Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI SỰ SINH TRƢỞNG CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, Tháng 12 - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nấm đông trùng hạ thảo tên chung nhóm loài nấm ký sinh sâu non, sâu trƣởng thành nhộng số loại côn trùng Nấm đƣợc đặt tên đông trùng hạ thảo dựa vào trình phát sinh, phát triển vòng đời chúng Sâu non, nhộng, sâu trƣởng thành số loài côn trùng nằm dƣới đất mặt đất bị nấm ký sinh Các loài nấm sử dụng chất hữu thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết Mùa đông, nhiệt độ ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể Nhƣ vậy, mùa đông nấm ký sinh sâu, tồn giai đoạn hệ sợi, mùa hạ mọc thành nấm nên có tên đông trùng hạ thảo Một số loài đáng ý Cordyceps sinensis Cordyceps militaris Chi nấm Cordyceps đƣợc thu mẫu định loại 400 loài khác theo hệ thống phân loại truyền thống, loài đƣợc xếp vào họ Clavicipitaceae [33] Đông trùng hạ thảo không đƣợc nhà khoa học nghiên cứu, mà đƣợc xã hội quan tâm đến, nấm loại dƣợc liệu quý, tốt cho sức khoẻ ngƣời, phù hợp với lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thiếu niên, ngƣời già Theo tài liệu ghi chép đông dƣợc cổ, đông trùng hạ thảo vị thuốc bồi bổ quý giá, có tác dụng tích cực với bệnh nhƣ rối loạn tình dục, thận hƣ, liệt dƣơng, di tinh, đau lƣng, mỏi gối, ho hen, có tác dụng tốt trẻ em còi xƣơng chậm lớn Một số nghiên cứu đại gần nấm đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cƣờng công tuyến thƣợng thận, cải thiện đƣợc chức thận, nâng cao lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thƣ chất phóng xạ Ở Việt Nam, nghiên cứu đông trùng hạ thảo nhìn chung chƣa nhiều Phần lớn mà nhà nghiên cứu Việt Nam có đƣợc nguồn Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ dƣợc liệu quý dừng lại việc phát chủng đông trùng hạ thảo sẵn có tự nhiên Một số tiến hành nghiên cứu sâu đặc tính sinh lý đông trùng hạ thảo dừng lại mức độ thử nghiệm Nhìn chung nghiên cứu đông trùng hạ thảo Việt Nam gặp nhiều khó khăn Từ sở lý luận khoa học thực tiễn nói trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng tới sinh trƣởng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” Mục tiêu nghiên cứu đề tài: - Xác định đƣợc ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng, nhiệt độ, độ ẩm không khí, pH môi trƣờng đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn nhân giống - Xác định đƣợc ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng phƣơng thức cấy giống đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn ƣơm sợi - Xác định đƣợc ảnh hƣởng nhiệt độ, độ ẩm không khí cƣờng độ chiếu sáng đến hình thành phát triển thể nấm Cordyceps militaris Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng, nhiệt độ, độ ẩm không khí, pH môi trƣờng đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn nhân giống - Nghiên cứu ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng phƣơng thức cấy giống đến sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn ƣơm sợi - Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ, độ ẩm không khí cƣờng độ chiếu sáng đến hình thành phát triển thể nấm Cordyceps militaris Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Kết nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố tới sinh trƣởng hệ sợi, hình thành, phát triển thể nấm Cordyceps militaris khoa học cho việc hoàn thiện đƣa quy trình sản xuất thể nấm đông trùng hạ thảo vào thực tế phục vụ đời sống ngƣời Ngoài kết đề tài cung cấp thông tin khoa học cho nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu loài nấm quý Cordyceps militaris Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Cordyceps Nấm đông trùng hạ thảo đƣợc xem quý, Những câu truyện mang tính thần thoại truyền thuyết liên quan đến loài nấm đƣợc lƣu truyền nhiều thiên niên kỷ Hiện nay, ghi nhận thời gian phát loài nấm chƣa đƣợc thống Theo Das (2009) nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps đƣợc biết đến từ năm 2000 trƣớc công nguyên [15] Nhƣng theo Holliday cộng (cs) (2004) tổng hợp từ nhiều nguồn tài liệu ghi nhận nấm đông trùng hạ thảo đƣợc thực Trung Quốc vào năm 620 sau công nguyên, vào triều đại nhà Đƣờng (618-907 sau công nguyên) Sự ghi nhận làm rõ chất sinh học từ câu truyện huyền thoại truyền thuyết đông trùng hạ thảo Đông trùng hạ thảo sinh vật tồn hàng năm đƣợc chuyển cách thần bí từ động vật sang thực vật vào mùa hè sau lại từ thực vật chuyển sang động vật vào mùa đông Tiếp sau có nhiều công trình đƣợc xuất với nội dung loài nấm đông trùng hạ thảo học giả xứ Tây Tạng từ kỷ 15 đến kỷ 18, có công trình đƣợc cho có sở khoa học tin cậy mô tả nấm đông trùng hạ thảo Wu-Yiluo năm 1757, sách Dược điển, dƣới triều đại Thanh Theo sau học giả xứ Tây Tạng, việc phát giá trị đông trùng hạ thảo thuộc ngƣời chăn bò núi Hymalaya Tây Tạng cũ Nepal, họ thấy bò gặm cỏ ăn phải nấm đông trùng hạ thảo vào mùa xuân trở nên cuồng nhiệt, bò đực tìm theo sát bò [18] 1.1.2 Phân loại học Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chi nấm Cordyceps đƣợc thu mẫu định loại 400 loài khác Theo hệ thống phân loại truyền thống, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, Hypocreales, họ Clavicipitaceae [33] Hình 1.1 Hình ảnh đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (www.jscr.jp) Phân loại nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Phân ngành : Ascomycotina Lớp : Sordariomycetes Bộ : Hypocreales Họ : Clavicipataceae Chi : Cordyceps Loài : Cordyceps militaris 1.1.3 Đặc điểm phân bố Cordyceps Nấm đông trùng hạ thảo tên chung nhóm loài nấm ký sinh sâu non sâu trƣởng thành số loại côn trùng Nấm đƣợc đặt tên đông trùng hạ thảo dựa vào trình phát sinh, phát triển vòng đời chúng Sâu non, nhộng, sâu trƣởng thành số loài côn trùng nằm dƣới đất mặt đất bị nấm ký sinh Các loài nấm sử dụng chất hữu Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết Mùa đông, nhiệt độ ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể [7] Nấm đông trùng hạ thảo thƣờng phát vào mùa hè số cao nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt biển; vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam Đây nguồn đông trùng hạ thảo tự nhiên [11] Ngoài phát vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal, Bhutan Hiện nay, khoảng 400 loài đƣợc tìm thấy, có khoảng 90 loài đƣợc phát Trung Quốc [44] Tại Việt Nam, đông trùng hạ thảo đƣợc phát nhiều địa điểm khác Năm 2009, Phạm Quang Thu cs phát chủng Cordyceps nutans Pat khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang [3], Cordyceps gunni Berk vƣờn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc [4], Cordyceps militaris Link vƣờn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai [5] Năm 2009, Đái Duy Ban cộng công bố phát loài đông trùng hạ thảo lần đƣợc tìm thấy Việt Nam loài đông trùng hạ thảo có tên Isaria cerambycidae Loài Đông trùng hạ thảo đƣợc tìm thấy ấu trùng xén tóc [1] Năm 2010, Phạm Thị Thùy Viện phát đƣợc giống Cordyceps nutans Vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng (Ninh Bình) Cordyceps militaris Vũ Quang (Hà Tĩnh) [8] 1.2 Các hoạt chất nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1.2.1 Cordycepin Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin purin alkaloid có dạng nucleosid adenosin bị oxy vị trí 3’ phần đƣờng ribose Cordycepin đƣợc phân lập lần đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris Bằng phân tích phổ NMR (nuclear magnetic resonance) IR (infrared), cordycepin đƣợc xem nhƣ hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc ly trích từ thể Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ sợi nấm Cordycepin có công thức C10H13N5O3 có phân tử lƣợng 251, điểm nóng chảy 230-2310C, độ hấp thu cực đại 259 nm Có thể hoà tan dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nhƣng không hoà tan benzen, ether hay chloroform, nhiều nghiên cứu sử dụng dung dịch muối khử trùng đệm phosphat làm dung môi [44] Vì cordycepin có cấu trúc tƣơng tự adenosin nên RNA polymerase phân biệt Khi tham gia tổng hợp nên phân tử RNA, cordycepin ngăn chặn trình kéo dài thêm RNA tạo phân tử RNA kết thúc sớm Do đó, cordycepin đƣợc xem nhƣ chất kháng ung thƣ hiệu [20] Năm 2003, Sun cs chứng minh hàm lƣợng cordycepin với hoạt tính kháng khối u Cordyceps kyushuensis cao Cordyceps sinensis Cordyceps militaris, Cordyceps nuôi cấy cao tự nhiên, sợi nấm cao ấu trùng chủ [32] Tác giả khẳng định hợp chất có tiềm dƣợc học cao Năm 2007, Noriko Yoshikawa cs chứng minh cordycepin có hoạt tính kháng ung thƣ hiệu thông qua việc ức chế trình methyl hóa acidnucleic polyadenin hóa [40] Đồng dạng cordycepin 2’,5’- oligoadenin có tác dụng kháng virus thông qua việc ức chế reverse transcriptase Tác giả chứng minh tiền chất cordycepin adenosin có hoạt tính kháng ung thƣ 1.2.2 Acid cordyceptic Acid cordyceptic, isomer acid quinic, đƣợc nghiên cứu Cordyceps sinensis năm 1957 Cấu trúc tinh thể acid cordyceptic đƣợc xác định D-mannitol Mannitol hợp chất sinh học có nhiều hoạt tính quan trọng nhƣ kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho Chất tồn tự nhiên chủ yếu rễ, thân cây; đƣợc tìm thấy nhiều nấm ăn, cà rốt rêu Hàm lƣợng acid cordyceptic Cordyceps khoảng 7-29% Mannitol có cấu tạo gồm alcohol đƣờng, polyol; tƣơng tự nhƣ xylitol hay sorbitol Tuy nhiên, mannitol có xu hƣớng loại bỏ ion hydrogen nƣớc làm Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ dung dịch trở nên acid Công thức hóa học mannitol C6H14O6, trọng lƣợng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 1660C, tỷ trọng 1,489 (200C) nhiệt độ sôi 290-2950C (467 kPa) Mannitol có nhiều đặc tính quan trọng đƣợc sử dụng y học thực phẩm, hàm lƣợng mannitol có thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85 mg/g, sợi nấm có hàm lƣợng acid cordyceptic cao so với thể [44] 1.2.3 Polysaccharid Cordyceps chứa lƣợng lớn polysaccharid, khoảng 3-8% khối lƣợng, hợp chất sinh học Từ năm 1977, nhiều nghiên cứu khoa học Trung Quốc Nhật Bản chứng minh đƣợc ích lợi từ polysaccharid việc kháng ung thƣ, kháng oxy hóa, kháng viêm nhƣ tác động điều hòa miễn dịch Các hợp chất polysaccharid Cordyceps galactomannan nhiều nhánh Các hợp chất bao gồm D-mannose D-galactose với tỷ lệ 3:5, thƣờng chứa tỷ lệ nhỏ protein Nó cấu trúc phân nhánh gồm liên kết (1-6) (1-2) liên kết gốc α-D-mannopyranosyl mạch chính, có liên kết đa dạng monosaccharid kế cận tạo thành cấu trúc xoắn vòng nhỏ Tuy nhiên, mannoglucan với trọng lƣợng phân tử xấp xỉ 7700 g/mol đƣợc phân tách gần chứa đơn vị mannose glactose với tỷ lệ 1:9 Các phân tích cho thấy có khung sƣờn α-D-glucan với liên kết (1-4) (1-3); mạch nhánh α-D-(1-6)-mannopyranose (Manp) đƣợc gắn vào khung sƣờn qua vị trí O-6 gốc α-(1-3)-glucopyranosyl (Glcp) Nghiên cứu cho thấy dƣợc tính polysaccharid từ đặc tính nhƣ trọng lƣợng phân tử, ví dụ nhƣ polyglucan có trọng lƣợng phân tử lớn (10-1000 kDa) có xu hƣớng tan nƣớc tốt có hoạt tính kháng khối u hiệu Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thƣ tăng cƣờng miễn dịch cho thể hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp [34] 1.2.4 Ergosterol Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 Ergosterol tiền chất quan trọng cho vitamin D Hàm lƣợng ergosterol Cordyceps militaris nuôi cấy cao, đứng sau Cordyceps sinensis tự nhiên phân lập Tây Tạng Các ergosterol chất đồng dạng có hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận giảm immunoglobin A [44] 1.2.5 Nucleotid Nucleotid chất có nhiều Cordyceps, có tác dụng kháng khối u, phóng thích tín hiệu dẫn truyền thần kinh, chống co giật… Trong đó, hàm lƣợng guanosin thƣờng cao Hàm lƣợng nucleotid Cordyceps nuôi cấy cao hẳn Cordyceps tự nhiên, điều liên quan đến hoạt động biến dƣỡng nhanh trình nuôi cấy Hàm lƣợng nucleotid tự nhiên thấp thoái biến nucleotid trình ủ đông [42] Khí hậu ấm ẩm ƣớt điều kiện làm tăng nucleotid Cordyceps Năm 2003, Sun cs nghiên cứu thấy có loại nucleosid nitrogen base có Cordyceps kyushuensis [32] Năm 2010, Xie Jian Wei cs tách xác định đƣợc loại thymin, adenosin, adenin cordycepin có Cordyceps sinensis, nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng nucleotid khác tùy theo vị trí phân lập [38] 1.2.6 Protein acid amin Hàm lƣợng protein Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao gồm 18 acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin, methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin, cystein tryptophan Các acid amin có hàm lƣợng cao glutamat, arginin acid aspartic có dƣợc tính cao arginin, glutamat, tryptophan tyrosin Năm 2011, Zheng cs nghiên cứu họ protein Cordyceps militaris [43] Kết cho thấy gen Cordyceps militaris chứa 61 họ protease nhƣng hầu hết serin protease metallopeptidase, 12 gen mã hóa trypsin, 167 gen mã hóa protein kinase, 105 gen mã hóa glycosid hydrolase Hơn nữa, Cordyceps Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 54 Công nghê phục vụ phát triển sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr.45-50 Phạm Thị Thùy (2010), “Nghiên cứu phát triển nguồn nấm Beauveria Metarhizium để ứng dụng phòng trừ sâu hại trồng, rừng phát nguồn nấm Cordyceps sp làm thực phẩm chức cho ngƣời”, Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, tr.224231 Trần Minh Trang, Đinh Minh Hiệp, Huỳnh Thƣ (2014), “Tách chiết exopolysaccharite từ dịch nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis khảo sát hoạt tính kích thích tăng sinh PBMC”, Kỷ yếu hội nghị Nấm học nghiên cứu ứng dụng khu vực phía nam năm 2014, tr.87 10 Nguyễn Mậu Tuấn, Trƣơng Phi Hùng, Nguyễn Thái Huy, Dƣơng Thị Ngọc (2009), “Hiệu dịch chiết nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu, Paecilomyces tenuipes đến khả bơi chuột”, Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, 2(15), tr.110-115 11 Nguyễn Mậu Tuấn, Nguyễn Thái Huy, Trƣơng Phi Hùng, Lê Thị Thơ, Nguyễn Kim Chi (2013), “Một số kết nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Lâm Đồng”, Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghê phục vụ phát triển sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr.51-55 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 12 Cha S.H., Kim J.K., Lim J.S., Yoon C.S., Koh J.H., Chang H.I., Kim S.W (2006), “Morphological characteristics of Cordyceps sinensis 16 and production of mycelia and exo-biopolymer from molasses in submerged culture”, Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 12(1), pp.115120 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 55 13 Cho D.H (2003), 굼벵이(Allomyrina dichotoma Linnaeus)에서의 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 자실체 유도, 한국자원식물학회지, 16(1), 1-7 14 Choi J.N., Kim J., Lee M.Y., Park D.K., Hong Y.S., Lee C.H (2010), “Metabolomics revealed novel isoflavones and optimal cultivation time of Cordyceps militaris fermentation”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, pp 4258-4267 15 Das S.K (2009), Production of anti-cancer agent cordycepin from the medicinal mushroom Cordyceps militaris, A Dissertation of Doctor of Engineering, University of Fukui, Japan 16 Gams W., Zare R (2003), “A taxonomic review of the clavicipitaceous anamorphs parasitizing nematodes and other microinvertebrates” In: Clavicipitalean fungi: Evolutionary biology, Chemistry, Biocontrol and Cultural Impacts, Marcel Dekker Inc., New York, pp.17-73 17 Hodge K.T (2003), “Clavicipitaceous anamorphs” In: Clavicipitalean fungi: Evolutionary biology, Chemistry, Biocontrol and Cultural Impacts Marcel Dekker Inc., New York, pp.75-123 18 Holliday J., Cleaver P., Loomis-Powers M., Patel D (2004), “Analysis of Quality and Techniques for Hybridization of Medicinal Fungus Cordyceps sinensis”, International Journal of Medicinal Mushrooms, 6, pp 147-160 19 Hung L.T., Keawsompong S., Hanh V.T., Sivichai S., N.L Hywel-Jones (2009), “Effect of Temperature on Cordycepin Production in Cordyceps militaris, Thai Journal of Agricultural Science, 42 (4), pp.219-225 20 Itoh H., Shioda T., Matsura T., Koyama S., Nakanishi T., Kajiyama G., Kawasaki T (1994), “Iron ion induces mitochondrial DNA damage in HTC Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 56 Rat Hepatoma Cell Culture - Role of antioxidants in mitochondrial DNA protection from oxidative stresses”, Arch Biochem Biophys, 313(1), pp.120 – 125 21 Jiang Y., Wong J.H., Fu M., Ng T.B., Liu Z.K., Wang C.R., Li N., Qiao W.T., Wen T.Y., Liu F (2011), “Isolation of adenosin, iso-sinensetin and dimethylguanosine with antioxidant and HIV-1 protease inhibiting activities from fruiting bodies of Cordyceps militaris”, Phytomedicine, 18(2&3), pp.189- 282 22 Kim J.S., Sapkota K., Park S.E., Choi B.S, Kim S., Hiep N.T, Kim C.S, Choi H.S, Kim M.K, Chun H.S, Park Y., Kim S.J (2006), “A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris”, The Journal of Microbiology, 44(6), pp.622-631 23 Kobayasi Y (1982), “Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella, Transactions of the Mycological Society of Japan, 23, pp.329364 24 Lee H., Kim Y.J., Kim H.W (2006), “Induction of apoptosis by Cordyceps militaris through activation of caspase-3 in leukemia HL-60 cells”, Biol Pharm Bull, 29(4), pp.670-674 25 Liu Z., Li P., Zhao D., Tang H., Guo J (2010), “Protective effect of extract of Cordyceps sinensis in middle cerebral artery occlusion – induced focal cerebral is chemia in rats”, Behavioral and Brain Functions, 26 Mao X.L (2000), The macrofungi in China, Henam Technical and Science Publication House 27 Mo S.J (2000), Insect-born fungus of Korea, Kangwon National Univ., Korea Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 57 28 Nan J.X., Park E.J., Yang B.K., Song C.H., Ko G., Sohn D.H (2001), “Antifibrotic effect of extracellular biopolymer from submerged mycelial cultures of Cordyceps militaris on liver fibrosis induced by bile duct ligation and scission in rats Arch Pharm Res., 24, pp.327-332 29 Samson R.A., Evans H.C., Latgé J-P (1988), “Atlas of entomopathogenic fungi”, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 30 Semenov, N.N (1935), Chemical Kinetics and Chain Reactions, Oxford University Press, London 31 Suk N.K., Su J.Y., Ho K.Y., Won H.J., Won K.H (2001), “Cytotoxic activities of acetoxyscirpenediol and ergosterol peroxide from Paecilomyces tenuipes”, Life Sciences, 69, pp.229-237 32 Sun Y.J., Lü P., Ling J.Y., Zhang H.X., Chen C., Zhang C.K (2003), “Nucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different parts”, Yao Xue Xue Bao, 38(9), pp 690-694 33 Sung J.H., Jones N.L.H., Sung J.M., Luangsa-ard J.J., Shrestha B., Spatafora J.W (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi, Studies in Mcology, 57, pp.5–59 34 Wang S.Y., Shiao,M.S (2000), “Pharmacological functions of Chinese medicinal fungus Cordyceps sinensis and related species”, Journal of Food and Drug Analysis, 8(4), pp.248-257 35 Wongsa P (2005), pathogenic fungus “Isolation and in vitro cultivation of the insect Cordyceps unilateralis”, Thailand Mycol Res,109,pp.936-40 36 Wu F., Yan H., Ma X., Jia, J., Zhang G., Guo,X.,Gui Z (2011), “Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharid from Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 58 cultured Cordyceps militaris”, African Journal of Microbiology Research, 5(18), pp 2743-2751 37 Xiao J.H., Xiao D.M., Sun Z.H., Xiao Y., Zhong, J.J (2011), “Antioxidative potential of polysaccharid fractions produced from traditional Chinese medicinal macrofungus Cordyceps jiangxiensis in vitro”, African Journal of Biotechnology, 10(34), pp.6607-6615 38 Xie J.W., Huang L.F., Hu W., He Y.B., Wong K.P (2010), “Analysis of the main nucleosids in Cordyceps sinensis by LC/ESI-MS”, Molecules, 15, pp 305-314 39 Yoo H.S., Shin J.W., Cho J.H., Son C.G., Lee Y.W., Park S.Y., Cho C.K (2004), “Effects of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth”, Acta Pharmacol Sin, 25(5), pp.657-65 40 Yoshikawa N., Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M (2007), “Reinforcement of antitumor effect of Cordyceps sinensis by 2’ – Deoxycoformycin, an adenosin deaminase inhibitor”, in vivo, 21, pp.291-296 41 Yu H.M., Wang B.S., Huang S.C., Duh P.D (2006), “Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage”, National Science Council of the Republic of China, China 42 Zhang Z.S., Wang F., Wang X.M., Liu X.L., Hou Y., Zhang Q.B (2010), “Extraction of the polysaccharids from five algae and their potential antioxidant activity in vitro”, Carbohyd Polym, 82, pp.118-121 43 Zheng P., Xia Y., Xiao G., Xiong C., Hu X., Zhang S., Zheng H., Huang Y., Zhou Y., Wang S., Zhao X., Liu X., Leger R., Wang C (2011), “Genome Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 59 sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional chinese medicine”, Genome Biology, 12 44 Zhou X., Gong Z., Su Y., Lin J., Tang K (2009), “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products”, Journnal of Pharmacy and Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN Pharmacology, 61, pp.279-291 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn TS Phạm Việt Hùng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực Một số kết đƣợc công bố đồng tác giả chƣa đƣợc công bố công trình khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hậu Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy hƣớng dẫn TS Phạm Việt Hùng tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ Sinh học – Công ty Cổ phần Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Việt Nam đặc biệt Th.S Vũ Xuân Tạo – Giám đốc Trung tâm tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Đề tài luận văn đƣợc thực với hỗ trợ từ đề tài Khoa học Công nghệ “Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng thể đông trùng hạ thảo thuộc loài Cordyceps militaris chất hỗn hợp tự nhiên sử dụng nguyên liệu sẵn có tỉnh Hòa Bình” Th.S Vũ Xuân Tạo làm chủ nhiệm Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán sở đào tạo thuộc Viện sinh thái Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hậu Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Cordyceps 1.1.2 Phân loại học 1.1.3 Đặc điểm phân bố Cordyceps 1.2 Các hoạt chất nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1.2.1 Cordycepin 1.2.2 Acid cordyceptic 1.2.3 Polysaccharid 1.2.4 Ergosterol 1.2.5 Nucleotid 10 1.2.6 Protein acid amin 10 1.3 Nghiên cứu tác dụng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 11 1.3.1 Các nghiên cứu giới 11 1.3.2 Các nghiên cứu Việt Nam 13 1.4 Sơ lƣợc tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps Việt Nam giới 15 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps giới 15 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps Việt Nam 16 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2 Địa điểm nghiên cứu 20 2.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 20 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn nhân giống 21 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn ƣơm sợi 24 2.4.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên hình thành phát triển thể nấm Cordyceps militaris 25 2.4.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 26 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn nhân giống 27 3.1.1 Đặc điểm sinh trƣởng nấm Cordyceps militaris số môi trƣờng 27 3.1.2 Sự ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris 30 3.1.3 Sự ảnh hƣởng nhiệt độ lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris 32 3.1.4 Sự ảnh hƣởng độ ẩm lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris 34 3.1.5 Sự ảnh hƣởng pH môi trƣờng lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris 36 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn ƣơm sợi 38 3.2.1 Ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn ƣơm sợi 38 3.2.2 Sự ảnh hƣởng phƣơng thức cấy giai đoạn ƣơm sợi 40 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên hình thành phát triển thể nấm Cordyceps militaris 42 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hình thành phát triển thể nấm Codyceps militaris 42 3.3.2 Ảnh hƣởng độ ẩm lên hình thành phát triển thể nấm Codyceps militaris 45 3.3.3 Ảnh hƣởng cƣờng độ chiếu sáng lên hình thành phát triển thể nấm Codyceps militaris 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Cs : Cộng MYPS : Malt Yeast Peptone Sucrose PDA : Potato Dextro Agar RNA : Ribonucleic acid SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) YMA : Yeast Mannitol Agar Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 3.1 Đƣờng kính sinh trƣởng hệ sợ nấm Cordyceps 27 militaris môi trƣờng PDA, MYPS, YMA Sabouraud Bảng 3.2 Đƣờng kính sinh trƣởng hệ sợ nấm Cordyceps 29 militaris môi trƣờng PDA có bổ sung dinh dƣỡng khác Bảng 3.3 Đƣờng kính sinh trƣởng hệ sợ nấm Cordyceps 31 militaris điều kiện nhiệt độ khác Bảng 3.4 Đƣờng kính sinh trƣởng hệ sợ nấm Cordyceps 33 militaris điều kiện độ ẩm khác Bảng 3.5 Đƣờng kinh sinh trƣởng hệ sợ nấm Cordyceps 35 militaris điều kiện pH khác Bảng 3.6 Đƣờng kính sinh trƣởng hệ sợ nấm Cordyceps 38 militaris số môi trƣờng dinh dƣỡng giai đoạn tạo ƣơm sợi Bảng 3.7 Sự sinh trƣởng hệ sợ nấm Cordyceps militaris 40 phƣơng thức cấy Bảng 3.8 Tỉ lệ giống chết nhiễm nấm mốc phƣơng 40 thức cấy Bảng 3.9 Sự hình thành phát triển thể nấm Cordyceps 41 militaris điều kiện nhiệt độ khác 10 Bảng 3.10 Sự hình thành phát triển thể nấm 44 Cordyceps militaris điều kiện độ ẩm khác 11 Bảng 3.11 Sự hình thành phát triển thể nấm 47 Cordyceps militaris điều kiện chiếu sáng khác Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Hình 1.2 Đông trùng hạ thảo nuôi cấy Viện Khoa học Lâm 17 nghiệp Việt Nam Hình 1.3 Đông trùng hạ thảo nuôi cấy Trung tâm Nghiên cứu 18 thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng Hình 3.1 Hệ sợ nấm Cordyceps militaris số môi trƣờng 26 Hình 3.2 Biểu đồ thể sinh trƣởng hệ sợ nấm 28 Cordyceps militaris môi trƣờng PDA, MYPS, YMA Sabouraud Hình 3.3 Biểu đồ thể sinh trƣởng hệ sợ nấm 30 Cordyceps militaris môi trƣờng PDA có bổ sung dinh dƣỡng khác Hình 3.4 Biểu đồ thể sinh trƣởng hệ sợ nấm 32 Cordyceps militaris điều kiện nhiệt độ khác Hình 3.5 Biểu đồ thể sinh trƣởng hệ sợ nấm 34 Cordyceps militaris điều kiện độ ẩm khác Hình 3.6 Biểu đồ thể sinh trƣởng hệ sợ nấm 36 Cordyceps militaris điều kiện pH khác 10 Hình 3.7 Biểu đồ thể sinh trƣởng hệ sợ nấm 38 Cordyceps militaris số môi trƣờng dinh dƣỡng giai đoạn tạo ƣơm sợi Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix 11 Hình 3.8 Biểu đồ thể phát triển thể nấm 42 Cordyceps militaris điều kiện nhiệt độ khác 12 Hình 3.9 Quả thể nấm Cordyceps militaris sau 60 ngày nuôi cấy 43 điều kiện nhiệt độ khác 13 Hình 3.10 Biểu đồ thể phát triển thể nấm 45 Cordyceps militaris điều kiện độ ẩm khác 14 Hình 3.11 Quả thể nấm Cordyceps militaris sau 60 ngày nuôi 46 cấy điều kiện độ ẩm độ khác 15 Hình 3.12 Biểu đồ thể phát triển thể nấm 48 Cordyceps militaris điều kiện chiếu sáng khác 16 Hình 3.13 Quả thể nấm Cordyceps militaris sau 60 ngày nuôi 49 cấy điều kiện tối ƣu Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ [...]... nghiên cứu 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự ảnh hƣởng của một số yếu tố lên sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống - Phƣơng pháp bảo quản và chuẩn bị chủng giống Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris TS06 đƣợc bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở 4oC để phục vụ nghiên cứu Lấy một vòng que cấy sinh khối nấm Cordyceps militaris trong ống thạch... hƣởng của các yếu tố khác đến sự sinh trƣởng của sợi nấm ở điều kiện nhiệt độ 200C 3.1.4 Sự ảnh hƣởng của độ ẩm lên sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris Độ ẩm là một nhân tố rất quan trọng có ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng của nấm Để xác định sự ảnh hƣởng của độ ẩm không khí đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống, chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm. .. ẩm, ánh sáng Xác định sự sinh trƣởng của hệ sợi thông qua việc đo đƣờng kính tản nấm sau 5, 10, 15, 20 ngày Đồng thời xác định tỉ lệ lọ cấy giống bị nhiễm 2.4.3 Phƣơng pháp nghiên cứu sự ảnh hƣởng của một số yếu tố lên sự hình thành phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris - Phƣơng pháp nghiên cứu sự ảnh hƣởng của nhiệt độ Xác định yếu tố nhiệt độ là yếu tố quan trong ảnh hƣởng tới việc hình thành... sinh trƣởng tốt nhất ở độ ẩm 80% Kết quả nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với kết quả đã công bố của Phạm Quang Thu và cs (2011) [6] Từ kết quả này, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu xác định sự ảnh hƣởng của các yếu tố khác đến sự sinh trƣởng của sợi nấm ở điều kiện độ ẩm 80% 3.1.5 Sự ảnh hƣởng của pH môi trƣờng lên sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris Để xác định sự ảnh hƣởng của pH môi... sinh trƣởng của khuẩn lạc sau 5, 10, 15, 20 ngày - Phƣơng pháp nghiên cứu sự ảnh hƣởng của pH môi trƣờng pH là một trong các nhân tố ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp một số chất của vi sinh vật Vì vậy, nghiên cứu ảnh hƣởng của pH tới quá trình sinh trƣởng của Cordyceps militaris là cần thiết Thí nghiệm nuôi cấy nấm trong các thang pH khác nhau: 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5 Số. .. đƣợc về nguồn dƣợc liệu quý hiếm này đều chỉ dừng lại ở việc phát hiện các chủng của đông trùng hạ thảo sẵn có trong tự nhiên Một trong số ít các nghiên cứu về tác dụng của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam là nghiên cứu của Đái Duy Ban và cs Theo nghiên cứu của tác giả Đái Duy Ban và cs thì đông trùng hạ thảo là một loại dƣợc liệu quý hiếm, có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh virus, ung thƣ,... tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam và trên thế giới 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps trên thế giới Các nghiên cứu trên thế giới đã hoàn toàn chứng minh đƣợc công dụng vƣợt trội của nấm đông trùng hạ thảo là một nguồn dƣợc liệu quý Vì vậy, việc nuôi trồng loài nấm quý hiếm này đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ quy... cho việc nghiên cứu lựa chọn giá thể nhân tạo thích hợp để nuôi trồng quả thể nấm Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi tiếp tục lựa chọn môi trƣờng P55 làm môi trƣờng cấy nấm để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 3.1.3 Sự ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris Để xác định sự ảnh hƣởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris. .. cấy nấm Cordyceps militaris bằng phƣơng pháp cấy điểm trên môi trƣờng có thang pH khác nhau, cùng điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng Xác định sự sinh trƣởng của hệ sợi thông qua việc đo đƣờng kính sinh trƣởng của khuẩn lạc sau 5, 10, 15, 20 ngày 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu sự ảnh hƣởng của một số yếu tố lên sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn ƣơm sợi - Phƣơng pháp nghiên. .. chƣa có hệ thống Một số ít các nghiên cứu đƣợc tiến hành nhƣng cũng chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về sự sinh trƣởng của hệ sợi hoặc nghiên cứu tạo quả thể ở mức độ thử nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 17 Phạm Quang Thu và cs (2011) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết các chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) ... việc phát chủng đông trùng hạ thảo sẵn có tự nhiên Một số tiến hành nghiên cứu sâu đặc tính sinh lý đông trùng hạ thảo dừng lại mức độ thử nghiệm Nhìn chung nghiên cứu đông trùng hạ thảo Việt Nam... Nam nghiên cứu nuôi trồng thể nấm đông trùng hạ thảo giá thể nhân tạo số loại nhƣ đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) đông trùng hạ thảo bọ xít (Cordyceps nutans) [7] A B Hình 1.2 Đông trùng. .. nhà nghiên cứu Việt Nam có đƣợc nguồn dƣợc liệu quý dừng lại việc phát chủng đông trùng hạ thảo sẵn có tự nhiên Một số nghiên cứu tác dụng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps Việt Nam nghiên cứu