Nghiên cứu tuyển chọn giống đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris) giàu hợp chất cordycepin

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN GIỐNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) GIÀU HỢP CHẤT CORDYCEPIN Hà Nội, tháng 02 năm 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN GIỐNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) GIÀU HỢP CHẤT CORDYCEPIN Sinh viên thực : Nguyễn Anh Tuấn Mã sinh viên : 645341 Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thanh Hảo Địa điểm thực Viện nghiên cứu Vi tảo Dược mỹ phẩm : Hà Nội, tháng 02 năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Anh Tuấn i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, ngồi nỗ lực cố gắng thân, nhận giúp đỡ, động viên tích cực từ cá nhân, tập thể Trong thời gian thực tập Viện nghiên cứu Vi tảo Dược mỹ phẩm – Học viên Nông nghiệp Việt Nam nhận quan tâm, bảo tận tình Thầy, cán viện thí nghiệm Cùng với cố gắng, nỗ lực thân học kinh nghiệm tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học tồn thể Thầy, Cô truyền đạt cho kiến thức chuyên ngành, kỹ làm việc phòng thí nghiệm học quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thanh Hảo tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Mặc dù cố gắng hồn thiện luận văn nhiệt tình, lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp q thầy bạn để tơi hồn thành khóa luận tốt Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Anh Tuấn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung nấm Cordyceps militaris 1.1.1 Phân loại nấm Cordyceps militaris 1.1.2 Đặc điểm sinh học Cordyceps militaris 1.1.3 Giá trị dược liệu Cordyceps militaris 1.2 Đặc điểm sinh sản nấm Cordyceps militaris 1.3 Chọn giống nấm phương pháp lai đơn bào tử 11 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chọn giống 11 1.3.1 Quy trình chọn giống nấm phương pháp lai bào tử đơn 13 1.4 KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO 14 1.4.1 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng/cơ chất 14 1.4.1.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 14 iii 1.4.1.2 Ảnh hưởng nguồn nito 15 1.4.1.3 Ảnh hưởng nguồn khoáng chất 16 1.4.2 Ảnh hưởng thành phần bổ sung 17 1.4.2.1 Ảnh hưởng axit béo dầu thực vật 17 1.4.2.2 Ảnh hưởng hormon sinh trưởng 18 1.5 Ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy 18 1.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 20 1.6 Tình hình nghiên cứu nấm Cordyceps militaris 21 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 21 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 23 PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Phạm vi nghiên cứu 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Phương pháp phân lập bào tử đơn bội 29 a Nghiên cứu thu bào tử đơn bội từ nấm đông trùng hạ thảo 29 b Nghiên cứu phân lập bào tử theo phương pháp Teik-khiang Goh 29 c Nghiên cứu phân lập bào tử theo phương pháp Zhang 29 2.4.2 Nghiên cứu nhân nhanh bào tử đơn bội 30 2.4.3 Nghiên cứu lai bào tử đơn dịng tạo dịng hữu tính cảm ứng hình thành stroma 30 2.4.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng hình thái tổ hợp lai thu được31 2.4.5 Xác định hàm lượng Cordycepin có tổ hợp lai nghiên cứu 31 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 32 PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nghiên cứu phân lập bào tử từ chủng nấm nghiên cứu 33 iv 3.2 Nghiên cứu khả lai bào tử đơn bội 37 3.3 Đánh giá đặc điểm hình thái, sinh trưởng khả tích lũy cordycepin tổ hợp lai 39 3.3.1 Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi tổ hợp lai môi trường rắn 39 3.3.2 Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi tổ hợp lai môi trường lỏng 40 3.3.3 Đánh giá đặc điểm hình thái thể tổ hợp lai 42 3.4 Xác định hàm lượng cordycepin tổ hợp lai thu 44 3.5 Đặc điểm tổ hợp lai tiềm tuyển chọn 45 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chất có hoạt tính sinh học nấm C militaris Bảng 2.1 Danh sách đơn vị cung cấp nguồn giống C militaris 27 Bảng 3.1 Hiệu phân lập bào tử phương pháp khác 33 Bảng 3.2 Ưu nhược điểm phương pháp phân lập bào tử 36 Bảng 3.3 Kết lai bào tử đơn bội môi trường PDA, gạo lứt, gạo lứt nhộng (-) tổ hợp lai khơng hình thành thể, (+) tổ hợp lai có hình thành thể 38 Bảng 3.4 Đường kính khuẩn lạc khối lượng sinh khối khô tổ hợp lai thu môi trường dịch thể 40 Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái thể tổ hợp lai 43 Bảng 3.6 Đặc điểm lựa chọn tổ hợp lai 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 C militaris thu nhận tự nhiên Hình 1.2 Mặt cắt dọc thể chứa bào tử nấm C militaris Hình 1.3 Các dạng bào tử nấm C militaris 10 Hình 2.1 Ảnh chủng giống bố mẹ 27 Hình 3.1 Biểu đồ phân lập bào tử nấm đông trùng hạ thảo phương pháp khác 35 Hình 3.2 Đặc điểm hệ sợi tổ hợp lai môi trường PDA 38 Hình 3.3 Đặc điểm hình thái tổ hợp lai môi trường gạo lứt nhộng vào thời kì bắt đầu nhú sợi 39 Hình 3.4 Biểu đồ đường kính khuẩn lạc khối lượng sinh khối khô tổ hợp lai thu môi trường dịch thể 41 Hình 3.5 Hệ sợi tổ hợp lai mơi trường ni cấy PDA 41 Hình 3.6 Hình ảnh tổ hợp lai phát triển đầy đủ 42 Hình 3.7 Hình ảnh thể tổ hợp lai 44 Hình 3.8 Hàm lượng cordycepin tổ hợp lai (mg/100g) 45 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CÁC KÝ HIỆU Mb mega base pair kb kilo base pair CHỮ VIẾT TẮT CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide EDTA Ethylene diamine tetraacetic ac NCBI National Center for Biotechnology MT Môi trường PDA Potato - D-Glucose – Agar PD Potato - D-Glucose WA Water – Agar SD/S Spore drop/shooting C militaris Cordyceps militaris Stroma Quả thể nấm Hình 3.4 Biểu đồ đường kính khuẩn lạc khối lượng sinh khối khô tổ hợp lai thu môi trường dịch thể A(TDT) B(TAN) C(DTA) Hình 3.5 Hệ sợi tổ hợp lai môi trường nuôi cấy PDA (A.TN x DT, B.TN x AN, C DT x AN) 41 3.3.3 Đánh giá đặc điểm hình thái thể của tổ hợp lai Sau lai thành công tổ hợp lai (TDT, DTA, TNA) từ giống bố mẹ Kết quan sát hình thái cho thấy tổ hợp lai thành cơng có đặc trưng riêng màu sắc hình dạng stroma Trong đó, đặc điểm hình thái tổ hợp lai (DTA, TDT) số lượng stroma gấp đôi so với tổ hợp khác Đối với tổ hợp (TDT) có số lượng stroma tương đối cao (72 stroma/50cm2) chiều dài stroma đạt 48±2cm thấp so với tổ hợp lai chủng bố mẹ A(TDT) C(TNA) (DTA) Hình 3.6 Hình ảnh tổ hợp lai phát triển đầy đủ Về đặc điểm màu sắc, tổ hợp lai (TDT, TNA) có màu cam đặc trưng nấm C militaris, tổ hợp có khả tích lũy hàm lượng cordycepin cao Tổ hợp lai (DTA) có thể màu cam trắng, đặc điểm không ưu việt mô tả nấm C militaris khác biệt so với hai chủng bố mẹ DT AN có màu cam tươi 42 Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái thể tổ hợp lai Tổ hợp lai Màu sắc, đặc điểm thể Chiều Chiều dài Độ dày Số lượng stroma stroma Stroma 48±2 5,9±0,4 2,8±0,16 72±00 69±1,5 11,9 ±0,8 3,1±0,11 85±00 63±4,2 1,04±0,2 3,2±0,19 16,7±1,15 dài thể Màu cam đậm, đầu trịn phình TDT đỉnh, thân stroma thẳng Màu cam trắng (chủ yếu trắng vàng) stroma có xu DTA hướng cong hình vịng cung, phần đầu phình Màu cam sáng, giá thể TNA màu trắng, phần stroma bị uốn cong từ stroma trở lên, đầu nhọn Như vậy, tổ hợp lai thành cơng có (TDT, TNA) có tính trội vượt bậc số lượng thể, màu sắc, đặc điểm stroma chứng minh giống có đặc điểm tốt cho việc ứng dụng vào sản xuất thử nghiệm 43 A(DTA) B(TNA) C(TDT) Hình 3.7 Hình ảnh thể tổ hợp lai 3.4 Xác định hàm lượng cordycepin tổ hợp lai thu Kết đánh giá hàm lượng cordycepin tổ hợp lai có khác so với chủng bố mẹ Trong đó, tổ hợp lai (TDT, TNA) có hàm lượng cordycepin tích lũy cao gấp đơi so với chủng bố mẹ, tổ hợp lai (TDT) 2,15mg/g Nghiên cứu Naru Kang cộng sự, chủng tạo phương pháp lai hữu tính có hàm lượng cordycepin chủng bố mẹ 30% Ngồi ra, nghiên cứu cho thấy chủng có khả tích lũy cordycepin cao, mặt hình thái thể có biến dị kiểu hình, số lượng thể so với chủng bố mẹ (Stringer cộng sự.;2005) Vậy, dựa vào kết so sánh hàm lượng cordycepin tổ hợp lai so với bố mẹ Có hai tổ hợp (TDT, TNA) với hàm lượng cao gấp đơi hai tổ hợp lựa chọn tiếp tục nghiên cứu sản xuất giống 44 Hình 3.8 Hàm lượng cordycepin tổ hợp lai (mg/100g) 3.5 Đặc điểm của tổ hợp lai tiềm tuyển chọn Kết nghiên, chủng nấm C militaris phát triển thơng qua hình thực lai hữu tính, kết hợp ngẫu nhiên để tạo thành chủng dựa đặc điểm di truyền, hình thái khả tích lũy cordycepin Dựa vào đặc điểm hình thái tổ hợp lai, nghiên cứu tuyển chọn tổ hợp lai (TDT) (TAN) hai tổ hợp lai có đặc điểm trội khả sinh trưởng, đặc điểm phát triển thể khả tích lũy cordycepin Tổ hợp lai (TDT) hệ sợi nấm có tốc độ sinh trưởng 0,84cm/ngày Giống dịch thể khuẩn lạc chủng nhỏ 1,5mm điều kiện thuận lợi giúp giống phát triển nhanh môi trường phát sinh stroma Tuy tổ hợp lai (TDT) có hàm lượng cordycepin thấp tổ hợp lai (TNA) Nhưng xét đặc điểm hình thái, tổ hợp lai (TDT) có màu sắc dạng đặc trưng nấm C militaris, số lượng stroma nhiều gấp đôi tổ hợp (TNA) Hàm lượng cordycepin hũ nuôi (50cm2) tổ hợp (TDT) thu 8,67mg/hũ tổ hợp (TNA) đạt 3,11mg/hũ 45 Bảng 3.6 Đặc điểm lựa chọn tổ hợp lai Đặc điểm Tổ hợp lai TDT Tốc độ sinh trưởng hệ 0,84cm/ngày sợi Đặc điểm khuẩn lạc Đường 1,15±0,03mm Khối lượng 0,471(g/100ml) TNA 0,74cm/ngày kính Đường kính 1,1±0,01mm khô Khối lượng khô 0,383(g/100ml) Số lượng stroma 72±00 16,7±1,15 Chiều dài stroma 48±2 63±4,2 Màu cam sáng, giá Màu cam đậm, đầu thể màu trắng, Phần Màu sắc, đặc điểm trịn phình đỉnh, stroma bị uốn cong từ thể thân stroma thẳng stroma trở lên, đầu nhọn Hàm lượng cordycepin 5,89mg/g 6.08mg/g Hàm lượng cordycepin thu trên/50cm2 (hủ nuôi) 8,67mg/hũ 3,11mg/hũ Vậy nghiên cứu tìm thấy tổ hợp lai (TDT) tổ hợp có đặc điểm sinh trưởng vượt trội có khả tích lũy cordycepin 5.89mg/g cao chủng bố mẹ Hàm lượng cordycepin đơn vị nuôi 8,67mg/hũ cao gấp 2,7 lần so với tổ hợp lai (TNA) 46 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu ta nhận thấy mơi trường tối ưu để tiến hành lai bào tử đơn nấm C militaris có chứa 20g gạo lứt, 4g nhộng tằm 64ml dịch (20g sucrose, 20g peptone, 1g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4 pha 1l nước cất) Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi tổ hợp lai TN x DT(TDT) mơi trường thể lỏng có lượng sinh khối cao vượt trội so với tổ hợp lai lại Sinh khối lớn giúp giảm thiểu thể tích ni cầy tăng khả tích lũy cordycepin, từ chọn tổ hợp lại nhiều hợp chất cordycepin để tiếng hành nuôi với quy mô lớn nhằm tạo nguôn giống tốt kinh tế Trong số tổ hợp lai, tổ hợp lai (TDT) có đặc điểm hình thái sinh trưởng hàm lượng cordycepin 5,89mg/g vượt trội so với chủng bố mẹ 47 4.2 Kiến nghị Tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng tổ hợp lai tiềm (nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng) để nâng cao suất, hàm lượng cordycepin tổ hợp lai Triển khai đánh giá hiệu nuôi trồng chủng giống (TDT) quy mô sản xuất thử nghiệm Sử dụng phương pháp phân lập bào tử tốt nhằm tạo lai có khả sinh trưởng mạnh, bị nhiễm khuẩn có nhiều hợp chất cordycepin 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Nguyễn Thị Liên Thương, Trần Diệp Phương Danh, Nguyễn Văn Hiệp (2016), ‘Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: Đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni trồng nấm’, Can Tho Univ J Sci., vol 44, p [2] Trần Thu Hà, Lê Văn Vẻ, Nguyễn Nam Giang Phạm Thị Thu (2016), ‘Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng nấm Đông trùng hạ thảo môi trường nhân giống dịch thể’, tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, vol 7(8) [3] Trần Văn Năm., Lê Thị Diệu Trang (2014), ‘Đông trùng hạ thảo – công dụng, xu hướng sản xuất thương mại’, Trung tâm thông tin Khoa học Công nghệ, Sở khoa học công nghệ TP.HCM Tiếng Anh [4] Chatterjee, R.M P C., Srinivasan, K S (1957), ‘Cordyceps sinensis (Berkeley) Saccardo: Structure of Cordycepic Acid*’, J Am Pharm Assoc., vol XLVI, no 2, pp 114 –118 [5] Che, Z.M (2003) "assessment on edible safety of artificially cultivated Cordyceps militaris fruiting body", Mycobiology, vol 25, no 3, pp 45– 46 [6] Che, Z.M., Wang, Y (2004), ‘Study on the breeding of a new variety of Cordyceps militaris by mutated with ultraviolet radiation’, Food Ferment Ind., vol 30, pp 35–38 [7] Cho, S.-M., Park, H.-J., Seo, G.-S., Hong, J.-D (2009), ‘Effect of medis composition on the Cordycepin and content Nutritional Components of Cordyceps militaris’, Korean J Mycol., vol 37, no 2, pp 161–166 49 [8] Christian, G.D.N E., Henry, A.C.F (1837), ‘das system der pilze: part one’ [9] Coppin, E., Debuchy, R., Arnaise, S., Picard, M (1997), ‘Mating types and sexual development in filamentous ascomycetes’, Microbiol Mol [10] Das, S K., Masuda, M., Sakurai, A., Sakakibara, M (2010), ‘Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: Current state and prospects’, Fitoterapia, vol 81, no 006, pp 961–968 [11] Dong J, LeiC., AI X., Wang Y (2012) Selenium enrichment on Cordyceps militarius Link and analysis on its main active components Applied Biochemistry and Biotechnology 166:1215-1224 [12] Dong, C.H and Y.J Yao, 2005 Nutritional requirements of mycelial growth of Cordyceps sinensis in submerged culture J Appl Microbiol., 99(3), pp 483-492 [13] Dong, Jing & Lei, C & Zheng, Xiao & Ai, Xun & Wang, Yun & Wang, Q (2013) Light Wavelengths Regulate Growth and Active Components of Cordyceps militaris Fruit Bodies Journal of Food Biochemistry 37 10.1111/jfbc.12009 [14] Fan, D.-D., Wang, W., and Zhong, J.-J (2012) Enhancement of cordycepin production in submerged cultures of Cordyceps militaris by addition of ferrous sulfate Biochem Eng J 60, 30–35 doi: 10.1016/j.bej.2011.09.014 [15] Fengyao Wu., Hui Yan., Xiaoning Ma., Junqing Jia., Guozheng Zhang., Xijie Guo Gui., Zhongzheng (2016), ‘Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris’, African J Microbiol Res., vol 5, no 18, pp 2743–2751 50 [16] Gao X.H., Wu W., Qian G.C and Wei C - Study on influences of abiotic factors on fruit body differentiation of Cordyceps militaris, Acta [17] Hong, W., Jing, W., Nan, L., Aiping, F., MingJie, C., DaPeng, B (2010), ‘Distribution of mating-type genes in fruiting and non-fruiting forms of Cordyceps militaris‘, vol 17, no Berghahn Books [18] Hur, H (2008), ‘Chemical Ingredients of Cordyceps militaris’, Mycobiology, vol 36, no 4, p 233 [19] Jo, W.S., et al.(2010), ‘ The Anti-inflammatory Effects of Water Extract from Cordyceps militaris in Murine Macrophage ’, Mycobiology, vol 38, no 1, p 46 [20] Jones, S K., Bennett, R J (2011), ‘Fungal mating pheromones: Choreographing the dating game’, Fungal Genetics and Biology, vol 48, [21] Kamble, V R., Agre, D.G (2012), ‘Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra’, vol 5, no 2, pp 224– 225 [22] Kang, N., Lee, H., Park, I., Seo, S (2017), ‘Development of high cordycepin-producing Cordyceps militaris strains’, Mycobiology, vol 45, no 1, pp 31–38 [23] Kim, J., Saplota, K., Park, S et al.(2006), ‘A fibrinolytic enzyme from the medicinal mushroom Cordyceps militaris’, J Microbiol., vol 44, no 6, pp 622–631 [24] Klix, V., Nowrousian, M., Ringelberg, C., Loros, J J., Dunlap, J C., Pöggeler, S (2010), ‘Functional characterization of MAT1-1-specific mating-type genes in the homothallic Ascomycete Sordaria macrospora provides new insights into essential and nonessential sexual regulators’, Eukaryot Cell, vol 9, no 6, pp 894–905 51 [25] Kobayasi, Y (1941), ‘The genus Cordyceps and its allies’, Sci reports Tokyo Bunrika Daigaku, vol 84, pp 52–260 Sci reports Tokyo Bunrika Daigaku, vol 84, pp 52–260 [26] Kobayasi, Y (1982), ‘Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella’, Kobayasi, Y., vol 23, pp 329–364 [27] Lin, X., Heitman, J (2007), ‘Mechanisms of Homothallism in Fungi and Transitions between Heterothallism and Homothallism’, in Sex in Fungi, Washington, DC, USA: ASM Press, 2014, pp 35–57 [28] Lu Cui-wen (2008), ‘Mutation Breeding of Cordyceps militaris (L.) Link from Mycelium Fragments’ [29] Lu, Y., Xia, Y., Luo, F., Dong, C., Wang, C (2016), ‘Functional convergence and divergence of mating-type genes fulfilling in Cordyceps militaris’, Fungal Genet Biol., vol 88, pp 35–43 [30] Mains, E B (1958), ‘North American Entomogenous Species of Cordyceps’, Mycologia, vol 50, no 2, pp 169–222 [31] Moore, R.T (1964), ‘Fine structure of mycota 12 Karyochorisis somatic nuclear division - in Cordyceps militaris’, Z Zellforsch, vol 63, no 7, pp 921–937 [32] Ni, M., Feretzaki, M., Sun, S., Wang, X., Heitman, J (2011), ‘Sex in Fungi’, Annu Rev Genet., vol 45, pp 405–430 [33] Park J.P., Kim S.W., Hwang H.J and Yun J.W - Optimization of submerged culture conditions for the mycelial growth and exobiopolymer production by Cordyceps militaris, Letters in Applied Microbiology 33 (1) (2001) 76-81 52 [34] Park, B.T., Na, K.H., Jung, E.C., Park, J.W (2009), ‘Antifungal and anticancer activities of a protein from the mushroom Cordyceps militaris’, Korean J Physiol Pharmacol., vol 13, no 1, pp 49–54 [35] Park, J.-P., Kim, S.-W., Hwang, H.-J., Cho, Y.-J., and Yun, J.-W (2002) Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris Enzyme Microb Technol 31, 250– 255 doi: 10.1016/S0141-0229(02)00099-6 [36] Paterson, R (2008), ‘Cordyceps - A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?’, Phytochemistry, vol 69, no Phytochemistry, pp 1469–1495 [37] Paterson, R., Bridge, P D (1994), ‘Biochemical techniques for [38] Raethong, N., H Wang, J Nielsen, and W Vongsangnak, 2020 Optimizing cultivation of Cordyceps militaris for fast growth and cordycepin overproduction using rational design of synthetic media Comput Struct Biotechnol J., 18, pp 1-8 [39] Sengupta,S., Ghosh, A.K (1999), ‘The insects-born fungus of Korea in color Kyohak Publishing Co Ltd., Seoul’, doi: 10.1016/0167[40] Shih, I-L., Tsai, K-L (2007), ‘Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of [41] Shonkor, K.D.A.S., Shinya, F., Mina, M (2010), ‘Efficient roduction of anticancer agent Cordycepin by repeated batch culture of Cordyceps militaris mutant’, Proc World Congr Eng Comput Sci., vol II, pp 3–9 [42] Shrestha, B., Han, S K., Sung, J M., Sung,G H (2012), ‘Fruiting body formation of Cordyceps militaris from multi-ascospore isolates and their single ascospore progeny strains’, Mycobiology, vol 40, no 2, pp 100–106 53 [43] Shrestha, B., Kim, H K., Sung, G H., Spatafora, J W., Sung, J M (2004), ‘Bipolar heterothallism, a principal mating system of Cordyceps militaris in vitro’, Biotechnol Bioprocess Eng., vol 9, no 6, pp 440–446 [44] Stringer, S C., Webb, M D., George, S M., Pin, C., Peck, M W (2005), ‘Heterogeneity of times required for germination and outgrowth from single spores of nonproteolytic Clostridium botulinum’, Appl Environ [45]Sung, J M (1996), ‘Insect-Born Fungi of Korea’, p Kyo-Hak Publishing Co Ltd.; Seoul; Korea [46] T.-K Goh, ‘Single-spore isolation using a hand-made glass needle’, 1999 [47] Tan, Q I., Cai, T A O., Wei, J., Feng, A., Mao, W., Bao, D.(2011), ‘Molecular identification of mating type genes in asexual spores of Cordyceps militaris’, Proceedings of the 7th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products pp 52–56 [48] Tang, J., Qian, Z., Wu, H (2018), ‘Enhancing cordycepin production in liquid static cultivation of Cordyceps militaris by adding vegetable oils as the secondary carbon source’, Bioresour Technol., vol 268, pp 60–67 [49] Verma, A K (2020), ‘Cordycepin: a bioactive metabolite of Cordyceps militaris and polyadenylation inhibitor with therapeutic potential against COVID-19’, J Biomol Struct Dyn [50] Wang, G.D (1995), "Ecology, cultivation and application of Cordyceps and Cordyceps sinensis", p Scientific and Technical Documents, Beijing [51] Wen, T C., Kang, J C., Hyde, K D., Li, G R., Kang, C., Chen, X (2014), ‘Phenotypic marking of Cordyceps militaris fruiting-bodies and 54 their cordycepin production’, Chiang Mai Journal of Science, vol 41, no pp 846–857 [52] Wu, Chiu-Yeh et al “Effects of Illumination Pattern during Cultivation of Fruiting Body and Bioactive Compound Production by the Caterpillar Medicinal Mushroom, Cordyceps militaris (Ascomycetes).” International journal of medicinal mushrooms vol 18,7 (2016): 589-97 doi:10.1615 / intjmedmushrooms v18 i7.40 [53] Yan, H., Zhu, D., Xu, D., Wu, J., Bian, X (2008), ‘A study on Cordyceps militaris polysaccharide purification, composition and activity analysis’, African J Biotechnol., vol 7, no 22, pp 4004–4009 [54] Yokoyama, E., Yamagishi, K., Hara, A (2003), ‘Structures of the mating-type loci of Cordyceps takaomontana’, Appl Environ Microbiol., vol 69, no 8, pp 5019–5022 [55] Zhang, G., Liang, Y (2013), ‘Improvement of fruiting body production in Cordyceps militaris by molecular assessment’, Archives of Microbiology, vol 195, no pp 579–585 [56] Zhang, K., Yuan-Ying, S., Cai, L (2013), ‘An Optimized Protocol of Single Spore Isolation for Fungi’, Cryptogam Mycol., vol 34, no 4, pp 349–356 [57] Zheng, W C.P., Xia, Y., Xiao, G., Xiong, C., Hu, X., Zhang, S., Zheng, H., Huang, Y., Zhou, Y., Wang, S., Zhao, GP., Liu, X., Leger RJ (2011), ‘Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional chinese medicine’, Genome Biol., vol 12, no 11, pp.116 55