Tối ưu các điều kiện nhân giống cấp 1 nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris

Xuất phát từ thực tiễn đó, cũng như góp phần vào nghiên cứu môi trường nuôi cấy Đông trùng hạ thảo tại Việt Nam tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Tối ưu các điều kiện nhân giống cấp 1 nấ

NGUYỄN MẠNH CƯỜNG

Tên đề tài:

TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG CẤP 1 NẤM

ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Thái Nguyên, năm 2016

NGUYỄN MẠNH CƯỜNG

Tên đề tài:

TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG CẤP 1 NẤM

ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP

Lớp : K44 - CNSH Khóa học : 2011 - 2015

Giảng viên hướng dẫn: 1 TS Dương Văn Cường

: 2 ThS Bùi Tuấn Hà Khoa CNSH-CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2016

Lời cảm ơn

Trong suốt quá trình thực tập tại Phòng nghiên cứu và sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo - Viện Khoa Học Sự Sống - Đại học Thái Nguyên, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa CNSH - CNTP, thầy

cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Cường, ThS Bùi Tuấn Hà giảng viên Khoa CNSH - CNTP, đã hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khoá luận này

Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Ma Thị Trang, KS Vũ Hoài Nam người đã hướng dẫn em một số thao tác thực hành và vận hành thiết bị giúp

em hoàn thành tốt khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khoá luận này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người

đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái nguyên, tháng 05 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Mạnh Cường

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Một số tên gọi của nấm Cordyceps militaris 6

Bảng 2.2 Hợp chất axit nucleic thu được từ nấm Cordyceps militaris 10

Một số hoạt chất quan trọng mang giá trị dược liệu 11

Tổng hợp một số công dụng chính của nấm Cordyceps militaris 14

Bảng 4.1 Đường kính sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris trên các môi trường PDA và CB 29

Bảng 4.2 Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris ở các môi trường có bổ sung nhộng tằm với tỷ lệ khác nhau 33

Bảng 4.3 Đường kính sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 37

Bảng 4.4 Đường kính sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các điều kiện pH khác nhau 40

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Nấm Codyceps militaris 5 Hình 2.2 Sự phân bố của nấm Cordyceps militaris 7 Hình 4.1 Nấm Cordyceps militaris phát triển trên một số môi trường cơ bản 28 Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris

trên môi trường PDA và CB 31

Hình 4.3 Sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường

PDA và CB sau 25 ngày nuôi cấy 32

Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris

ở các môi trường có bổ sung nhộng tằm với tỷ lệ khác nhau 34

Hình 4.5 Sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên môi trường PDA

và môi trường P10 sau 25 ngày nuôi cấy 36

Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris

ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 38

Hình 4.7 Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên hai điều kiện

nhiệt độ khác nhau trong 25 ngày 39

Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris

ở các điều kiện pH khác nhau 41

Hình 4.9 Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường

có pH lần lượt là 5,6 42

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

CB :Môi trường dinh dưỡng gồm (Glucose,

Yeast, Peptone, Sucrose)

C sinensis :Cordyceps sinensis

ĐTHT :Đông trùng hạ thảo

H sinensis : Hirsutella sinensis

O sinensis : Ophiocordyceps sinensis

PDA :Potato Dextrose Agar Spp : species pluriel

T armoricanus : Thitarodes armoricanus

MỤC LỤC

Trang

Phần 1 Mở đầu 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 TổNG QUAN TÀI LIệU 4

2.1 Cơ sở khoa học 4

2.1.1 Tên gọi Đông trùng hạ Thảo 4

2.1.2 Nấm Cordycep militaris 5

2.2 Giá trị dược liệu của nấm 9

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

2.3.2 Tình hình Nghiên cứu trong nước 18

Phần 3 ĐốI TƯợNG, NộI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU 21

3.1 Đối tượng (vật liệu) 21

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 21

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 21

3.2.1 Địa điểm 21

3.2.2 Thời gian tiến hành 22

3.3 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 22

3.4.1 Những môi trường cơ bản được sử dụng 22

3.4.2 Phương pháp tiến hành 23

3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi, phương pháp thu thập và xử lý số liệu 26

Phần 4 KếT QUả NGHIÊN CứU VÀ THảO LUậN 28

4.1 Kết quả nghiên cứu sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên môi trường cơ bản để xác định môi trường tối ưu 28

4.2 Kết quả Nghiên cứu ảnh hưởng của Nhộng tằm đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris 33

4.3 Kết quả Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris 37

4.4 Kết quả Nghiên cứu ảnh hưởng của pH bước đầu đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris 40

Phần 5 KếT LUậN VÀ Đề NGHị 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

Phần 1

Mở ĐầU 1.1 Đặt vấn đề

Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) có bản chất là loài nấm ký sinh trên nhộng hoặc ấu trùng của một số loài côn trùng Nấm được gọi là Đông trùng hạ thảo bởi quá trình sinh trưởng và phát triển trong tự nhiên của chúng Vào mùa đông, bào tử nấm xâm nhiễm, ký sinh vào cơ thể ấu trùng sống trong lòng đất Đến mùa hè, khi nhiệt độ và độ ẩm tăng lên đạt đến điều kiện thích hợp, hệ sợi nấm phát triển sử dụng chất dinh dưỡng trong sâu và hình thành quả thể nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Đông trùng hạ thảo là dược liệu quý hiếm, được sử dụng hơn 2000 năm trong y học cổ truyền Trung Quốc [23]

Đã có nhiều bài báo khoa học chứng nhận được trong quả thể nấm có chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học cao như : Cordycepin, Adenosine, Polysaccharide, Mannitol, … [12] Cordycepin (3’-deoxyadenosine) là một chất tương tự nucleoside có các hoạt tính sinh học bao gồm kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, hoạt động kháng virus [5],[39] Ngoài ra, Cordycepin còn có tiềm năng điều trị ung thư và u ác tính [12] Adenosine có nhiều tác dụng dược lý, nó có thể điều trị suy tim mãn tính Hơn nữa, đã có nghiên cứu chỉ ra rằng adenosine có tác dụng ức chế các bệnh về thần kinh, trong đó bao gồm quy định của giấc ngủ, mức độ hưng phấn, giảm đau [33] Mannitol được sử dụng như một loại thuốc lợi tiểu, chống các chứng ho ra máu [23] ĐTHT còn có chứa nhiều loại vitamin (trong 100g ĐTHT có 0,12g vitamin B12; 29,19mg vitamin A; 116,03mg vitamin C; vitamin B2; vitamin E; vitamin K…), ngoài ra còn có khoảng 25 – 30 % protein

Trên thế giới các nhà khoa học đã nghiên cứu nấm ĐTHT từ sớm Những hợp chất quý có trong nấm được nghiên cứu kĩ hơn để sử dụng cho mục đích y học Lượng nấm thu hoạch ngoài thiên nhiên mỗi năm không nhiều, chưa đủ đáp ứng nhu cầu thị trường nên việc nghiên cứu để nuôi trồng nhân tạo rất được quan tâm Với nền khoa học công nghệ phát triển, nhiều nước đã nuôi trồng thành công nấm trên chất nền rắn và áp dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp

Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm ĐTHT còn hạn chế Các công trình đã được công bố về loài nấm dược liệu quý này mới chỉ dừng lại ở việc phát hiện một số chủng có trong tự nhiên Để nuôi trồng nhân tạo thành công nấm ĐTHT, cần phải có một chủng giống tốt và môi trường thích hợp để nhân nuôi hệ sợi Hiện nay, các tài liệu nghiên cứu về giai đoạn này còn khá hạn chế Hơn nữa, đây cũng là bước quan trọng có sự ảnh hưởng trực tiếp tới sự thành công của quá trình nuôi trồng nhân tạo nấm

Xuất phát từ thực tiễn đó, cũng như góp phần vào nghiên cứu môi trường nuôi cấy Đông trùng hạ thảo tại Việt Nam tôi tiến hành thực hiện đề

tài : “Tối ưu các điều kiện nhân giống cấp 1 nấm Đông trùng hạ thảo

- Xác định được ảnh hưởng của nhộng tằm đến quá trình nuôi nấm

Cordyceps militaris trong giai đoạn phát triển hệ sợi

- Xác định được nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm Cordyceps militaris sinh trưởng và phát triển

- Xác định được giá trị pH thích hợp nhất cho nấm Cordyceps militaris

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả tối ưu các điều kiện nhân giống cấp 1 nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris sẽ là căn cứ khoa học giúp cho việc hoàn thiện quy trình

sản xuất nấm phục vụ đời sống Ngoài ra cũng làm cơ sở cho các nghiên cứu chuyên hơn về loại nấm dược liệu quý này

Phần 2

TổNG QUAN TÀI LIệU 2.1 Cơ sở khoa học

2.1.1 Tên gọi Đông trùng hạ Thảo

“Dong Chong Xia Cao” (Đông trùng hạ thảo) là tên gọi của loài nấm Ophiocordyceps sinensis ký sinh trên ấu trùng của loài bọ cánh phấn Trong y học của Tây Tạng loài nấm này có tên là "yartsa gunbu", còn trong y học Trung Quốc có tên là “Dong Chong Xia Cao” (mùa Đông là sâu, mùa hè là cỏ) Đông trùng hạ thảo là một phương thuốc đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc trong hơn 700 năm [26]

Ngoài ra, tên gọi “Dong Chong Xia Cao” còn được công nhận với ý nghĩa rộng hơn ở Trung Quốc như sau [26] :

- Các loại dược liệu có nguồn gốc từ O sinensis (syn C sinensis)

- Thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ O sinensis

- Các loại nấm O sinensis

- Các loại nấm Cordyceps spp

- Các loại nấm Ophiocordyceps spp

- Các loại dược liệu thiên nhiên có quả thể mọc ra từ sâu bướm

- Các sợi nấm của O sinensis có nguồn gốc từ nuôi cấy

- Các sợi nấm của H sinensis có nguồn gốc từ nuôi cấy

- Các loại dược liệu cổ truyền có nguồn gốc từ ấu trùng của hepialidae

(Lepidoptera) bị ký sinh bởi O sinensis

- Các loại dược liệu cổ truyền có nguồn gốc từ ấu trùng của thitarodes

(syn Hepialus) bị ký sinh bởi O sinensis

- Các loại dược liệu cổ truyền có nguồn gốc từ ấu trùng của T

armoricanus (syn H armoricanus) bị ký sinh bởi O sinensis

- Các loại dược liệu cổ truyền có nguồn gốc từ ấu trùng của hepialidae

(Lepidoptera) bị ký sinh bởi Ophiocordyceps spp

- Các loại dược liệu cổ truyền có nguồn gốc từ ấu trùng của hepialidae

(Lepidoptera) bị ký sinh bởi Cordyceps spp

2.1.2 Nấm Cordycep militaris

Nấm Cordyceps militaris một trong những loài được biết đến nhiều nhất

của chi Cordyceps s.l [14]

Hình 2.1: Nấm Codyceps Militaris [14]

Phân ngành :Ascomycotina Lớp :Ascomycetes/Pyrenomycetes

Loài :Cordyceps militaris

Dưới đây là tên thường gọi của nấm Cordyceps militaris [14] :

Quả thể

Ký chủ

Bảng 2.1: Một số tên gọi của nấm Cordyceps militaris

Tên thường gặp Caterpillar fungus, Cordyceps, Cetepiller

mushroom Tên

Latin/English

Cordyceps militaris, Cordyceps mushroom, Deer fungus, Caterpillar fungus

Tên Trung Quốc Dong Chong Xia Cao, Summer grass-winter

worm, Hia tsao tong tchong Tên Nhật Bản Tochukaso/Tochukasu, Totsu kasu

Tên Hàn Quốc Tong ch'ug ha ch'o

Tên Nepal Yarsagumba, Jeebanbuti, Sanjivani, Kiraghans

Tên Tiberian Yarchakunbu

Một số tên gọi

khác

Chong cao, Dong chong cao, Aweto

Ký chủ phổ biến nhất của nó trong tự nhiên bao gồm ấu trùng của bọ cánh phấn (sâu bướm) và nhộng, có thể ký sinh lên ấu trùng của bọ cánh cứng, bộ cánh màng và cả côn trùng nhỏ

Ký chủ bọ cánh phấn của Cordyceps militaris thuộc các họ khác nhau

gồm [30] :

Scarabaeidae, Scolytidae, Tenebrionidae, Tipulidae, Cimbicidae,

Lasiocampidae, Lymantriidae, Noctuidae, Notodontidae, Saturniidae, Sphingidae, Thyatiridae

 Sự phân bố của nấm Cordyceps militaris

Cordyceps militaris ngoài thiên nhiên ký sinh trên ấu trùng hoặc nhộng

của các loài côn trùng cánh phấn Mặc dù chi này có phân bố trên toàn thế

giới, nhưng Cordyceps militaris được phân bố chủ yếu ở các nước Đông Á,

như Trung Quốc, Nhật Bản và bán đảo Triều Tiên [12]

Hình 2.2: Sự phân bố của nấm Cordyceps militaris

 Cơ chế xâm nhiễm

Vào mùa đông, nấm bắt đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non vì

ăn hết chất dinh dưỡng của chúng Những con sâu này có thể đã ăn phải bào

tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu Đến một giai đoạn nhất định thường là vào mùa hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra khỏi sâu như một ngọn cỏ và vươn lên khỏi mặt đất phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát

tán bào tử Các bào tử nấm sống bên trong ấu trùng và phát triển Nấm sẽ tạo

ra chất nền, từ đó mọc lên quả thể Quả thể có dạng màu cam, gắn không chắc chắn trên cơ thể ký chủ Những quả thể sẽ phát triển đến một độ dài khoảng 2-8 cm và có chiều rộng khoảng 0,5 cm [12]

 Sơ lược nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris

Đông trùng hạ thảo là một loại nấm dược liệu truyền thống nổi tiếng của Trung Quốc Các loài Cordyceps là một nguồn tài nguyên rất đa dạng và phong phú của tự nhiên với những hoạt tính sinh học hữu ích [14] Một số loài Cordyceps từ lâu đã được sử dụng cho mục đích y tế ở Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc và các nước Đông Á khác vì nhiều hoạt tính sinh học

và dược lý của chúng mà thường là do sự hiện diện của các thành phần có hoạt tính sinh học quan trọng như adenosine, cordycepin và exopolysaccharides (EPS) [16] Loài Cordyceps được sử dụng cho mục đích

y học cổ truyền Trung Quốc chủ yếu là hai loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris

Loài được biết đến tốt nhất của chi là Cordyceps sinensis Nó đã được

sử dụng trong y học cho hơn 2000 năm ở Trung Quốc [23],[25] Loại nấm này sống chủ yếu ở vùng cao nguyên như Tứ Xuyên ở Trung Quốc, hoặc

Vân Nam ở Tây Tạng, ở độ cao giữa 3000 đến 4000 m [6] Cordyceps sinensis có thể tổng hợp nhiều loại hoạt chất sinh lý như adenosine,

cordycepin và polysaccharides [16],[19] Đã có nghiên cứu chỉ ra hơn 30

hoạt tính của nấm Cordyceps sinensis bao gồm: điều hòa miễn dịch, ức chế

miễn dịch, kháng độc tố, kháng u, chống viêm, chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, bảo vệ gan, bổ thận, ổn định đường huyết, giảm cholesterol, ngăn ngừa sơ vữa động mạch, hạ huyết áp và làm giảm áp suất máu, bổ phổi, ngăn chặn ảnh hưởng của các gốc tự do, chống trầm cảm, ngăn ngừa loãng xương,

chống lại chứng thiếu máu não cục bộ, chống mệt mỏi, điều trị hen suyễn, tạo hồng cầu, ổn định nhịp tim, chống lão hóa, tăng cường testosterone, an thần, ngăn ngừa và điều trị các tổn thương ruột, nâng cao thể lực và tăng độ bền bỉ, cải thiện trí, ngăn chặn đào thải tế bào, và làm giảm bớt bệnh lupus [26]

So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris dễ dàng nuôi hơn trong

cả môi trường rắn và chất lỏng với nguồn dinh dưỡng nhiều carbon và nguồn

nitơ Cordyceps militaris cũng đã được sử dụng trong y học cổ truyền của Trung Quốc trong một thời gian dài Gần đây, Cordyceps militaris ngày càng được xem như là một nguồn thay thế cho Cordyceps sinensis vì các chất có

hoạt tính sinh học và tính chất dược liệu tương tự nhau [15],[17],[37] Hơn

nữa, nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh rằng Cordyceps militaris chứa

nhiều loại thành phần có hoạt tính như cordycepin, ergosterol, mannitol và polysaccharides, và thể hiện các chức năng dược lý Nó bây giờ đã được sử dụng cho nhiều mục đích y tế do các hoạt động sinh lý khác nhau [14],[16],[29]

Khoa học phát triển, ngày nay loài người đã phát hiện hàng trăm loài nấm Đông trùng hạ thảo trên 6 lục địa ở các điều kiện sống rất khác nhau nhưng đều có những giá trị dược liệu tương tự Chi nấm Cordyceps đã được thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại truyền thống các loài này được xếp vào họ Clavicipitaceae [31]

2.2 Giá trị dược liệu của nấm

Cordyceps militaris là loại nấm dược liệu mọc lên từ cơ thể của các loài

côn trùng cánh phấn Quả thể nấm có màu cam đặc trưng và chứa rất nhiều những hoạt chất quý giá Đã có rất nhiều nhà nghiên cứu phân tích được một

số thành phần các hoạt chất có trong nấm Cordyceps militaris như cordycepin

(3'-deoxyadenosine), ergothioneine, ergosterol, D-mannitol, γ-aminobutyric

acid (GABA), và polysaccharides Do có nhiều hoạt tính hữu ích nên đã được

sử dụng cho nhiều mục đích y học [12] Đến nay, hơn 10 nucleoside và các thành phần liên quan của nó (bao gồm adenine, adenosine, cytidine, cytosine, guanine, guanosine, uracil, uridine, hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine, 2` deoxyuridine, 2`-deoxyadenosine, cordycepin N6-methyladenosine, và 6-hydroxyethyl-adenosine) đã được xác định và tách chiết [12] Dưới đây là bảng phân tích một số axit nucleic thu được từ nấm

Cordyceps militaris [14]

Bảng 2.2: Hợp chất axit nucleic thu được từ nấm Cordyceps militaris

Nội dung Trích xuất từ sợi nấm

(mg)

Phần lọc của môi trường (mg)

Cordycepin có công thức (3'-deoxyadenosine, C10H13N5O3, nhiệt độ nóng chảy 225°C), một chất tương tự nucleoside [6], được coi như một loại kháng sinh axit nucleic có thể kìm hãm sự hình thành tế bào ung thư của các

tế bào góp phần vào sự bình thường của các tế bào ung thư là một trong những thành phần của DNA [13] Ngoài ra còn có hoạt tính kháng khuẩn [5]

Cordycepin (3′-deoxyadenosine) Adenosine

- Adenosine (C 10 H 13 N 5 O 4 )

Nucleotides (bao gồm adenosine, uridine, cytidine, uracil và guanosine) là

các thành phần quan trọng trong Cordyceps militaris [21]

Adenosine có nhiều tác dụng dược lý, nó có thể điều trị suy tim mãn tính

và ức chế sự dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ương Các nucleosides khác cũng có thể được sử dụng để điều trị nhiều bệnh khác nhau

Ví dụ, Ribeiro (1995) thấy rằng adenosine ức chế sự dẫn truyền hệ thần kinh kích thích Dunwiddie & Masino (2001) nhận thấy rằng adenosine là một bộ điều biến có tác dụng ức chế và tổng hợp về hoạt động thần kinh, trong đó bao gồm quy định của giấc ngủ và mức độ hưng phấn, rối loạn thần kinh, quy định về giữ tính nhạy cảm, vận động, giảm đau, điều hòa những tác động của ethanol và chất gây nghiện Tabrizchi & Bedi (2001) xem xét các đặc tính của phân nhóm của các thụ thể adenosine trong mạch máu, cũng như ảnh hưởng của các thụ thể adenosine trên hệ tuần hoàn ngoại biên Carlezon et al (2005) nhận thấy rằng cytidine có tác dụng chống trầm cảm giống như trong các thử nghiệm bơi ở chuột [12]

- Cordycepic acid (D-mannitol)(C 6 H 14 O 6 )

Cordycepic acid, một chất đồng phân của axit quinic, là một trong những thành phần dược phẩm chính hoạt động Cordycepic acid đã được xác định là D-mannitol Mannitol là một chế phẩm sinh học với hoạt động sinh học quan trọng Hàm lượng của mannitol trong loài Cordyceps thay đổi theo môi trường sống Nghiên cứu cho thấy, có khoảng 25-80 mg/g ở trong quả thể nấm [9],[24]

- Polysaccharides

Một số polysaccharides và đường khác đã được xác định có trong chiết

xuất Cordyceps militaris và các hoạt động dược lý của chúng đã được nghiên

cứu Những polysaccharides có hiệu quả trong việc điều chỉnh lượng đường

trong máu, ngăn ngừa di căn, chống ung thƣ cũng nhƣ bảo vệ gan và tác dụng

và để ngăn chặn hội chứng mạch vành cấp tính và bệnh xơ vữa động mạch [4]

- GABA

GABA là một trong những chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong hệ thống thần kinh trung ƣơng và ức chế dẫn truyền thần kinh giao cảm ngoại biên Một vai trò quan trọng đối với GABA ở cả điều khiển hệ thống thần kinh trung ƣơng và ngoại vi đến huyết áp đã đƣợc chứng minh [32]

GABA cũng có vai trò miễn dịch khuếch đại trong các bệnh viêm thần kinh chẳng hạn nhƣ bệnh đa xơ cứng [8]

Tuy nhiên, ergothioneine là hầu như chỉ được sản xuất bởi nấm và một số sinh vật nhân sơ [7] Ergothioneine chỉ có thể được hấp thụ từ chế độ ăn uống

và không thể tự sinh tổng hợp được ở người

Tổng hợp một số công dụng chính của nấm Cordyceps militaris

Cordyceps militaris là nguồn dược liệu giàu tiềm năng sinh học do chứa

các chất chuyển hóa cho nhiều loại thuốc và có những ghi chép về các ứng dụng của nó đối với sự phục hồi của các cơ quan trong cơ thể Một số những

hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps militaris đã được tổng hợp lại như sau

[14] :

- Cải thiện chức năng tình dục,

- Chống viêm,

- Chống oxy hóa/chống lão hóa,

- Kháng khối u/ kháng ung thu/ điều trị bệnh bạch cầu,

- Ngăn sự phát triển của các khối u,

- Hạ lipid trong máu,

- Ức chế quá trình tạo mạch (giúp ngăn ngừa di căn),

- Chống đái tháo đường,

- Chống lại HIV,

- Chống lại bệnh sốt rét,

- Chống mệt mỏi,

- Bảo vệ hệ thần kinh,

- Hỗ trợ bảo vệ gan,

- Hỗ trợ bảo vệ thận,

- Hỗ trợ bảo vệ phổi

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu nấm Cordyceps militaris được các

nhà nghiên cứu khá quan tâm và đạt được rất nhiều thành tựu Những công

trình nghiên cứu về nấm Cordyceps militaris được công bố ngày càng nhiều

Ngoài việc nghiên cứu về các thành phần hoạt chất có trong nấm thì việc nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm nhân tạo rất được quan tâm Ngày nay,

khi lượng Cordyceps militaris ngoài thiên nhiên là rất khan hiếm và bị ngăn cấm thu hoạch thì việc trồng nhân tạo nấm Cordyceps militaris để thu sinh

khối được thức hiện như là một giải pháp thay thế Tuy nhiên, các chủng nấm

Cordyceps militaris phân lập từ các nơi khác nhau sẽ phát triển trên các môi

trường có thành phần tỉ lệ dưỡng chất cũng như sản sinh các hoạt chất khác

nhau Ví dụ như thể quả của nấm Cordyceps militaris có hình dạng, kích

thước và màu sắc khá khác nhau khi được nuôi bởi các chủng khác nhau Đã

có nhiều nghiên cứu tối ưu các môi trường cũng như sử dụng các chủng đột biến để sản xuất ra các hoạt chất mong muốn Sau đây là một số lĩnh vực đã được các nhà nghiên cứu trên thế giới thực hiện

 Một số nghiên cứu về quá trình nuôi cấy nấm Cordyceps militaris + Nuôi trên môi trường rắn:

Như chúng ta đã biết, phương pháp sử dụng môi trường rắn đã được biết đến từ lâu về trước So với những phương pháp khác thì nó có rất nhiều ưu điểm như : chi phí thấp, hiệu quả, sử dụng lượng nước ít, giảm được chi phí

sử lí nước thải và tiêu thụ năng lượng thấp Trong tự nhiên, nấm Cordyceps

militaris phát triển trên cơ thể ấu trùng dưới điều kiện thông thoáng Do đó,

khi nuôi trên môi trường rắn thì điều kiện khá thích hợp, sợi nấm có thể lan rộng trên bề mặt của môi trường rắn, trong đó không khí có thể lưu thông giữa quả thể của nấm Hơn nữa các báo cáo trước đây đã chứng minh rằng trên quả thể của nấm có chứa nhiều các hoạt tính sinh học hơn trong các sợi nấm [12] Do đó, môi trường rắn đã được tập trung nghiên cứu và được coi như một công nghệ đầy hứa hẹn cho việc nuôi trồng để sản xuất quả thể nấm

Cordyceps militaris Trong 20 năm qua, các nhà nghiên cứu đã tìm cách trồng

nấm trên môi trường rắn Trong ống nghiệm, quả thể nấm đã được trồng thành công trên môi trường có giá thể là gạo lứt (Choi et al, 1999; Sung et al., 2002) [12] Tuy nhiên, việc sản xuất quả thể nấm không được ổn định đã trở thành một vấn đề quan trọng đối với việc khai thác quy mô lớn các hợp chất

sinh học có hoạt tính từ trong nấm Cordyceps militaris Để khắc phục vấn đề

này, bào tử hữu tính đã được tìm thấy bằng cách cấy các chủng đơn bào tử vào trong môi trường nhộng gạo Mặc dù công nghệ này đã cải thiện đáng kể chất lượng quả thể nhưng lại không phù hợp với người nông dân, vì công nghệ này đòi hỏi phải có một số kiến thức cơ bản về di truyền nấm cũng như cần phải có một phòng thí nghiệm cơ bản Hiện nay, đã có một số nước nghiên cứu thành công quá trình nuôi cấy nấm và tối ưu hóa các điều kiện để

có thể tạo ra nồng độ các hoạt chất cao như:

- Năm 2012, tại Malaysia, các nhà khoa học gồm LekTeng Lim, ChiaYen Lee, & EngThuan Chang đã tiến hành nghiên cứu: Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy nấm trên môi trường rắn để sản xuất Adenosine,

Cordycepin, và D-mannitol trong quả thể của nấm dược liệu Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link (Ascomycetes) [22]

- Năm 2013 Tang Jiapeng, Liu Yiting, and Zhu Li [40] ba nhà khoa học Trung Quốc đã thực hiện đề tài tối ưu hóa quá trình lên men và tinh chế

codycepin từ Cordyceps militaris Kết quả thu được là chọn được môi trường

nuôi cấy tối ưu với thành phần là: glucose, 60 g/L; KH2PO4, 0,7 g/L; MgSO4 7H2O, 0,7 g/L; cao nấm men, 9.00 g/L; và tryptone, 17.10 g/L Điều kiện nuôi cấy tối ưu là: nhiệt độ trung bình, 27.1oC; tuổi giống, 3 ngày; và kích thước giống , 10%, làm tăng 2,5 lần (7,35 g/L) so với việc sử dụng các môi trường

và điều kiện sản xuất cordycepin ban đầu Ngoài ra, kết quả còn cho thấy cordycepin tinh khiết có thể gây ra sự chết tế bào của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt RM-1 ở chuột

+ Nuôi trên môi trường lỏng:

- Không chỉ nghiên cứu các môi trường trên giá thể, các nhà khoa học gồm Chao Kang, Ting-Chi Wen, Ji-Chuan Kang, Ze-Bing Meng, Guang-Rong Li, and Kevin D Hyde đã nghiên cứu để tối ưu hóa các điều kiện để sản xuất codycepin trong môi trường lỏng ở qui mô công nghiệp năm 2014 [18]

 Một số nghiên cứu về hoạt tính nấm

- Năm 2005 Hoạt động kháng viêm và chống oxy hóa của nấm đã được

nghiên cứu [35] Chiết xuất của nấm Cordyceps militaris đã được sử dụng để

nghiên cứu hoạt tính Kết quả, chiết xuất có khả năng ngăn chặn các gốc tự do cho thấy khả năng chống oxy hóa Ngoài ra, nó còn được đánh giá khả năng kháng viêm

- Năm 2013 K.J Patel , R.S Ingalhalli tại Ấn Độ đã nghiên cứu được một

số giá trị của nấm Cordyceps militaris như: kháng khuẩn, ngăn ngừa ung thư,

hoạt động chống oxy hóa, cải thiện sản xuất tinh trùng, ngăn chặn hoạt động của virus cúm, kháng nấm, kháng Clostridium (trực khuẩn), ngăn chặn biểu hiện của bệnh tiểu đường và điều hòa gen [27]

- Năm 2010, Jiang và cộng sự đã có nghiên cứu về một số hoạt chất trong nấm như adenosine, iso-sinensetin và dimethyl guanosine với chất chống oxy hóa và đăc biệt là khả năng úc chế hoạt động của HIV-1 protease

- Ngoài ra, nó cũng rất quan trọng để nghiên cứu sự biến đổi gen giữa

các dòng Cordyceps militaris Trong 12 năm qua, các nhà nghiên cứu đang quan tâm đến việc điều tra các đặc tính di truyền của nấm Cordyceps militaris Biến dị di truyền của Cordyceps militaris từ 11 địa điểm ở Hàn

Quốc đã được phân tích bởi phương pháp đa hình khuếch đại đoạn ngẫu nhiên DNA và không tìm thấy bất kỳ mối liên hệ giữa sự biến đổi gen và các khu vực địa lý Hơn nữa, các đoạn gen vùng ITS đã được sử dụng thành công như một gen chỉ thị để nghiên cứu phát sinh loài và đa dạng di truyền giữa các loài

Cordyceps [14] Ngoài ra, sự biến dị di truyền của Cordyceps militaris từ các khu vực khác nhau, bao gồm các chủng Cordyceps militaris tự nhiên, chủng

sử dụng cho sản xuất công nghiệp, chủng nuôi cấy nhân tạo cũng được phân

tích trình tự vùng ITS Kết quả cho thấy sự biến đổi gen của Cordyceps militaris từ Anh, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Na Uy là cực nhỏ và

không tương quan với nguồn gốc địa lý Sản xuất công nghiệp không ảnh

hưởng đến sự ổn định di truyền của Cordyceps militaris [34] Là một trong những loại nấm dược liệu quý giá nhất, Cordyceps militaris có nhiều ứng

dụng trong y tế Đây vẫn sẽ là vấn đề quan trọng và sẽ được nghiên cứu trong nhiều năm tới

2.3.2 Tình hình Nghiên cứu trong nước

Nước ta là một nước đi sau về nghiên cứu nấm Cordyceps militaris nên

những thành tự đạt được còn khá hạn chế Nghiên cứu đạt được chủ yếu là điều tra, phát hiện và thu thập một số chủng Cordyceps có mặt trong điều kiện nước ta Đã có nhiều phát hiện và điều tra trong nước được công bố, đặc biệt còn có một số chủng lần đầu tiên được mô tả và ghi nhận phân bố tại việt nam Năm 2009, Phạm Quang Thu và cộng sự đã tiến hành điều tra và phát hiện nấm ở một số vườn quốc gia sau:

- Tại vườn quốc gia Hoàng liên, tỉnh Lào cai phát hiện nấm Cordyceps militaris Link (Nhộng trùng thảo) [3]

- Tại vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc phát hiện nấm Cordyceps gunni Berk [2]

- Tại khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động – Bắc Giang phát

hiện nấm Cordyceps nutans pat [1]

Ngoài những nơi đã phát hiện và thu thập thì còn còn nhiều nơi khác

đang được tiến hành điều tra Thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở

những khu rừng nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m Những chủng Cordyceps lần đầu tiên được phát hiện tai Việt Nam được mô

tả Đây là những loại nấm kí sinh trên nhộng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera,

nấm dài 2 – 6,5 cm, hình chuỳ, phần thân và cuống nhỏ, phần đầu( phần sinh sản) phình to có chiều rộng đến 0,6cm Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn có màu da cam nhạt, phần sinh sản

có màu da cam đậm và nhiều mụn nhỏ Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản Túi bào tử có kích thước 300 – 510 µ x 3,5 – 5µ, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,5 – 5 µ [3]

PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung Quốc

cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militarris

Kết quả đã nghiên cứu xác định được 3 loài nấm Đông trùng hạ thảo đó là:

Cordyceps nutans (Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc), Cordyceps militaris (Vũ Quang, Hà Tĩnh), Cordycep sp1 (Sơn Động, Bắc

Giang) Ngoài ra nghiên cứu cũng xác định được một số giá trị dược liệu

trong nấm gồm chất Cordycepin, HEAA, một số vitamin và một số nguyên tố

vi lượng

Trên đây là một số kết quả bước đầu về việc nghiên cứu nấm Đông trùng

hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam Việc nghiên cứu này là cần thiết để

có thể sử dụng nấm Cordyceps militaris làm thực phẩm chức năng Như vậy, việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam là

hoàn toàn cần thiết, đáp ứng nhu cầu đòi hỏi là bảo vệ sức khoẻ con ngýời ở Việt Nam

Phần 3 ĐốI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU 3.1 Ðối týợng (vật liệu)

3.1.1 Ðối týợng nghiên cứu

- Chủng giống ĐTHT từ Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu