram2 điện di gel agarose 1% Giếng M: Marker 1Kb; giếng 1-2: mồi BsaIgRNA-Ram2-Fw/gRNA2-Rv; giếng 3-4: mồi gRNA1-Fw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv; giếng 2, 3: đối chứng âm: khuôn H2O; giếng 1, 4: khuôn vector pENTR/gRNA-Ram2 Tương tự, kết điện di sản phẩm cắt giới hạn plasmid pENTR4/gRNARam2 HindIII (có vị trí cắt vector pENTR4/gRNA-Ram2, Phụ lục 1) cho băng DNA có kích thước khoảng 2,3 kb 0,9 kb xấp xỉ kích thước lí thuyết (Hình 7, giếng 2) 32 Hình 7: Cắt giới hạn vector pENTR4/gRNARam2 Ghi chú: Sản phẩm cắt giới hạn điện di gel agarose 1% Giếng 1: vector pENTR4 nguyên bản; giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn vector pENTR4/gRNARam2 HindIII; giếng M: thang chuẩn DNA kb Như vậy, kết thu cho phép khẳng định chắn việc ghép nối thành công đoạn trình tự gRNA-Ram2 vào vector pENTR4/gRNA Hình 8: Sơ đồ vector pENTR4/gRNA-Ram2 vị trí liên quan 33 4.4 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc chỉnh sửa gen RAM2-TBR Hệ thống CRIPSR/Cas phát lần vi khuẩn vi khuẩn cổ với khả làm suy giảm chất ngoại sinh Hệ thống sau phát triển để trở thành công cụ chỉnh sửa hệ gen ứng dụng rộng rãi nhiều đối tượng sinh vật với mục đích khác nhau, ví dụ tạo đột biến gen, điều hòa phiên mã, chèn gen ngoại lai, bất hoạt (knock–out) gen…(Sun et al., 2016) Tuy nhiên, nghiên cứu chỉnh sửa gen thực vật sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 khiêm tốn so với nghiên cứu tương tự đối tượng động vật, vi khuẩn Năm 2013, ba nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời công bố kết nghiên cứu sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen thực vật (Liu et al., 2017), (Nekrasov et al.,2013) (Bortesi and Fischer, 2015) Sau đó, hàng loạt nghiên cứu chứng minh hiệu tiềm công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen mơ hình ngũ cốc Trong nghiên cứu này, với mục tiêu chỉnh sửa gen Ram2-TBR hệ thống CRISPR/Cas9 Hai vector pENTR4/gRNA-Ram2 pCas9 sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng Gateway (mục 3.2.11) Hỗn hợp phản ứng Gateway sau biến nạp vào tế bào E coli DH5α Các thể biến nạp xuất mơi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh spectinomycin Các khuẩn lạc sàng lọc PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI-Fw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv Ubi-Fw/Cas9-t-Rv Kết thu cho thấy số sản phẩm PCR từ khuẩn lạc cặp mồi BtgZI-Fw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv điện di gel agarose 1% cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,45 kb (đoạn trình tự từ vị trí BtgZI đến vị trí BsaI có gắn gRNA) (Hình 8, giếng 2, ) tương ứng với kích thước theo lý thuyết bao gồm đoạn cấu trúc Tương tự, PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi Ubi-Fw/Cas9-t-Rv cho băng cho kích thước 0,36 kb (đoạn trình tự từ vị trí mồi Ubi-Fw đến mồi Cas9-tRv, Phụ lục 3) (Hình 4.8, giếng 5,6), đối chứng dương sử dụng vector 34 pENTR4/gRNA-Ram2 với kích thước tính tốn lí thuyết (Hình 4.8, giếng 4) Kết chứng tỏ thể biến nạp thu mang vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 Hình 9: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp vector pCas9/gRNA-Ram2 Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi BtgZIFw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv.và Ubi-Fw/Cas9-t-Rv điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 2, 3: PCR khuẩn lạc biến nạp vector pCas9/gRNA-Ram2 với cặp mồi Ubi-Fw/Cas9-t-Rv; giếng 4, 5: PCR khuẩn lạc biến nạp vector pCas9/gRNA-Ram2 với cặp mồi BtgZI-Fw/BsaIgRNA-Ram2-Rv; giếng 1,7: đối chứng âm (khuẩn lạc không biến nạp DNA); giếng 6: đối chứng dương cho cặp mồi BtgZI-Fw/BsaI-gRNA-Ram2Rv.(khuôn vector pENTR4/gRNA-Ram2) Sau có khuẩn lạc dương tính mang cấu trúc pCas9/gRNA-Ram2, ni tách plasmid kiểm tra có mặt đoạn DNA đích phương pháp PCR phương pháp xử lý với enzyme cắt giới hạn Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tinh cặp mồi BtgZI-Fw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv (đoạn trình tự từ vị trí BtgZI đến vị trí BsaI có gắn gRNA) (đặc hiệu cho cấu trúc chứa gRNA) cặp mồi UbiFw/Cas9tRv (từ vị trí mồi Ubi-Fw đến vị trí mồi Cas9-t-Rv) (đặc hiệu cho vector pCas9) điện di gel agarose 1% cho băng DNA có kích thước khoảng 0,45 (Hình A, giếng 2) 0,36 kb (Hình B, giếng 2) Kích 35 thước băng DNA thu hồn tồn phù hợp với kích thước theo tính tốn lý thuyết đoạn DNA cần nhân Hình 10: PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 Ghi chú: Sản phẩm PCR plasmid pCas9/gRNA-Ram2 với cặp mồi BtgZI-Fw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv (A) Ubi-Fw/Cas9-t-Rv (B) điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 1: đối chứng âm: khuôn H2O; giếng 2: plasmid pCas9-gRNA-Ram2; giếng 3: đối chứng dương khuẩn lạc pCas9-gRNA-Ram2 Mặt khác, xử lý plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn HindIII, kết điện di cho thấy vector pCas9/gRNA-Ram2 cắt enzyme HindIII tạo băng DNA có kích thước xấp xỉ 0,94 kb 15,8 kb (Hình 10, giếng 4) tương ứng với kích thước cấu trúc chứa gRNA khung vector pCas9, ngược lại vector pCas9 nguyên không chứa cấu trúc biểu gRNA-Ram2 lại tạo băng DNA có kích thước xấp xỉ 1,7 kb 15,8 kb (Hình 4.10, giếng 2) tương ứng vói đoạn khung vector pCas9 Các kết chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 thu có mang đồng thời cấu trúc biểu gen Cas9 (điều khiển promoter Ubiquitin) cấu trúc biểu gRNA-Ram2 (được điều khiển promoter U6.1 U6.2) 36 Hình 11: Cắt giới hạn vector pCas9/gRNA-Ram2 Ghi chú: Cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn; ; Giếng 1: vector pCas9 nguyên bản; giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn vector pCas9 HindIII giếng 3: vector pCas9/gRNA-Ram2 nguyên bản; giếng 4: sản phẩm cắt giới hạn pCas9/gRNA-Ram2 HindIII Giếng M: thang chuẩn DNA kb Để khẳng định xác đoạn DNA ghép nối vào vector pCas9 cấu trúc gRNA-Ram2 không xảy đột biến trình ghép nối, vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 giải trình tự phân tích kết phần mềm BioEdit (Hình 4.10, hình 4.11) Kết phân tích trình tự nucleotide cho thấy đoạn DNA ghép nối vào pCas9 có kích thước 0,94kb (từ vị trí attL1 đến attL2) Các kết thu cho phép khẳng định chắn cấu trúc biểu gRNA-Ram2 chèn thành công vào vector pCas9 37 ACATATACAAACCGGTTTTATTCATGAATGGTCACGATGGATGATGGGGCT CAGACTTGAGCTACGAGGCCGCAGGCGAGAGAAGCCTAGTGTGCTCTCT GCTTGTTTGGGCCGTAACGGAGGATACGGCCGACGAGCGTGTACTACCG CGCGGGATGCCGCTGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTG GGTCGCGGGAGCGTTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACC GAACAATGAAGAACCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTGT TTGGTGAAACAAAGCCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT TGAGATTTCCAACCAGGTCCCTGGAGCCCATAGTCTAGTAACGGCCGCCA GTGTGCTGGAATTGCCCTTGGATCATGAACCAACGGCCTGGCTGTATTTG GTGGTTGTGTAGGGAGATGGGGAGAAGAAAAGCCCGATTCTCTTCGCTGT GATGGGCTGGATGCATGCGGGGGAGCGGGAGGCCCAAGTACGTGCACG GTGAGCGGCCCACAGGGCGAGTGTGAGCGCGAGAGGCGGGAGGAACAG TTTAGTACCACATTGCCCAGCTAACTCGAACGCGACCAACTTATAAACCCG CGCGCTGTCGCTTGTGTGTATGGATCTGAACAAGCTGAGTTTTAGAGCTA GAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGC ACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGTCCCTTCGAAGGGCAATTCTGCAGATATCC ATCACACTGGCGGCCGCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCG AATTCGCGGCCGCACTCGAGATATCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTT GGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACT ATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGCAGCTCTGGCCCGT GTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGA ACAATAAGACTGTCTGCT Hình 12: Một phần trình tự cấu trúc gRNA/Ram2 vector tái tổ hợp (5' - 3') Hình 13: Trình tự gRNA vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 38 Ghi chú: Một phần kết giải trình tự pCas9/gRNA-Ram2 Đoạn trình tự crRNA-1 bơi đen, phần trình tự promoter U6.2 thể mũi tên màu xanh da trời (→) phần trình tự tracrRNA thể mũi tên màu cam (→) Hình 14: Tóm tắt sơ đồ thiết kế vector pCas9/gRNA-Ram2 chỉnh sửa vi chất Fe Hình 15: Sơ đồ vector pCas9/gRNA-Ram2 vị trí liên quan 39 4.5 Biến nạp vector tái tổ hợp pCas9/gRNA-Ram2 vào A tumerfaciens LBA4404 Để tạo vật liệu phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen vào lúa, vector pCas9/gRNA-Ram2 biến nạp vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens LBA4404 phương pháp xung điện Bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc sử dụng cặp mồi BtgZI-Fw/BsaI-gRNA-Ram2-Rv, số dòng tế bào vi khuẩn A tumefaciens có mang Ti–plasmid chứa cấu trúc chèn crRNA-1 xác định Cụ thể, sản phẩm PCR với khuôn khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp pCas9/gRNA-Ram2 cho băng DNA có kích thước khoảng 0,45 kb điện di (nhân đoạn trình tự từ vị trí BtgZI đến vị trí BsaI có gắn gRNA) (đặc hiệu cho cấu trúc chứa gRNA) (hình 4.11, giếng 2, 3), với kích thước theo tính tốn lý thuyết, tương tự sản phẩm PCR đối chứng dương sử dụng khn vector pCas9/gRNA-Ram2 (Hình 4.11, giếng 4) Ngược lại, sản phẩm PCR từ vi khuẩn A tumefaciens không biến nạp vector pCas9/gRNA-Ram2 không thu DNA (Hình 4.11, giếng 1) Dựa kết này, kết luận vector pCas9/gRNA-Ram2 biến nạp thành công vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens Các thể biến nạp có kết PCR dương tính bảo quản để sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen vào giống lúa TBR225 sau Hình 16: PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp vector pCas9/gRNA-Ram2 40 Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI-Fw/BsaIgRNA-Ram2-Rv điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 2, 3: PCR khuẩn lạc với cặp mồi BtgZI-Fw/BsaI-gRNA-Ram2Rv,giếng 1: đố chứng âm (khuẩn lạc không biến nạp DNA); giếng 4: đối chứng dương (khuôn vector pCas9/gRNA-Ram2) 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết đưa kết luận sau: Đã phân lập giải trình tự đầy đủ đoạn gen mục tiêu OsNramp2 liên quan đến đến trình vận chuyển vi chất dinh dưỡng giống lúa TBR225 Vùng trình tự phân lập dài 0,68 kb, có độ tương đồng 100% so với giống Shuhui 498 (Indica, mã số CP018159.1) 99% Nipponbare (Japonica, mã số AP014959.1) công bố GenBank Đã thiết kế crRNA1 (21 Nu) phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa gen OsNramp2 giống lúa TBR225 công nghệ CRISPR/Cas9 Thiết kế cấu trúc biểu gRNA chỉnh sửa gen mục tiêu liên quan đến trình vận chuyển vi chất dinh dưỡng giống lúa TBR225 Vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc pCas9/gRNA-Ram2 biểu phức hệ gRNA chỉnh sửa vị trí crRNA-1 thiết kế thành công Vector tái tổ hợp kiểm tra PCR đoạn từ vị trí BtgZI đến vị trí BsaI có gắn gRNA, cắt enzyme giới hạn HindIII giải trình tự Nu Đã tạo chủng vi khuẩn A tumerfaciens LBA4404 tái tổ hợp mang cấu trúc biểu phức hệ CRISPR chỉnh sửa gen OsNramp2 giống lúa TBR225 42 5.2 Kiến nghị Trên sở kết luận thu được, đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen Ram2-TBR vào giống lúa TBR225 Từ xác định có mặt cấu trúc biểu phức hệ chỉnh sửa gen Ram2-TBR PCR Các dòng lúa chuyển gen tiếp túc phân tích sâu đặc điểm kiểu gen kiểu hình để chứng minh khả hoạt động cấu trúc thiết kế 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng anh [1] Calayugan Mark Ian C., Formantes Andrea Kariza, Amparado Amery, Descalsota-Empleo Gwen Iris, Nha Chau Thanh, Inabangan-Asilo Mary Ann, Swe Zin Mar, Hernandez Jose E., Borromeo Teresita H., Lalusin Antonio G., Mendioro Merlyn S., Diaz Ma Genaleen Q, Viña Celia B dela, Reinke Russell & Swamy B P Mallikarjuna (2020) Genetic Analysis of Agronomic Traits and Grain Iron and Zinc Concentrations in a Doubled Haploid Population of Rice (Oryza sativa L.), Sci Rep, 10: 2283 [2] Bashir Khurram, Takahashi Ryuichi, Nakanishi Hiromi, and Nishizawa Naoko K (2013) The road to micronutrient biofortification of rice: progress and prospects, Front Plant Sci, 4: 15 [3] Tian Weijun, He Guandi, Qin Lijun, Li Dandan, Meng Lulu, Huang Yun, He Tengbing (2021) Genome-wide analysis of the NRAMP gene family in potato (Solanum tuberosum): Identification, expression analysis and response to five heavy metals stress, Ecotoxicology and Environmental Safety, 8: 111661 [4] Herlihy John H, Long Terri A, McDowell John M (2020) Iron homeostasis and plant immune responses: Recent insights and translational implications, The Journal of biological chemistry, 295(39): 13444-13457 [5] Ullah Ihsan , Wang Yirong , Eide David J & Dunwell Jim M (2018) Evolution, and functional analysis of Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins (NRAMPs) from Theobroma cacao and their role in cadmium accumulation, Scientific Reports,8: 14412 [6] Takahashi Ryuichi, Ishimaru Yasuhiro, Senoura Takeshi, Shimo Hugo, Ishikawa Satoru, Arao Tomohito, Nakanishi Hiromi and Nishizawa Naoko K (2011) Journal of experimental botany, 62(14): 4843–4850 [7] Kumari Kumkum, Kumar Pankaj, Sharma Vinay K, Singh Santosh K (2019) Genomic marker assisted identification of genetic loci and genes associated with variation of grain zinc concentration in rice, J Genet, 98: 111 [8] Yun Li, Jingjun Li, Yihong Yu, Xia Dai, Changyi Gong, Dongfang Gu, Ending Xu, Yiheng Liu, Yu Zou, Peijiang Zhang, Xi Chen, Wei Zhang (2021) The tonoplast-localized transporter OsNRAMP2 is involved in iron homeostasis and affects seed germination in rice, Journal of Experimental Botany, 72(13): 4839–4852 [9] Shan Qiwei, Wang Yanpeng, Li Jun, Zhang Yi, Chen Kunling, Liang Zhen, Zhang Kang, Liu Jinxing, Xi Jianzhong Jeff, Qiu Jin-Long & Gao Caixia (2013), “Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR–Cas system”, Nature Biotechnology, 31, pp 686–688 [10] Liu X., Wu S., Xu J., Sui C., Wei J., (2017), “Application of CRISPR/Cas9 in plant biology”, Acta Pharmaceutica Sinica B, 7(3), pp 292–302 [11] Arora L., Narula A (2017), “Gene editing and crop improvement using CRISPR–Cas9 system”, Frontiers in Plant Science, 8, pp 1932 [12] Jun Li, Yan Li, and Ligeng Ma, (2019) CRISPR/Cas9-Based Genome Editing and its Applications for Functional Genomic Analyses in Plants, Small Methods, 1800473 [13] Ma Xingliang, Zhu Qinlong, Chen Yuanling, Liu Yao-Guang (2016), “CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: Developments and applications”, Molecular Plant, 9(7), pp 961–974 [14] Rousseau Christine, Gonnet Mathieu, Romancer Marc Le, Nicolas Jacques (2009), “CRISPI: a CRISPR interactive database”, Bioinformatics, 25, pp 3317–3318 [15] Li Jian-Feng, Norville Julie E, Aach John, McCormack Matthew, Zhang Dandan, Bush Jenifer, Church George M & Sheen Jen (2013), “Multiplex and homologous 44 recombination–mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9”, Nature Biotechnology, 31, pp 688–691 [16] Nekrasov Vladimir, Staskawicz Brian, Weigel Detlef, Jones Jonathan D G & Kamoun Sophien (2013), “Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA–guided endonuclease”, Nature Biotechnology, 31(8), pp 691–693 [17] Bortesi Luisa, Fischer Rainer (2015), “The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond”, Biotechnology Advances, 33(1), pp 41–52 [18] Liang G., Zhang H., Lou D., Yu D (2016), “Selection of highly efficient sgRNAs for CRISPR/Cas9–based plant genome editing”, Scientific Reports, 6, pp 21451 [19] Ma X., Zhang Q., Zhu Q., Liu W., Chen Y., Qiu R., Wang B., Yang Z., Li H., Lin Y., Xie Y., Shen R., Chen S., Wang Z., Chen Y., Guo J., Chen L., Zhao X., Dong Z., Liu Y G (2015), “A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants”, Molecular Plant, 8(8), pp 1274–1284 [20] Shen Bin, Zhang Wensheng, Zhang Jun, Zhou Jiankui, Wang Jianying, Chen Li, Wang Lu, Hodgkins Alex, Iyer Vivek, Huang Xingxu & Skarnes William C (2014), “Efficient genome modification by CRISPR–Cas9 nickase with minimal off–target effects”, Nature Methods, 11(4), pp 399–402 [21] Doench John G, Fusi Nicolo, Sullender Meagan, Hegde Mudra, Vaimberg Emma W, Donovan Katherine F, Smith Ian, Tothova Zuzana, Wilen Craig, Orchard Robert, Virgin Herbert W, Listgarten Jennifer & Root David E (2016) Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9 Nat Biotechnol, 34: 184–191 [22] Fu Yanfang, Sander Jeffry D, Reyon Deepak, Cascio incent M & Joung J Keith (2014) Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs Nat Biotechnol 32, 279–284 [23] Smith L M., Sanders J Z., Kaiser R J., Hughes P., Dodd C., Connell C R., Heiner C., Kent S B., Hood L E (1986), “Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis”, Nature, 321(6071), pp 674–679 Trang web IRRI, Biofortification [Online] Available from, https://www.irri.org/biofortification (2021) Rice Knowledge Bank, IRRI Rice Quality Assessment Kit [Online] Available from, http://www.knowledgebank.irri.org/step-by-step-production/postharvest/milling/irri-ricequality-assessment-kit (2021) https://benchling.com/ http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/ https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi https://www.irri.org/ 45