4.1. Kết quả nghiên cứu sự sinh trýởng của nấm Cordyceps militaris trên môi trýờng cõ bản ðể xác ðịnh môi trýờng tối ýu
Để nghiên cứu sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên một vài môi trường cơ bản, chúng tôi thực hiện cấy nấm lên trên 3 loại môi trường cơ bản là: PDA, Czapek – Dox và CB ở cùng một điều kiện nuôi là 24oC, không chiếu sáng. Kết quả cho thấy nấm Cordyceps militaris sinh trưởng và phát triển trên các môi trường cơ bản có sự khác biệt khá rõ ràng (hình 4.1)
Czapek – Dox PDA CB
Hình 4.1: Nấm Cordyceps militaris phát triển trên một số môi trường cơ bản
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng nấm Cordyceps militaris có sự sinh trưởng và phát triển trên các môi trường là khác nhau.
- Trên môi trường Czapek – Dox: nấm sinh trưởng và phát triển rất kém.
Trong 5 ngày nuôi cấy đầu tiên trên tổng số 30 đĩa, chỉ có 2 đĩa xuất hiện hệ sợi của nấm Cordyceps militaris, hệ sợi nấm chỉ phát triển thành các chấm nhỏ, các ngày sau đó hệ sợi nấm phát triển rất chậm và sau 15, 20, 25 ngày
nấm không phát triển thêm nữa. Điều đó cho thấy môi trường Czapek – Dox không thích hợp cho nấm phát triển.
- Trên môi trường PDA, sau khoảng 2 ngày nuôi cấy, nấm Cordyceps militaris đã bắt đầu phát triển hệ sợi và tạo thành khuẩn lạc, kích thước tăng dần theo thời gian. Nhận thấy bề mặt khuẩn lạc xốp, sợi nấm có màu trắng ngà, mọc chằng chịt, ăn sát bề mặt thạch lan đều về các phía. Tốc độ sinh trưởng rất đều, sau 15 ngày, sợi nấm bắt đầu có sắc cam và đậm dần trong các ngày tiếp theo.
- Trên môi trường CB thì nấm phát triển rất mạnh trong những ngày đầu nuôi cấy. Sau 10 ngày, tốc độ phát triển có xu hướng chậm lại. Quan sát bề mặt thạch phía mặt trước đĩa petri, nhận thấy sợi nấm ban đầu có màu trắng xám, sợi nấm ngắn, các sợi nấm đan sát vào nhau. Sau 15 ngày sợi nấm cũng bắt đầu xuất hiện màu cam nhạt và rùi đậm dần vào các ngày tiếp đó.
Qua đó, chúng tôi nhận thấy trên hai môi trường PDA và CB nấm phát triển tốt. và để xác định môi trường nào tốt hơn cho sự phát triển của nấm Cordyceps militaris chúng tôi tiến hành so sánh giữa hai môi trường. Kết quả đƣợc ghi lại trong bảng 4.1
Bảng 4.1: Đường kính sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris trên các môi trường PDA và CB
Môi trường
Đường kính sinh trưởng sau các ngày nuôi (mm) 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày
PDA 10,82 21,46 32,63 42,34 50,27
CB 12,21 23,65 30,82 37,24 42,45
Từ bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy nấm Cordyceps militaris sinh trưởng nhƣ sau:
Trên môi trường PDA:
- Sau 5 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 10,82mm.
- Sau 10 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 21,46mm.
- Sau 15 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 32,63mm.
- Sau 20 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 42,34mm.
- Sau 25 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 50,27mm.
Kết quả trên cho thấy nấm Cordyceps militaris phát triển khá đều trên môi trường PDA.
Trên môi trường CB: Nấm phát triển nhanh trong 10 ngày đầu sau đó đã có phần giảm tốc độ sinh trưởng so với môi trường PDA.
- Sau 5 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 12,21mm.
- Sau 10 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 23,65mm.
- Sau 15 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 30,82mm.
- Sau 20 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 37,24mm.
- Sau 25 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 42,45mm.
Nhìn chung, sau 25 ngày nuôi cấy nấm sinh trưởng tốt hơn trên môi trường PDA. Để thuận tiện hơn cho sự đánh giá quan sát, chúng tôi đã vẽ biểu đồ thể hiện thể hiện sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và CB dưới đây:
Hình 4.2: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên môi trường PDA và CB
Từ hình 4.2 ta nhận thấy:
- Trong 5 ngày đầu nuôi cấy, nấm Cordyceps militaris phát triển mạnh nhất trên môi trường CB.
- Sau 10 ngày, nấm vẫn phát triển mạnh hơn trên môi trường CB.
- Nhƣng đến ngày thứ 15, sự phát triển của nấm Cordyceps militaris đã có sự thay đổi, trên môi trường PDA nấm đã sinh trưởng và phát triển tốt hơn trên môi trường CB. Do trong thời gian này sự phát triển của nấm bắt đầu có dấu hiệu chậm lại.
- Sau 20 ngày, đường kính trung bình của nấm Cordyceps militaris trên môi trường PDA là 42,34mm vẫn lớn hơn, trên môi trường CB là 37,24mm.
Đƣờng kính sinh trƣởng (mm)
- Sau 25 ngày, môi trường PDA vẫn tỏ giữ được tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris tốt với đường kính trung bình là 50,27mm, còn trên môi trường CB nấm Cordyceps militaris vẫn sinh trưởng và phát triển nhưng với tốc độ chậm hơn và đạt đường kính trung bình là 42,45mm.
Ngoài ra chúng tôi còn chụp hình sự sinh trưởng của nấm trên hai môi trường PDA và CB sau 25 ngày nuôi cấy.
PDA CB
Hình 4.3: Sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và CB sau 25 ngày nuôi cấy
Sau khi kết thúc thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy, trong 10 ngày đầu tiên nấm Cordyceps militaris sinh trưởng và phát triển rất mạnh trên môi trường CB nhưng sau đó lại bắt đầu có dấu hiệu phát triển chậm lại. Trên môi trường PDA, tuy trong 10 ngày đầu nấm Cordyceps militaris sinh trưởng và phát triển chậm hơn so với môi trường CB nhưng những ngày tiếp theo lại vẫn giữ được tốc độ sinh trưởng và phát triển ổn định nên đã vượt qua môi trường CB. Đây là một yếu tố quan trọng để chọn ra được môi trường nhân giống nấm. Từ kết quả đó, chúng tôi quyết định chọn môi trường PDA làm
môi trường cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm chọn ra được môi trường thích hợp để nhân giống nấm.
4.2. Kết quả Nghiên cứu ảnh hýởng của Nhộng tằm ðến sự sinh trýởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris
Để xác định sự ảnh hưởng của nhộng tằm đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống, chúng tôi tiến hành bổ sung nhộng tằm với các tỉ lệ khác nhau trên nền môi trường PDA. Nấm đƣợc nuôi trong điều kiện 24oC, pH = 6,5, không chiếu sáng. Kết quả đƣợc thể hiện cụ thể trong bảng 4.2 và hình 4.4.
Bảng 4.2: Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris ở các môi trường có bổ sung nhộng tằm với tỷ lệ khác nhau
Môi trường
Đường kính sinh trưởng sau các ngày nuôi (mm) 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày
PDA 10,82 21,46 32,63 42,34 50,27
P05 12,53 24,56 37,72 46,15 56,52
P10 14,84 29,62 42,38 53,47 62,43
P15 10,54 19,63 29,84 40,05 47,03
P20 10,03 18,87 27,36 36,42 43,62
Hình 4.4: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris ở các môi trường có bổ sung nhộng tằm với tỷ lệ khác nhau
Từ bảng 4.2 và hình 4.4 ta nhận thấy ở các môi trường có bổ sung thành phần bột nhộng tằm đường kính sinh trưởng của nấm có sự khác biệt rõ rệt so với ở môi trường PDA. Điều đó chứng tỏ thành phần nhộng tằm có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris.
Nhận thấy trên môi trường P10 nấm phát triển mạnh nhất :
- Trong 5 ngày đầu nuôi cấy, nấm Cordyceps militaris phát triển mạnh đường kính sinh trưởng trung bình đạt 14,84mm.
- sau 10 ngày, đường kính sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trung bình tăng 14,78mm đạt mức 29,62mm.
- Sau 15 ngày, đường kính sinh trưởng nấm Cordyceps militaris tăng thêm 12,76mm đạt mức 42,38mm.
- Vào ngày thứ 20, đường kính sinh trưởng trung bình nấm Cordyceps militaris đạt 53,47mm cao hơn 11,09mm so với ngày thứ 15.
- Ngày thứ 25 đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris là 62,43mm vẫn cao nhất trong các môi trường thí nghiệm.
Đƣờng kính sinh trƣởng (mm)
Ngày
Có thể nhận thấy, môi trường P10 là môi trường thích hợp để nuôi hệ sợi nấm. Việc bổ sung 10% nhộng tằm là phù hợp với sự sinh trưởng của nấm.
Trên những môi trường còn lại, nấm Cordyceps militaris sinh trưởng chậm hơn thể hiện qua số đo đường kính sinh trưởng nhỏ.
Xét trên các môi trường có bổ sung nhộng tằm thì nấm Cordyceps militaris sinh trưởng chậm nhất trên môi trường P20 (môi trường có bổ sung 20% nhộng tằm) :
- Sau 5 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình nấm Cordyceps militaris chỉ đạt 10,3mm.
- Sau 10 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình nấm Cordyceps militaris đạt 18,87mm.
- Sau 15 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình nấm Cordyceps militaris đạt 27,36mm.
- Sau 20 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình nấm Cordyceps militaris đạt 36,42.
- Sau 25 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình nấm Cordyceps militaris đạt 43,62mm.
Có thể nhận thấy, trên môi trường này, nấm phát triển kém, tỉ lệ 20%
nhộng tằm không phù hợp với sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris.
So với môi trường PDA ban đầu, sự sinh trưởng của nấm đã bị giảm đi.đáng kể.
Sau đây là thứ tự giảm dần của đường kính sinh trưởng nấm Cordyceps militaris trên các môi trường : P10>P05>PDA>P15>P20. Như vậy, sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris có ảnh hưởng khá nhiều bởi tỉ lệ phần trăm nhộng tằm bổ sung. Với tỉ lệ vừa đủ thì nấm phát triển nhanh, khỏe, nhưng tỉ lệ quá cao, nấm sẽ bị giảm sự sinh trưởng.
Để dễ quan sát sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên môi trường có bổ sung tỉ lệ nhộng tằm phù hợp. Chúng tôi đã tiến hành chụp ảnh lại sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris sau 25 ngày và đem so sánh với môi trường khi chưa bổ sung nhộng tằm.
PDA P10
Hình 4.5: Sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên môi trường PDA và môi trường P10 sau 25 ngày nuôi cấy
Từ hình 4.5 chúng tôi nhận thấy, nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường P10 tốt hơn trên trường PDA ban đầu khá nhiều. sợi nấm nhiều, mọc đan xen vào nhau về mọc đều về mọi nhiều, sợi nấm có màu cam rõ ràng hơn bên môi trường PDA. Sự khác biệt này là do trong nhộng có những hoạt chất ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris. Hơn nữa, Nhộng tằm là vật ký chủ của nấm Cordyceps militaris ngoài tự nhiên nên đã có những thành phần thích hợp cho nấm sử dụng.
Như vậy, ta thấy nấm Cordyceps militaris sinh trưởng tốt nhất trên môi trường PDA có bổ sung 10% nhộng tằm. Kết quả này có ý nghĩa lớn, là cơ sở cho việc nghiên cứu ảnh hưởng của nhộng đến sự hình thành và phát triển của quả thể cũng như việc lựa chọn môi trường để nhân nuôi giống nấm. Từ
kết quả nghiên cứu này, chúng tôi sẽ tiếp tục sử dụng môi trường P10 làm môi trường nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.3. Kết quả Nghiên cứu ảnh hýởng của nhiệt ðộ không khí ðến sự sinh trýởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris
Để xác định được sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống, chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm trong các thang nhiệt độ khác nhau. Môi trường được sử dụng là môi trường P10, pH =6,5, không chiếu sáng. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau đƣợc thể hiện trong bảng 4.3 và hình 4.4.
Bảng 4.3. Đường kính sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ nuôi
Đường kính sinh trưởng sau các ngày nuôi (mm) 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày
18 12,07 24,25 35,41 44,23 55,43
20 14,05 28,41 41,52 51,17 63,51
22 15,73 32,11 45,34 58,35 67,72
24 14,84 29,62 42,38 53,47 62,43
26 10,45 19,63 27,21 35,51 45,43
Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Từ bảng 4.3 và hình 4.6 cho thấy, sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris ở các thang nhiệt độ không khí là khác nhau khá rõ rệt.
Sau 5 ngày nuôi cấy, nấm sinh trưởng khá tốt ở nhiệt độ 20oC, 22oC, 24oC. Trong đó, hệ sợi nấm Cordyceps militaris sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 22oC:
- Sau 5 ngày đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 15,73mm.
- Đến ngày thứ 10, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 32,11mm vậy là đã tăng thêm 16,38mm.
- Ngày thứ 15, tốc độ sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris vẫn giữ ở mức ổn định và đạt mức 45,34mm.
- Đến ngày thứ 20, đường kính sinh trưởng nấm Cordyceps militaris đạt 58,35mm.
- Ngày thứ 25, đường kính sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris đạt 67,72mm.
Ở nhiệt độ 26 oC, nấm phát triển kém nhất :
Đƣờng kính sinh trƣởng (mm)
Ngày
- Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 10,45mm.
- Sau 10 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 19,63mm.
- Sau 15 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 27,21mm.
- Sau 20 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 35,51mm.
- Sau 25 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 45,43mm.
Sự sinh trưởng của nấm trên hai điều kiện nhiệt độ có sự chênh lệch khá lớn. Từ trước đến nay, yếu tố nhiệt độ vẫn luôn là một điều kiện quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm. Mặc dù mỗi loại có thể sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ khá rộng, nhƣng với mỗi khoảng nhiệt độ khác nhau sẽ cho một kết quả riêng biệt. Để dễ cho việc quan sát, chúng tôi có chụp lại sự phát triển của nấm trên thang nhiệt độ khác nhau, dưới đây là ảnh chụp lại kết quả nuôi nấm dưới điều kiện 22oC và 26oC :
T = 22oC T = 26oC
Hình 4.7: Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên hai điều kiện nhiệt độ khác nhau trong 25 ngày.
Từ hình 4.7 có thể nhận thấy nấm thích hợp ở nhiệt độ 22oC khi nhiệt độ tăng lên tới 26oC hệ sợi của nấm bị ảnh hưởng dẫn đến việc chậm phát triển.
Sau đây là thứ tự sắp xếp đường kính sinh trưởng giảm dần theo các thang nhiệt độ : 22oC>24oC >20oC >18 oC >26 oC. Nhƣ vậy, hệ sợi nấm Cordyceps militaris sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 22 oC. Từ kết quả nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng khác đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm ở điều kiện nhiệt độ 22oC.
4.4. Kết quả Nghiên cứu ảnh hýởng của pH býớc ðầu ðến sự sinh trýởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris
Để xác định sự ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng của hệ sơi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống, chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm trong các thang pH khác nhau. Nấm được nuôi trên môi trường P10 ở nhiệt độ 22oC, không chiếu sáng. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trong các thang pH đƣợc thể hiện trong bảng 4.4 và hình 4.5.
Bảng 4.4: Đường kính sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các điều kiện pH khác nhau
PH Môi trường
Đường kính sinh trưởng sau các ngày nuôi (mm) 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày
5 9,65 17,34 26,42 34,15 48,64
5,5 15,12 30,17 43,12 50,63 63,42
6 16,25 34,62 48,53 59,21 69,29
6,5 15,73 32,11 45,34 56,35 67,72
7 11,42 23,71 30,46 46,32 53,44
Hình 4.8: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các điều kiện pH khác nhau
Từ bảng 4.4 và hình 4.8 nhận thấy, nấm Cordyceps militaris sinh trưởng đƣợc trong khoảng pH khá rộng từ 5 – 7,5, nhƣng ở mỗi thang pH khác nhau thì sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris lại có sự khác nhau.
Nấm sinh trưởng tốt nhất trên môi trường có điều kiện pH môi trường là 6:
- Sau 5 ngày, nấm Cordyceps militaris có đường kính sinh trưởng trung bình đạt 16,25mm và cao nhất trong các thang PH thử nghiệm.
- Ngày thứ 10, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris tăng thêm 18,37mm lên đến 34,62mm.
- Ngày thứ 15, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris tăng thêm 13,91mm và đạt 48,53mm.
- Ngày thứ 20, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris tăng thêm 10,68mm và đạt 59.21mm.
- Ngày thứ 25, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris vẫn tăng thêm 10,08mm để đạt đường kính 69,29mm.
Đƣờng kính sinh trƣởng (mm)
Ngày
Nhìn chung, nấm phát triển khá nhanh và sinh trưởng nhanh nhất trong 10 ngày đầu tiên sau đó có chậm dần.
Trên các giá trị pH khác nấm phát triển kém hơn, tuy nhiên hệ sợi nấm Cordyceps militaris vẫn phát triển khá mạnh trên môi trường có điều kiện PH là 5,5 và 6,5. Với môi trường có pH = 5, hệ sợi nấm phát triển kém nhất :
- Sau 5 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 9,65mm.
- Sau 10 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 17,34mm
- Sau 15 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 26,42mm.
- Sau 20 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 34,15mm.
- Sau 25 ngày, đường kính sinh trưởng trung bình của nấm Cordyceps militaris đạt 48,64mm
Để dễ dàng nhận thấy được sự ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris. Chúng tôi đã chụp ảnh sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường có giá trị pH lần lượt là 5 và 6 :
pH = 5 pH= 6
Hình 4.9: Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường có pH lần lượt là 5,6
Từ hình 4.9 cho thấy sự sinh trưởng của nấm trên 2 môi môi trường có sự khác nhau rõ rệt.
Cụ thể, đường kính sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm sau 25 ngày nuôi cấy giảm dần theo thứ tự pH môi trường sau: 6>6,5>5,5>7>5.
Tuy nhiên, sau thí nghiệm nhận thấy nấm Cordyceps militaris phát triển tốt nhất trên môi trường có pH là 6. Đây sẽ là điều kiện pH được lựa chọn cho môi trường trong giai đoạn nhân giống nấm Cordyceps militaris.