Phần 3 ĐốI TƯợNG, NộI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU
3.1. Đối tƣợng (vật liệu)
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Peptone - Dextrose - Agar - Khoai tây b. Chất khoáng:
- MgSO4.7H2O - K2HPO4
- NaNO3 - KCl
c. Một số dụng cụ và thiết bị cần thiết:
- Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc đong, ống đong, phễu, que cấy, pank, dao, …
- Nồi hấp khử trùng, tủ sấy, tủ nuôi lắc, tủ định ôn, tủ lạnh, tủ an toàn sinh học, kính hiển vi, cân phân tích, máy chuẩn pH …
3.2. Ðịa ðiểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 3.2.1. Ðịa ðiểm
- Phòng nghiên cứu và sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo – Viện Khoa Học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên.
- Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gene – Viện Khoa Học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian tiến hành
Từ tháng 14/11/2015 đến 14/05/2016 3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên môi trường cơ bản để xác định môi trường tối ưu
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nhộng tằm đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Codyceps militaris
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Codyceps militaris
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH bước đầu đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Codyceps militaris
3.4. Phýõng pháp nghiên cứu
3.4.1 Những môi trýờng cõ bản ðýợc sử dụng
Môi trường PDA:
- Khoai tây: 200g - Dextrose: 20g - Agar: 20g
- H2O : Chuẩn đủ đến 1000ml
Môi trường Czapek – Dox:
- Agar: 20 g
- Saccaroza: 30 g - NaNO3: 2 g - K2HPO4: 1 g
- MgSO4.7H2O : 0.5 g
- KCl: 0.5 g
- H2O: chuẩn đủ đến 1000 ml
Môi trường CB:
- Agar: 20 g
- Đường kính: 10 g - Glucose: 4 g - Pepton: 6 g
- Cao nấm men: 4 g
- H2O: chuẩn đủ đến 1000 ml 3.4.2. Phương pháp tiến hành
Phương pháp bảo quản và chuẩn bị chủng giống
Chủng giống Cordycep militaris từ Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đƣợc giữ giống trên ống thạch nghiêng và đƣợc bảo quản trong tủ lạnh 4oC để chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp.
Hoạt hóa các bào tử nấm bằng cách sử dụng que cấy thu lấy sinh khối nấm Cordyceps militaris trong ống thạch nghiêng đƣa vào bình tam giác chứa 200ml môi trường dinh dưỡng (Peptone: 5g/l, sucrose: 10g/l, MgSO4.7H2O:
0,5g/l, K2HPO4: 1g/l). Sau đó đem nuôi trong tủ nuôi lắc 100v/phút ở 23oC để chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp nghiên cứu sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris trên môi trường cơ bản để xác định môi trường tối ưu.
Thí nghiệm 1: Sử dụng 3 môi trường cơ bản là PDA, Czapek – Dox và CB.
- Các bước tiến hành
Bước 1: Cân đủ số lượng thành phần của các loại môi trường.
Bước 2: Hòa tan các thành phần môi trường bằng máy khuấy từ có gia nhiệt hoặc đun lên, chuẩn PH = 6.
Bước 3: Chia môi trường làm 2 phần. Một phần đổ vào ống nghiệm (khoảng 1/3 ống) rồi gói lại. Phần môi trường còn lại đem cho vào bình chịu nhiệt, sau đó đem tất cả đi hấp khử trùng trong thời gian 30 phút, 1210C (áp suất 1atm).
Bước 4: - Đem ống nghiệm đặt nghiêng trong tủ an toàn sinh học
- Rót môi trường trong bình chịu nhiệt ra đĩa petri trong tủ an toàn sinh học và để nguội
- Sau đó để nguội và khử trùng bằng tia uv khoảng 30 phút.
Bước 5: Tiến hành cấy chấm điểm trên đĩa petri.
Bước 6: Gói đĩa đem nuôi trong tủ định ôn, theo dõi sự phát triển hằng ngày của nấm sau 5, 10, 15, 20, 25 ngày.
Nghiên cứu ảnh hưởng của Nhộng tằm đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Codyceps militaris
Ngoài thiên nhiên, nấm Cordyceps militaris kí sinh trên ký chủ nhộng tằm. Vì vậy những dưỡng chất có trong nhộng tằm sẽ có ảnh hưởng nhất định đến sự phát triển của nấm. Xuất phát từ đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhộng tằm đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm thông qua 5 loại môi trường dưới đây.
Thí nghiệm 2: Thí nghiệm được tiến hành với 5 môi trường:
PDA: Môi trường PDA
P05: Môi trường PDA + 5% Nhộng tằm P10: Môi trường PDA + 10% Nhộng tằm P15: Môi trường PDA + 15% Nhộng tằm P20: Môi trường PDA + 20% Nhộng tằm
- Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Codyceps militaris
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Codyceps militaris
Nhiệt độ là một trong những điều kiện quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật. Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của Cordyceps militaris là rất cần thiết.
Thí nghiệm sử dụng môi trường thích hợp nhất cho nấm phát triển từ thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 (kí hiệu *) và đƣợc thử nghiệm với các công thức:
CT1: Môi trường * nuôi trong 18oc CT2: Môi trường * nuôi trong 20 oc CT3: Môi trường * nuôi trong 22 oc CT4: Môi trường * nuôi trong 24 oc CT5: Môi trường * nuôi trong 26 oc
- Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại.
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH bước đầu đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Codyceps militaris
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH bước đầu đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Codyceps militaris
pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của các loài nấm. Mỗi loài có một khoảng pH thích hợp khác nhau. Vì vậy, việc nghiên cứu pH thích hợp cho nấm Cordyceps militaris là
cần thiết. Thí nghiệm sau sẽ đƣợc tiến hành với các thang pH khác nhau nhƣ sau:
Thí nghiệm tiến hành với các công thức:
CT1: Môi trường *, pH = 5 CT2: Môi trường *, pH = 5,5 CT3: Môi trường *, pH = 6 CT4: Môi trường *, pH = 6.5 CT5: Môi trường *, pH = 7
- Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại.
3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi, phýõng pháp thu thập và xử lý số liệu a. Chỉ tiêu theo dõi hằng ngày:
- Quan sát hình thái nấm bằng mắt thường: quan sát màu sắc và sự phát triển của sợi nấm ở cả mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc.
- Mô tả quá trình phát triển của nấm.
- Theo dõi và ghi chép các điều kiện trong phòng nuôi cấy.
b. Thu thập số liệu
- Đo đường kính khuẩn lạc: kể từ khi nấm hình thành khuẩn lạc sau 5, 10, 15, 20, 25, 30 ngày (dùng thước đo cm kẻ rõ) để đo đường kính, đo cả mặt trước và mặt sau của đĩa theo hai đường vuông góc, sau đó tính trị số trung bình theo công thức:
D1 + D2 D = ---
2
Trong đó : D: đường kính trung bình của khuẩn lạc
D1, D2 đường kính khuẩn lạc của hai đường vuông góc
- Chụp ảnh sự phát triển của nấm theo thời gian phát triển.
c. Xử lí số liệu
- Thu thập và xử lý số liệu trên phần mềm Excel 2010.