Khóa luận tốt nghiệp tìm hiểu mức độ biểu hiện của các cặp gene lặp mã hóa nhân tố phiên mã nac đáp ứng với bất lợi ở cây lạc (arachis hypogaea)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC CẶP GENE LẶP MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI BẤT LỢI Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea) Hà Nội, năm 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC CẶP GENE LẶP MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI BẤT LỢI Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea) Người thực : Hoàng Phương Loan Khóa : 62 Ngành : Cơng nghệ Sinh học Người hướng dẫn: TS Bùi Thị Thu Hương TS Chu Đức Hà Hà Nội, năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan trực tiếp thực nghiên cứu khóa luận Mọi kết thu nguyên bản, không chỉnh sửa chép từ nghiên cứu khác Các số liệu, kết khóa luận chưa cơng bố Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Hồng Phương Loan i LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khóa luận tốt nghiệp, ngồi cố gắng thân nhận nhiều giúp đỡ hỗ trợ, xin tỏ lịng biết ơn vơ sâu sắc tới TS Bùi Thị Thu Hương - Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam thầy TS Chu Đức Hà - Khoa Công nghệ Nông nghiệp, Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội hướng dẫn tận tình, chu đáo bên cạnh kiến thức xã hội bổ ích khác Bên cạnh đó, tơi xin chân cảm ơn giúp đỡ quý báu, nhiệt tình tập thể cán thuộc môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp, nơi tiến hành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin cảm ơn giúp đỡ thầy cô Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Hoàng Phương Loan ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i  LỜI CẢM ƠN ii  MỤC LỤC iii  DANH MỤC VIẾT TẮT v  DANH MỤC BẢNG vii  DANH MỤC HÌNH viii  TÓM TẮT ix  PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1  1.1 Tính cấp thiết đề tài 1  1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 2  1.2.1 Mục đích 2  1.2.2 Yêu cầu 2  PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3  2.1 Nguồn gốc xuất xứ lạc 3  2.2 Đặc điểm sinh học lạc 4  a) Đặc điểm di truyền 4  b) Đặc điểm hình thái lạc 4  2.3 Vai trò lạc 5  2.4 Ảnh hưởng biến đổi khí hậu đến sinh trưởng phát triển lạc 7  2.5 Tình hình sản xuất lạc giới Việt Nam 9  a) Tình hình sản xuất lạc giới 9  b) Tình hình sản xuất lạc Việt Nam 10  2.6 NAC vai trò NAC liên quan đến tính chống chịu thực vật 11  2.7 Tình hình nghiên cứu giới nước 13  2.7.1.Tình hình nghiên cứu giới 13  iii 2.7.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15  PHẦN III: PHẠM VI, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16  3.1 Phạm vi nghiên cứu 16  3.2 Nội dung nghiên cứu 16  3.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 16  3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 16  3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 17  PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22  4.1 Phân tích tượng lặp gene xảy họ gene mã hóa TF NAC lạc 22  4.2 Kết phân tích vai trị trình chọn lọc tự nhiên đến chế hình thành họ gene AhNAC lạc 24  4.3 Phân tích mối tương quan TF NAC lạc NAC đáp ứng hạn đậu gà 25  4.4 Phân tích yếu tố điều hòa cis- vùng promoter gene AhNAC lạc 27  4.5 Khai thác mức độ biểu họ gene AhNAC có tiềm đáp ứng hạn 29  PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32  5.1 Kết luận 32  5.2 Đề nghị 32  DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN KHÓA LUẬN33  TÀI LIỆU THAM KHẢO 34  Tài liệu tiếng việt 34  Tài liệu tiếng anh 35  iv DANH MỤC VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt ABA ATAF Giải thích Tiếng Giải thích Tiếng Anh Abscisic acid Việt Axít abscisic Arabidopsis Transcription Activation factor Nhân tố hoạt hóa phiên mã Arabidopsis CDS Coding DNA sequence Trình tự ADN mã hóa CUC Cup-shaped cotyledon - DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic Ngân hàng liệu FAOSTAT Food and Agriculture trực tuyến Tổ Organization Corporate chức Lương thực Statistical Database Nông nghiệp Liên Hợp Quốc Gene Expression Omnibus GEO NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia biểu gene gDNA Genomic DNA Gen di truyền ADN GSO General Statistical Office Tổng cục Thống kê 10 JA Jasmonic acid Axít Jasmonic 11 MeJA Methyl Jasmonate Metyl este axit Jasmonic 12 MEGA Molecular Evolutionary Phân tích di truyền v 13 14 15 NAM NCBI NOAA Genetics Analysis tiến hóa phân tử No apical meristem - National Center for Biotechnology Information National Oceanic and Atmospheric Administration Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Cơ quan Quản lý khí Đại dương Quốc gia Mỹ 16 NST Chromosome Nhiễm sắc thể 17 RNA Ribonucleic acid Axit ribônucleic 18 RNA-Seq Ribonucleic acid Sequencing 19 RT-PCR Reverse transcription Polymerase chain reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase chép ngược 20 SA Salicylic acid Axít salicylic 21 SNAC Stress-reponsive NAC NAC đáp ứng bất lợi 22 TF Transcriptionfactor Nhân tố phiên mã vi Giải trình tự ribơnucleic DANH MỤC BẢNG Bảng Tình hình sản xuất lạc số quốc gia 9  Bảng Các kiện lặp xảy họ gene AhNAC lạc 25  vii DANH MỤC HÌNH Hình Đặc điểm hình thái lạc 5  Hình 2.Vai trị lạc 6  Hình Hạn hán ảnh hưởng nghiêm trọng đến trồng lạc Hoa Kỳ 7  Hình Tình hình sản xuất lạc Việt Nam 10  Hình Các yếu tố phiên mã NAC liên quan đến phản ứng số thực vật hạn hán độ mặn 12 Hình Phương pháp thu thập thông tin họ AhNAC 17  Hình Phương pháp dự đoán tượng lặp gene xảy họ gene AhNAC 18  Hình 3 Phương pháp tính tốn giá trị thay đồng nghĩa giá trị thay trái nghĩa gene AhNAC lặp lạc 18  Hình Phương pháp xây dựng sơ đồ hình 19  Hình Phương pháp tìm kiếm yếu tố điều hòa cis- đáp ứng bất lợi vùng promoter gene AhNAC lạc 20  Hình Phương pháp khai thác liệu biểu họ gene AhNAC điều kiện bất lợi phi sinh học lạc 21 Hình Mức độ tương đồng họ gene AhNAC lạc 22  Hình Các hệ gene lặp xảy NAC lạc 23  Hình Sơ đồ hình họ TF NAC 23 CaNAC đáp ứng hạn C.arietinum 26  Hình 4 Sự phân bố của yếu tố điều hòa cis- vùng promoter gene AhNAC lạc 28  Hình Dữ liệu biểu 12 gene AhNAC điều kiện xử lý PEG 600 lạc 30  viii Bảng Các kiện lặp xảy họ gene AhNAC lạc STT Cặp gene lặp Ka Ks Ka/Ks AhNAC21/25 0,4780 0,4494 1,06 AhNAC14/03 0,3117 0,3321 0,94 AhNAC02/20 0,3140 0,3984 0,79 AhNAC17/23 0,3097 0,4236 0,73 AhNAC01/10 0,4373 0,4955 0,88 AhNAC06/19 0,3035 0,2708 1,12 AhNAC13/04 0,2935 0,3435 0,85 Ghi : Giá trị thay trái nghĩa-Non-synonymous substitutions per nonsynonymous site (Ka) ; Giá trị thay đồng nghĩa-Synonymous substitutions per synonymous site (Ks) Mối quan hệ tiến hóa lúa họ Cleistogenes songorica NAC thực một phân tích tổng hợp so sánh tìm thấy 68 OsNAC 93 CsNAC Kết NAC tiến hóa từ tổ tiên chung lúa C songorica Giá trị Ks đạt cực đại 0,6-1,8 Cleistogenes songorica lúa Tỷ lệ Ka/Ks chủ yếu phân phối mức 0-0,36, với giá trị lớn quan sát cặp CsNAC059- LOC_Os03g59730.1 (Ka/Ks=0,62), chúng trải qua trình chọn lọc khiết q trình tiến hóa sinh học hai lồi (Xifang, 2020) 4.3 Phân tích mối tương quan AhNAC lạc CaNAC đáp ứng hạn đậu gà Vì quan tâm đến việc xác định gene AhNAC đáp ứng căng thẳng phi sinh học, đặc biệt liên quan đến hạn hán thông qua phân tích phát sinh lồi, CaNAC biết đến với đáp ứng hạn chọn phân tích Trình tự protein 29 AhNAC (Ha et al., 2021) trình tự protein 23 CaNAC biết chức (Ha et al., 2017) phân tích thuật toán 25 Neighbor-Joining (giá trị bootstrap = 1000) MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016) Dựa theo giá trị cut-off 50%, tổng số 12 AhNAC xác định nằm nhánh với CaNAC đáp ứng với hạn (Hình 4.3) Cụ thể, giá trị bootstrap nhánh AhNAC CaNAC dao động từ 59 (CaNAC57 AhNAC10) đến 100 (CaNAC33 AhNAC26, CaNAC41/71 AhNAC09/28, CaNAC06/67 AhNAC17/23, CaNAC24 AhNAC05) (Hình 4.3) Giá trị bootstrap nhánh CaNAC05 AhNAC11, CaNAC02 AhNAC24 99 CaNAC21 AhNAC18 có giá trị bootstrap 98, CaNAC40 AhNAC21 92, CaNAC31 AhNAC12 89 Hình Sơ đồ hình họ TF NAC 23 CaNAC đáp ứng hạn C.arietinum 26 Vào năm 2014, trình tự protein 71 gene CaNAC đậu gà NAC phản ứng với căng ANAC019,029,055,072 thẳng từ 081) lúa Arabidopsis (ANAC002, (SNAC01/ONAC002 OsNAC06/SNAC2/ONAC048) sử dụng để xây dựng sơ đồ hình phân tích phát sinh lồi Có 15 CaNAC phân loại liên quan đến đáp ứng căng thẳng bao gồm CaNAC02, 05, 06, 16, 21, 24, 27, 39, 40, 43, 46, 47, 50, 52 67 (Ha et al., 2014) 4.4 Phân tích yếu tố điều hịa cis- vùng promoter gene AhNAC lạc Để tìm hiểu chức 12 gene AhNAC, yếu tố điều hịa cisđáp ứng hạn tín hiệu hormone xác định đoạn trình tự 1000bp thuộc vùng promoter Trong có yếu tố đáp ứng ABA, yếu tố đáp ứng JA, yếu tố đáp ứng gibberellin, yếu tố đáp ứng auxin yếu tố đáp ứng ethylene phân tích Tổng số đáp ứng ABA 12 yếu tố nhiều gene AhNAC 17,21,23 gene đáp ứng yếu tố, gene AhNAC12,28 đáp ứng yếu tố khơng có yếu tố đáp ứng ABA gồm có gene AhNAC05,09,10,18,26 Tổng số yếu tố đáp ứng JA 19 yếu tố Gene có yếu tố đáp ứng JA cao gene AhNAC12 với số đáp ứng yếu tố, số yếu tố đáp ứng JA gồm AhNAC05,09,17,21,23 tương ứng với số yếu tố đáp ứng yếu tố Các gene AhNAC10,18,26 khơng có yếu tố đáp ứng JA Các yếu tố đáp ứng gibberellin gồm yếu tố thuộc gene AhNAC10 yếu tố gene AhNAC18 yếu tố Đáp ứng auxin có yếu tố gene AhNAC12,26 gene yếu tố AhNAC10 có yếu tố Trong tổng số 13 yếu tố đáp ứng ethylene gene AhNAC26 chiếm nhiều yếu tố, yếu tố đáp ứng chiếm phần lớn gồm gene AhNAC05,10,11,12,18,21,23,24, gene khơng có yếu tố gene AhNAC09,17 Đáng ý, yếu tố đáp ứng ABA tìm thấy vùng promoter đa số gene AhNAC, tỷ lệ trung bình đạt xấp xỉ 1,67 27 yếu tố/gene Về mặt lý thuyết, ABA hormone chứng minh đóng vai trị chủ đạo chế chống chịu thích nghi với điều kiện hạn trồng (Le et al., 2011; Li et el., 2004) Các yếu tố điều hòa cis- đáp ứng với hạn gồm sáu yếu tố, bao gồm yếu tố đáp ứng nước (DRE), vị trí nhận biết TF MYB (MYBRS), vị trí nhận biết TF MYC (MYCRS), coupling element (CE3), hộp T/G evening element (EE) Theo kết hình cho thấy hầu hết gene đáp ứng với hạn ngoại trừ gene AhNAC12 17 không đáp ứng yếu tố Trong gene AhNAC10 21 chứa nhiều yếu tố đáp ứng hạn nhất, gồm MYBRS, hộp T/G, yếu tố EE DRE, MYBRS, yếu tố CE3 Hình 4 Sự phân bố của yếu tố điều hòa cis- vùng promoter gene AhNAC lạc 28 Ở lúa, người ta tìm thấy 20 gene gây căng thẳng NAC, vùng khởi động có yếu tố điều hịa cis- xác định để phản ứng với axit abscisic (ABRE), nước (DRE) nhiệt độ thấp (LTR) Các yếu tố điều hịa cis- tìm thấy để phản ứng với lạnh: LTR C-repeat/DRE; nhiệt: HSE; hạn hán: MBS; anoxia: ARE; axit salicylic (SA): TCA- element; ABA: ABRE, CE đoạn IIb; axit methyl jasmonic (MeJA): đoạn CGTCA TGACG; gibberellin (GA): P box đoạn GARE TATC; ethylene (ETH): EIRE; auxin (AUX): TGA-box TGA-element Các gene SNAC1 OsNAC6 báo cáo để đáp ứng với hạn hán Mặt khác, gene SNAC2 phản ứng với nhiều yếu tố kích thích căng thẳng: lạnh, khô hạn, thiếu oxy ABA (Hugo et al., 2017) Ở dưa chuột (Xingwang et al., 2018), nhiều yếu tố điều hòa cis- phát vùng promoter gene CsvNAC bao gồm số liên quan đến đáp ứng hormone, chẳng hạn auxin, ethylene (Eth), gibberellin (GA), ABA salicylic acid (SA) Hầu hết gene CsvNAC dưa chuột chứa trình tự CGTCA bảo tồn, cho thấy khả tự điều chỉnh, trình tự biết đến bị ràng buộc NAC TFs Một số gene chứa số yếu tố đáp ứng căng thẳng phi sinh học Ví dụ, CsvNAC053, 085 088 có nhiều yếu tố EDR LRT, biết có liên quan đến căng thẳng hạn hán lạnh giá Trong sáu gene NAC (CsvNAC010, 041, 048, 053, 058 059), phân tích cis- element tiết lộ vị trí liên kết HD-Zip I trình khởi động chúng, quan trọng phát triển trichome 4.5 Khai thác mức độ biểu họ gene AhNAC có tiềm đáp ứng hạn Để nghiên cứu chức 12 gene mã hóa TF NAC liên quan đến tính chống chịu lạc, liệu RNA-Seq khai thác nhằm phân tích mức độ biểu gene điều kiện xử lý PEG 600 (Li et al., 2004) 29 Trong nghiên cứu này, mức độ biểu ≥ 1,5 (tăng cường biểu hiện) ≤ -1,5 (kìm hãm biểu hiện) xem có ý nghĩa Dựa vào kết thu hình 10 cho thấy có gene AhNAC đáp ứng điều kiện ≥ 1,5 AhNAC11,12,21,23,24,26 Trong AhNAC11 gene có mức độ biểu mạnh (41,73) Gene AhNAC10 xem kìm hãm biểu đáp ứng điều kiện ≤ -1,5 (-3,22) Các gene AhNAC12 AhNAC24 có mức độ biểu tăng, có giá trị biểu 4,42 4,46 Các gene AhNAC21,23,26 có mức độ biểu giảm nhẹ với giá trị biểu 1,75; 1,51 1,7 Các gene lại gồm AhNAC05,09,17,18 28 có mức độ biểu kiện khơng thay đổi Hình Dữ liệu biểu 12 gene AhNAC điều kiện xử lý PEG600 lạc Ở đậu gà (Ha et al., 2014) nghiên cứu sử dụng tiêu chí mức độ biểu biện ≥2 (tăng cường biểu hiện) mức độ biểu