Luận văn khảo sát quá trình thu nhận ethanol từ bã rong enteromorphasp sau trích ly protein bằng phương pháp lên men ssf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GỊN KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THU NHẬN ETHANOL TỪ BÃ RONG ENTEROMORPHA SP SAU TRÍCH LY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN SSF GVHD: PGS TS HOÀNG KIM ANH SVTH: TRẦN ĐẠT MSSV: DH61400235 TP Hồ Chí Minh, 07/2018 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan trình sản xuất ethanol 1.1.1 Ƣu điểm sản xuất ethanol từ nguyên liệu hệ I 1.1.2 Nhƣợc điểm sản xuất ethanol từ nguyên liệu hệ I 1.2 Tổng quan nguyên liệu hệ II 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Ƣu điểm 1.2.3 Nhƣợc điểm 1.3 Tổng quan nguyên liệu hệ thứ III 1.3.1 Phân loại 1.3.2 Thành phần hóa học rong 1.3.3 Ứng dụng rong 1.4 Tổng quan q trình chuyển hóa sinh khối thành ethanol 10 1.4.1 Quá trình tiền xử lý .11 1.4.2 Quá trình thủy phân 14 1.4.3 Quá trình lên men sản xuất ethanol 21 1.4.4 Phƣơng pháp lên men: 21 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối rong .22 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới .22 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 23 1.6 Mục tiêu nghiên cứu 25 1.7 Nội dung nghiên cứu 25 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Rong Bã rong Enteromorpha sp trích ly protein 26 2.1.2 Nấm men .27 2.1.3 Enzyme 27 2.1.4 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 28 2.2 Sơ đồ nghiên cứu .31 2.3 Quy trình thực nghiệm .32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 Thành phần hóa học bã rong .41 3.2 Xác định nồng độ Enzyme phù hợp cho trình thủy phân lên men đồng thời .41 3.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng Enzyme Cellulase 43 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Enzyme β-Glucosidase 44 3.2.3 Xác định nhiê ̣t đô ̣ lên men phù hợp .45 3.2.4 Xác định mật độ nấm men phù hợp cho quá trin ̀ h lên men SSF 46 3.2.5 Xác định thời gian lên men phù hợp 48 3.2.6 So sánh hai phƣơng pháp lên men SSF SHF 52 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 4.1.1 4.2 Kết luận 53 Những điều kiện phù hợp cho trình lên men SSF 53 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Thành phần carbohydrate số loại rong Bảng 2: Nguồn thu nhận chất Enzyme laminarinase 19 Bảng 3: Một số dự án sản xuất ethanol Việt Nam 24 Bảng 1: Hóa chất dùng thí nghiệm 28 Bảng 1: Thành phần sinh hóa rong nguyên liệu bã rong 41 Bảng 2: Khảo sát ảnh hƣởng Enzyme Cellulase tới trình lên men SSF 43 Bảng 3: Ảnh hƣởng nồng độ Enzyme β-Glucosidase tới quá trin ̀ h lên men SSF 45 Bảng 4: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình lên men SSF 46 Bảng 5: Khảo sát ảnh hƣởng nấm men tới trình lên men SSF 48 Bảng 6: Ảnh hƣởng thời gian tới kết trình lên men SSF 50 Bảng 1: Điều tiện tối ƣu cho trình lên men SSF 53 DANH MỤC HÌNH Hình1 Phân bố tổng tiêu thụ dạng lƣợng toàn cầu (2010) Hình1 Rong Lục Hình1 Rong Nâu .7 Hình1 Rong đỏ Hình1 Quy trình chuyển hóa sinh khối thành ethanol 11 Hình1 Tác dụng enzyme Cellulose 15 Hình1 Quá trình thủy phân cellulose hệ Enzyme Cellulase[44] 15 Hình1 Quá trình thủy phân tinh bột Enzyme Amylase 17 Hình Rong bã rong Enteromorpha sp sau trích ly protein .26 Hình 2 Một số thiết bị dùng nghiên cứu 30 Hình Sơ đồ nghiên cứu 31 Hình Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 32 Hình Mẫu trƣớc sau tiền xử lý 33 Hình Sơ đồ quy trình lên men SSF 34 Hình Sơ đồ khảo sát thí nghiệm lên men SSF .35 Hình Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Enzyme Cellulase 36 Hình Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Enzyme β-Glucosidase 37 Hình 10 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình lên men SSF 38 Hình 11 Khảo sát ảnh hƣởng mật độ nấm men tới trình lên men SSF 39 Hình 12 Thời gian trình lên men SSF .40 Hình Hàm lƣợng glucose xylose có bã rong 42 Hình Ảnh hƣởng thời gian tới kết trình lên men 49 Hình 3 Ảnh hƣởng thời gian tới nồng độ Ethanol mật độ nấm men sau lên men 49 LỜI CẢM ƠN Khoảng thời gian bốn năm ngồi giảng đƣờng đại học, có lẽ khoảng thời gian có nhiều kỉ niệm Tôi trƣởng thành hơn, học hỏi đƣợc nhiều môi trƣờng Những điều học đƣợc không đơn lý thuyết hay giảng khơ cứng mà học kinh nghiệm sống vô quý báu Bản thân cảm thấy trân trọng quý báu quãng đời sinh viên biết ơn nhà trƣờng, thầy cô, cha mẹ Trong khoảng thời gian cuối khoá nhờ giúp đỡ thầy cô khoa mà thân em đƣợc có hội để hồn thiện mong muốn làm luận văn mình, suốt trình em ln nhận đƣợc hỗ trợ nhiệt tình từ quý thầy cô giảng viên trực tiếp hƣớng dẫn Để hồn thành tốt luận văn mình, chúng em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học Cơng nghệ Sài Gịn, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ thực phẩm quý thầy cô giảng viên khoa tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Chúng em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Hồng Kim Anh, ngƣời tận tình dạy, hƣớng dẫn, tạo điều kiện, hội tốt để chúng em có thêm kiến thức, kinh nghiệm thực tiễn để chúng em hồn thành tốt luận văn mình, bên cạnh theo dõi, dẫn, động viên chia sẻ với chúng em khó khăn suốt thời gian thực khóa luận ln ln có mặt để giải đáp tất thắc mắc mà chúng em gặp phải trình làm luận văn Chúng em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô khác khoa tận tình dạy, giúp đỡ chúng em chúng em thực thí nghiệm phịng thực hành Bên cạnh đó, chúng em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến anh Nguyễn Minh Nhựt tận tình giúp đỡ để chúng em có tâm lý thoải mái q trình làm luận văn Ngồi ra, chúng em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, Lƣu Mai Hƣơng bạn bè nguồn động lực, bên cạnh hỗ trợ khích lệ chúng em suốt năm đại học nhƣ thời gian làm luận văn trƣờng Chúc quý thầy cô dồi sức khỏe! Sinh viên thực MỞ ĐẦU Nền kinh tế giới phụ thuộc nhiều vào nhiên liệu hoá thạch, nhu cầu lƣợng không ngừng gia tăng theo phát triển kinh tế - xã hội, an ninh quốc phòng quốc gia Theo tính tốn chun gia lƣợng, dầu mỏ khí đốt chiếm khoảng 60-80% cán cân lƣợng giới Với tốc độ tiêu thụ lƣợng nhƣ trữ lƣợng dầu mỏ có, nguồn lƣợng nhanh chóng bị cạn kiệt vịng 40-50 năm tới Hơn chất đốt hoá thạch làm tăng lƣợng carbon dioxide khí quyển, nguyên nhân làm trái đất nóng lên, vấn đề nhiều tổ chức, quốc gia muốn tìm cách hạn chế nhiều năm qua Nhiệm vụ tìm kiếm nguồn thay cho nhiên liệu hoá thạch đƣợc đặt gần kỹ qua ngày trở nên cấp thiết Vì có nhiều nghiên cứu việc sử dụng nguồn nguyên liệu mới, tận dụng nguồn nguyên liệu phế thải để sản xuất nhiên liệu sinh học - nguồn lƣợng góp phần bảo vệ môi trƣờng, tiết kiệm nguồn tài nguyên thiên nhiên khắc phục tình trạng thiếu lƣơng thực thực phẩm Việc thúc đẩy tìm kiếm nguồn ngun liệu khơng cạnh tranh với lƣơng thực cần thiết cấp bách Trong kể đến nguồn nguyên liệu giàu celllulose: bã mía, rơm, rạ… nhƣng chúng gây khó khăn việc xử lí Tuy nhiên tự nhiện nguồn nguyên liệu giàu cellulose dễ dàng cho việc xử lý nguồn rong biển tự nhiên Rong biển đƣợc xem nguồn nguyên liệu từ thực vật thủy sinh đƣợc giới ý đến nhƣ nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học hệ thứ sau tinh bột cellulose Rong biển nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào, không cạnh tranh với lƣơng thực, khơng chiếm diện tích đất canh tác đƣợc ý đến nhƣ giải pháp phù hợp bối cảnh thiếu hụt nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất Ethanol Nƣớc ta nằm vùng nhệt đới gió mùa Đông Nam Á với hệ thống sông suối dày đặc với 3260km bờ biển, 3000 đảo quần đảo với hệ sinh thái điển hình vùng nƣớc thềm lục địa rộng lớn nhƣ rạn san hô, rừng ngập nặm, chuỗi đầm phá ven biển, hệ cửa song chúng không nơi sinh sống phát triển hang vạn loài thuỷ sinh vật mà sở quan trọng cho phát triển kinh tế xã hội nói chung Hiện nay, rong biển đối tƣợng đƣợc giới quan tâm rong biển chứa thành phần hoá học quan nhƣ: chất khống vơ cơ, lipid, protein, carbonhydrate,…đồng thời đa dạng phong phú chủng loại sản lƣợng, khả sinh sản, sinh trƣởng Một số lồi rong biển (nhƣ Enteromorpha sp.) có mặt tự nhiên với số lƣợng lớn khắp ao hồ nuôi tôm quảng canh nƣớc lợ vùng đồng sông Cửu Long Sau thu hoạch tơm, lồi rong đƣợc xem nhƣ nguồn phế thải đƣợc bà nông dân vớt khỏi ao để thành đống thối rữa bờ, vừa lãng phí vừa gây nhiễm môi trƣờng Việc nghiên cứu thu nhận sản phẩm có giá trị từ lồi rong tận dụng nguyên liệu sẵn có để tạo sản phẩm có giá trị gia tăng đồng thời giải vấn đề ô nhiễm môi trƣờng địa phƣơng Với mạnh tăng sinh khối nhanh khoảng 5%/ngày khả tận dụng diện tích mặt nƣớc để nuôi kết hợp với tôm, rong biển đƣợc xem lựa chọn chiến lƣợc cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học, đồng thời ứng phó với bối cảnh biến đổi khí hậu - nƣớc biển dâng Rong biển chứa lignin, qui trình sản xuất nhiên liệu từ rong biển đơn giản thuận lợi so với từ thực vật cạn Rong có thành phần carbohydrate 30 - 40% w/w, 15 - 25% w/w protein Sau rong đƣợc trích ly protein hàm lƣợng carbohydrate bã rong tăng lên đến 60 65% w/w carbohydrate chứa glucose chiếm 50% so với tổng lƣợng carbohydrate Điều cho thấy bã rong nguồn ngun liệu thích hợp cho q trình chuyển hóa sinh khối thành đƣờng lên men Ethanol Ngồi ra, thành phần khống protein tách từ sinh khối rong ban đầu có khả sử dụng bổ sung làm thức ăn thƣơng mại cho tôm cá mức độ tinh cao bổ sung vào thực phẩm Xuất phát từ lý em tiến hành đề tài “Khảo sát trình thu nhận Ethanol từ bã rong Enteromorphasp sau trích ly protein phương pháp lên men SSF” Nhóm tiến hành nghiên cứu có sinh viên– Sinh viên trƣờng Đại học Cơng nghệ Sài Gịn – Ngành Cơng nghệ thực phẩm LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan trình sản xuất ethanol Áp lực kinh tế toàn cầu ngày tăng, với suy giảm nguồn nhiên liệu hóa thạch, khí hậu nóng lên nhiễm mơi trƣờng, kinh tế giới kéo dài phần lớn thời gian kỷ 21, phụ thuộc nhiều vào nhiên liệu hóa thạch Tuy nhiên, nguồn nhiên liệu hóa thạch vào giai đoạn chuẩn bị cạn kiệt bị khai thác tối đa.Theo báo cáo “Triển vọng lƣợng giới 2013” Cơ quan Thông tin Năng lƣợng Mỹ (EIA) lƣợng tiêu thụ lƣợng giới tăng từ 5341024 năm 2010 lên 8201024 Btu (trong 1024 Btu tƣơng đƣơng 172 triệu thùng dầu thô) Dự báo lƣợng tái tạo lƣợng hạt nhân nguồn lƣợng tăng trƣởng nhanh với tốc độ tăng dự kiến lên tới 2,5% năm Hình1 Phân bố tổng tiêu thụ dạng lƣợng toàn cầu (2010) Bên cạnh đó, nhu cầu phát triển kinh tế với tốc độ cao quy mô rộng làm cho an ninh lƣợng toàn cầu ngày bị đe dọa nghiêm trọng Do đó, nhiệm vụ tìm kiếm nguồn thay cho nhiên liệu hóa thạch đƣợc đặt gần nửa kỉ qua trở nên cấp thiết Trƣớc tình hình đó, nhiên liệu sinh học đƣợc xem nhƣ dạng lƣợng đầy tiềm khả tái tạo hết SVTH: Trần Đạt Trang LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP nguồn lƣợng “sạch”, không độc hại dễ dàng phân hủy tự nhiên Hiện có dạng lƣợng sinh học chủ yếu ethanol sinh học diesel sinh học Năm 2010 sản lƣợng nhiên liệu sinh học (NLSH) tồn cầu đạt 105 tỉ lít, có 86 tỉ lít ethanol, tăng 17 % so với năm 2009 chiếm 2,7 % nhiên liệu giao thơng vận tải Hoa Kì Brazil hai quốc gia sản xuất tiêu thụ ethanol nhiều nhất, chiếm 90 % sản lƣợng toàn cầu Trong năm 2011 dự án sản xuất NLSH có mặt 31 quốc gia 29 bang/tỉnh Hoa Kì số nƣớc Theo Cơ quan Năng lƣợng quốc tế, đến năm 2050 NLSH đáp ứng 1/4 nhu cầu nhiên liệu cho giao thông vận tải Hiện nay, ethanol sinh học đƣợc sản xuất dựa nguyên liệu từ lồi trồng nơng nghiệp (nhƣ đƣờng, hạt ngũ cốc, phế thải nông nghiệp…) rỉ đƣờng Hồn tồn chƣa có nhà máy sản xuất ethanol từ nguyên liệu khác Sản phẩm chủ yếu ethanol thực phẩm (nồng độ từ 40% đến 50%) cồn công nghiệp (nồng độ từ 95,57% đến 96%), lƣợng nhỏ đƣợc làm khan thành ethanol tuyệt đối (nồng độ 99,5%) ảnh hƣởng đến giá lƣơng thực thực phẩm, nguồn nƣớc ngọt, đất canh tác, nhƣ đến nghèo kiệt xói mịn đất Đƣờng hóa lên men rƣợu hai giai đoạn chủ yếu quy trình sản xuất ethanol Giai đoạn đƣờng hố q trình biến đổi hóa học, chuyển tinh bột thành đƣờng lên men nhờ hoạt động enzyme thuỷ phân tinh bột amylase sẵn có nguyên liệu hay sản sinh từ vi sinh vật Giai đoạn lên men rƣợu q trình lên men yếm khí nấm men, chuyển hóa đƣờng thành ethanol CO2 Hệ enzyme sản xuất ethanol amylase gồm α-amylase, β-amylase amylophosphatase (γ-amylase) Hệ vi sinh vật giữ vai trò quan trọng trình sản xuất ethanol, ảnh hƣởng trực tiếp đến suất chất lƣợng sản phẩm Nấm mốc thực q trình đƣờng hố nấm men thực trình lên men rƣợu, hai nhóm vi sinh vật chủ yếu có men ethanol Một số dòng nấm mốc phổ biến nhƣ Amylomyces rouxii, Rhizopus spp., Mucor spp, Aspergillus spp Một số nấm men gồm có Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., Endomycopsis spp 1.1.1 Ƣu điểm sản xuất ethanol từ nguyên liệu hệ I Nƣớc ta nƣớc nơng nghiệp, nguồn ngun liệu đến từ nơng nghiệp nhƣ sắn, ngô…là lợi lớn Sắn lƣơng thực phổ biến nƣớc vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi châu Mỹ Sắn dễ trồng, thích hợp với đồi, đất, gò Ở Việt Nam, sắn đƣợc trồng từ Bắc tới Nam, đƣợc trồng nhiều vùng trung du Sắn nhiều tinh bột SVTH: Trần Đạt Trang 12 Harmsen P., Huijgen W., Bermudez L and Bakker R 2010 “Literature review of physical and chemical pretreatment processes for lignocellulosic biomass” 22-23 13 Harun, R., Jason W.S., Cherrington T., Danquah M (2011) “Analysis of process configurations for bioethanol production from microalgal biomas” Published: July 27, 2011 under CC BY-NC-SA 14 Hee Taek Kim, Eun Ju Yun, Damao Wang, Jae Hyuk Chung, In-Geol Choi, Kyoung Heon Kim (2013 5) “High temperature and low acid pretreatment and agarase treatment of agarose for the production of sugar and ethanol from red seaweed biomass” Bioresource Technology 136:582-587 (IF=4.980) 15 Henrikson, R 2011.“Earth Food, Spirulina” Hawaii 96718 USA: Ronore Enterprises 195 16 Horn S J., Aasen I M.and Stgaard K 2000b “Production of ethanol from mannitol by Zymobacter palmae” Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 24: 51-57.p 17 Jang HC, Park JH1, Hong JY, , Oh SG, Kim SH, Yoon JJ, Kim YJ “Use of Gelidium amansii as a promising resource for bioethanol: a practical approach for continuous dilute-acid hydrolysis and fermentation” 2012 Mar;108:83-8 Bioresour Technol 18 Jang JS1, Cho Y, Jeong GT, Kim SK “Optimization of saccharification and ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation (SSF) from seaweed, Saccharina japonica” 35(1-2):11-8 Bioprocess Biosyst Eng 19 Jin M1, Lau MW, Balan V, Dale BE “Two-step SSCF to convert AFEX-treated switchgrass to ethanol using commercial enzymes and Saccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST)” Bioresour Technol 2010 Nov;101(21):8171-8 20 Jung KA1, Lim SR, Kim Y, Park JM “Potentials of macroalgae as feedstocks for biorefinery” Bioresour Technol 2013 May;135:182-90 21 Klinke HB., Thomsen AB., Ahring BK 2004 “Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass” Appl Microbiol Biotechnol 66(1): 10–26 22 Lê Nhƣ Hậu 2009-2011 “Nghiên cứu đánh giá tiềm rong biển Việt Nam sử dụng làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu Biofuel”, khuôn khổ Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 23 LEE R LYND, RICHARD T ELANDER, AND CHARLES E WYMAN “Likely Features and Costs of Mature Biomass Ethanol Technology” Spring 1996, Volume 57-58, Issue 1, pp 741-761 24 Lee S M and Lee J H 2009 “Production of Bio-ethanol from Brown Algae by Physicochemical Hydrolysis” J Korean Ind Eng Chem 20(5): 517-521 25 Liu ZL., Slininger PJ., Dien BS., Berhow MA., Kurtzman CP., Gorsich SW 2004 “Adaptive response of yeasts to furfural and S-hydroxymethylfurfural and new chemical evidence for HMF conversion to 2,5-bis-hydroxymethyl furan” Journal of Imdustrial Microbiology and Biotechnology 31(8):345-352 26 Liu ZL., Slininger PJ., Gorsich SW 2005 “Enhanced biotransformation of furfural and hydroxymethylfurfural by newly developed ethanologenic yeast strains” Applied Biochemistry and Biotechnology - PartA: Enzyme Engineering and Biotechnology 121(1-3): 451-460 27 Llauradó JM1, Rozès N, Constantí M, Mas A “Study of some Saccharomyces cerevisiae strains for winemaking after preadaptation at low temperatures”.J Agric Food Chem 2005 Feb 23;53(4):1003-11 28 Lynd LR1, van Zyl WH, McBride JE, Laser M “Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update” Curr Opin Biotechnol 2005 Oct;16(5):577-83 29 MartinezA., Rodriguez M E., YorkS W., PrestonJ F.andIngramL O.,2000 “Effects of Ca(OH), treatments ('overliming') on the composition and toxicity of bagasse hemicellulose hydrolysates” Biotechnology and Bioengineering 69: 526536 30 Martone P T., Estevez J M., Lu F C., Ruel K., Denny M W.,Somerville C and Ralph J., 2009 “Discovery of Lignin in Seaweed Reveals Convergent Evolution of Cell-Wall Architecture”.Current Biology 19(2): 169-175 31 Meinita M., Kang J.Y., Jeong G.T., Koo H., Park S.and Hong Y K 2012a,b “Bioethanol production from the acid hydrolysate of the carrageenophyte Kappaphycus alvarezii (cottonii)” J Appl Phycol 24:857–862 32 Melis A and Happe T 2001 “Hydrogen Production: Green Algae as a Source of Energy” 740-748 33 Michael K Danquah, Boyin Liu, Razif Harun “Analysis of process configurations for bioethanol production from microalgal biomass” 2011 under CC BY- NC-SA 3.0 licence 34 Mingjie Jin, Cory Sarks, Christa Gunawan, Benjamin D Bice, Shane P Simonett (2010) “Two-step SSCF to convert AFEX-treated switchgrass to ethanol using commercial enzymes and Saccharomyces cerevisiae 424A(LNH-ST)” Biotechnology for Biofuels 2010, 3:11 35 Mok W S L and Antal J M J 1992 “Uncatalyzed solvolysis of whole biomass hemicellulose by hot compressed liquid water” Industrial and Engineering Chemistry Research 31(4):1157-1161 36 Nguyễn Minh Hải, Nguyễn Thị Liên, Bạch Ngọc Minh, Đỗ Thị Tuyến Lê Thị Hồng Chuyên, Hoàng Kim Anh, Lê Văn Việt Mẫn “Tối ưu hóa q trình tiền xử lý bã rong Chaetomorpha sp Bằng H2SO4 ACID SULFURIC để sử dụng sản xuất Ethanol sinh học” Tạp chí hóa học số ABC, 2013: 821-826 37 Nguyễn Văn Tiến 2007 “Thực vật chí Việt Nam” Hà Nội: Nhà xuất khoa học kỹ thuật 225-245 38 Notoya M 2011 “Production of Biofuel by macroalgea with preservation of marine resources and environtment Springer” Book chapter/ Seaweeds and their Role in Globally Changing Environments 195-207 39 Olsson L., Hahn-hagerdalB and ZacchiG 1995 “Kinetics of ethanol production by recombinant Escherichia coli KO 11” Biotechnology and Bioengineering 45:356-365 40 Palonen H 2004 “Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocelluloses” VTT Biotechnology 11-39 41 Park J I., Woo H.C and Lee J.H 2008 “Production of Bio-energy from Marine Algae: Status and Perspectives” Korean Chemical Engineering Research The Korean Institute of Chemical Engineers 833-844 42 Parro V, Mellado RP (1994) "Effect of glucose on agarase overproduction in Streptomyces." Gene 145 (1): 49–55 43 Patil V, Tran KQ., Giselrød HR 2008 “Towards Sustainable Production of Biofuels from Microalgae” Int J Mol Sci.9 (7): 1188-1195 44 Rai et al (2012) “Saccharification of bagasse,” BioResources 7(4), 5401-5414 5401 45 Rhodes C J 2010 “Biofuel from Algae: Salvation fromPeak Oil” Book chapter/ Seaweeds and their Role in Globally Changing Environments 208-227 46 SchenkP M., Thomas-hall S R., Stephens E., Marx U C., Mussgnug J H., Posten C., Kruse O and Hankamer B 2008 “Second Generation Biofuels: HighEfficiency Microalgae for Biodiesel Production” Bioenerg Res 1: 20–43 47 Sun Y and Cheng J 2002 “Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: A review” Bioresource Technology 83(1):1-11 48 van Maris AJ1, Abbott DA, Bellissimi E, van den Brink J, Kuyper M, Luttik MA, Wisselink HW, Scheffers WA, van Dijken JP, Pronk JT.“Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status”.Antonie Van Leeuwenhoek 2006 Nov;90(4):391-418 49 Weil J.R, Dien B., Bothast R., Hendrickson R., Mosier N S., Ladisch M.R 2002 “Removal of fermentation inhibitors formed during pretreatment of biomass by polymeric adsorbents” Industrial and Engineering Chemistry Research 41: 61326138 50 Xu Q I., Adney W S., Ding H.Y and Himmelmichael E 2007 “Cellulases for Biomass Conversion In Dustrial Enzymes” (Julio P and Andrew P M.) Springer, P.O Box 17, 3300 AA Dordrecht, The Netherlands 35-36 51 Zhizhuang Xiao, Xiao Zhang, David J Gregg, John N Saddler “Effects of Sugar Inhibition on Cellulases and β-Glucosidase During Enzymatic Hydrolysis of Softwood Substrates” PHỤ LỤC Phụ lục A Các phƣơng pháp phân tích A.1 Phân tích carbohydrate tổng a Nguyên tắc Dùng acid nhiệt độ cao để thủy phân hoàn toàn liên kết phân tử carbohydrate giải phóng thành phân tử đƣờng khử mạch ngắn Xác định lƣợng đƣờng khử tạo phƣơng pháp DNS Phƣơng pháp dựa sở phản ứng tạo màu đƣờng khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cƣờng độ màu hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử phạm vi định So màu tiến hành bƣớc sóng 540nm Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử mẫu nghiên cứu b Hóa chất Thủy phân carbohydrate: - H SO 72% Pha thuốc thử DNS: - Hóa chất: DNS - Acid dinitrosaclicylic (C H N O ), NaOH, Potassium sodium tartrate (KNaC H O 4H O) - Cách pha thuốc thử DNS: cân 10g DNS hòa vào 300ml nƣớc cất, khuấy gia nhiệt khoảng 50 C Cân 10g NaOH hòa tan vào 150l nƣớc cất Đợi DNS tan hết, ta cho dung dịch NaOH vào khuấy Thêm từ từ 300g muối tactrate vào, gia nhiệt lên 80 C khuấy tan hết o o Định mức thành 1000ml bảo quản chai thủy tinh tối màu c Dựng đường chuẩn Dung dịch đƣờng chuẩn thí nghiệm: dung dịch đƣờng glucose có nồng độ 1mg/ml Hút dung dịch đƣờng theo bảng sau: Bảng4.2: Dựng đƣờng chuẩn Glucose Đối Hóa Chất chứng Glucose mg/ml (ml) Nƣớc cất (ml) 10 Nồng độ mg/ml 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Lắc đều, hút 0.3ml dung dịch từ ống, thêm vào 0.9ml thuốc thử DNS Đun 90oC 15 phút, có đậy nắp ống nghiệm Sau 15 phút, làm nguội nhanh, đo bƣớc sóng OD540nm Dựng đƣờng chuẩn Glucose Khi đo mẫu, tiến hành tƣơng tự theo tác nhƣ dựng đƣờng chuẩn  Tiến hành Chuẩn bị mẫu: - Mẫu rong đƣợc sấy đến khối lƣợng khơng đổi 105oC - Acid hóa carbohydrate thành đƣờng khử: - Cân xác 300mg mẫu khơ tuyệt đối vào chai thủy tinh chịu nhiệt - Thêm vào 3ml dung dịch H2SO4 72%, đậy nắp chai, lắc đều, để yên nhiệt độ phòng 30 phút - Sau 30 phút, thêm vào mẫu thử 51ml nƣớc cất để đạt đƣợc nồng độ H2SO4 4%, lắc - Hấp mẫu 121oC 60 phút - Đo hàm lƣợng đƣờng khử tạo thành: - Làm nguội mẫu sau hấp nhiệt độ phòng Lấy mẫu, pha lỗng với nồng độ thích hợp đo dƣờng khử bƣớc sóng OD540nm d Tính tốn Sau đo mẫu bƣớc sóng OD540nm máy dựa vào đƣờng chuẩn có sẵn, độ pha lỗng để tính tốn hàm lƣợng đƣờng khử có mẫu (mg/ml) Hàm lƣợng carbohydrate mẫu đƣợc tính nhƣ sau: X (%) = [(A x V) /m0] x 100 Trong đó: X: Hàm lƣợng carbohydrate % A: Hàm lƣợng đƣờng khử đo đƣợc (mg/ml) V: Thể tích dung dịch sau hấp (ml) mo: Trọng lƣợng mẫu (g) A.2 Xác định hàm lƣợng glucose: a Nguyên tắc Dựa vào phản ứng: Glucose bị oxi hóa xúc tác enzyme Glucose oxidase (GOD) tạo thành gluconic acid hydrogen peroxide (H2O2) H2O2 tác dụng với chloro-4phenol 4-amino-antipyrine (PAP) dƣới xúc tác enzyme peroxidase (POD) để tạo thành chất màu hồng quinoneimine Đo dung dịch bƣớc sóng 500nm để xác định glucose tạo thành b Hóa chất Lọ R1: hệ đệm enzyme: - Dung dịch đệm phosphate 150 mmol/L - Glucose oxidase (GOD) ≥ 20 000 UI/L - Peroxidase (POD) ≥ 1000 UI/L - 4-amino-antipyrine (PAP) 0.8 mmol/L Lọ R2: chromogen: - Chloro-4-phenol mmol/L Lọ R3: dung dịch chuẩn: - Glucose 100mg/DL (5.55 mmol/L) c Tiến hành: - Hòa tan lọ R1 R2 vào 200ml nƣớc, định mức tới 250ml  dung dịch GOD PAP - Hút ml dung dịch GOD – PAP vào ống Eppendorf + 10µl mẫu chứa glucose Ủ 20 phút sau tiến hành đo bƣớc sóng 500nm - Mẫu kiểm chứng: Tiến hành tƣơng tự mẫu trên, thay 10µl mẫu chứa glucose = 10µl Glucose 100mg/DL d Tính tốn: Tính tốn theo cơng thức: Nồng độ glucose mẫu = ODmẫu ODmẫu kiểm chứng × nồng độ mẫu kiểm chứng A.3 Xác định hàm lƣợng ethanol: a Nguyên tắc Dùng dung dịch Kali bicromat (K2Cr2O7) môi trƣờng acid để oxy hóa rƣợu tạo thành Cr3+ có màu xanh da trời 2C2H5OH + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 3CH3COOH + 2K2SO4 + 2Cr2(SO4)3 + 11H2O Tiếp theo dùng KI để khử kali bicromat thừa giải phóng Iod K2CR2O7 + 6KI + 7H2SO4 3I2 + 4K2SO4 + Cr2(SO4)3 + 7H2O Dùng dung dịch natrithiosufat (Na2S2O3) chuẩn lƣợng Iod sinh Từ tính đƣợc lƣợng Kali bicromat tham gia phản ứng với rƣợu thông qua lƣợng Na2S2O3 dùng chuẩn mẫu trắng mẫu thí nghiệm Dựa vào kết thu đƣợc tiến hành tính hàm lƣợng ethanol có bia b Hóa chất: - Dung dịch bicromat kali 0.1N - H2SO4 đậm đặc (d = 1.83 – 1.84) - KI tinh thể - Dung dịch Na2S2O3 0.1N - Chỉ thị hồ tinh bột 0.5% - Dung dịch KI 10% c Tiến hành: - Chuẩn bị dịch chƣng cất: Hút 10ml dịch lên men cho vào bình định mức tới 100ml đƣa vào bình chƣng cất chƣng cất dịch gần cạn đem dịch chƣng cất đƣợc, định mức trở lại 100ml - Xác định nồng độ ethanol: lấy 20ml dung dịch kali bicromat (K2Cr2O7) nồng độ 0.1N cho vào bình tam giác 500ml có nút nhám, thêm vào 5ml H2SO4 đậm đặc, cho tiếp 10ml mẫu chƣng cất đậy nắp bình tam giác, lắc phản ứng 15 phút - Sau lấy 20ml dung dịch KI 10% cho vào bình tam giác trên, lắc đặt vào chỗ tối để tránh tác dụng ánh sáng Sau 10 phút lấy ra, cho tiếp vào bình khoảng 100ml nƣớc cất thêm vài giọt thi5 hồ tinh bột 0.5% định phân I2 vừa đƣợc tạo thành dung dịch Na2S2O3 0.1N xuất màu xanh da trời (màu Cr2(SO4)3) - Song song với mẫu thí nghiệm trên, ta làm mẫu thí nghiệm trắng (thay dung dịch rƣợu chƣng cất nƣớc cất) d Tính tốn: Căn vào số lƣợng Na2S2O3giữa mẫu thí nghiệm mẫu kiểm chứng, ta suy lƣợng rƣợu chứa mẫu thí nghiệm là: 𝟐× (𝐀 − 𝐀𝐨 ) × 𝟏 𝟏𝟓 × 𝟏𝟎𝟎, 𝐦𝐠/𝟏𝟎𝟎𝐦𝐥 𝟏𝟎 Trong đó: Ao – số ml Na2S2O3 tiêu hao mẫu thí nghiệm A – số ml Na2S2O3 tiêu hao mẫu kiểm chứng 1.15 – lƣợng rƣợu tƣơng ứng với 1ml Na2S2O3 0.05N hay 1ml K2Cr2O7 0.05N A4 Phƣơng pháp xác định Nitơ tổng (phƣơng pháp Kjeldahl)  Ngun lý Vơ hóa mẫu H2SO4 đậm đặc chất xúc tác, sau dùng kiềm mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành thể tự Định lƣợng NH3 H2SO4 0,1N  Tiến hành - Đốt đạm: Cho 1g mẫu, 5g chất xúc tác (K2SO4 CuSO4) 10ml H2SO4 đậm đặc vào bình Kjeldahl đun bếp từ từ thu đƣợc dung dịch suốt không màu có màu xanh lơ CuSO4 để nguội  Q trình vơ hóa mẫu bình Kjelhdahl giải phóng khí SO2 nên phải tiến hành tử hút  Trong trình đốt nên đặt bình nằm nghiêng bếp - Cất đạm: Sau vô hóa mẫu hồn tồn, cho nƣớc cất vào bình Kjeldahl để tráng cho vào bình định mức 500ml, tráng rửa bình Kjeldahl phễu vài lần cho vào bình định mức cho khoảng 10÷15ml NaOH 40% vài giọt phenoltalein vào bình định mức, sau thêm nƣớc cất vừa đủ 300ml Chuẩn bị dung dịch bình hứng NH3: dùng pipet cho vào bình hứng khoảng 10ml acid Boric, sau lắp vào hệ thống cho đầu ống sinh hàn ngập dung dịch acid Boric Bắt đầu trình cất đạm dung dịch bình hứng đạt khoảng 150ml - Chuẩn độ: Lấy bình hứng đem chuẩn độ H2SO4 0,1N  Tính kết VH2SO4-V’H2SO4 𝐇à𝐦 𝐥ƣợ𝐧𝐠 𝐩𝐫𝐨𝐭𝐞𝐢𝐧 𝐭𝐡ô = 𝟎.𝟎𝟎𝟏𝟒∗ 𝐕𝐇𝟐𝐒𝐎𝟒−𝐕’𝐇𝟐𝐒𝐎𝟒 ∗𝟏𝟎𝟎∗𝟔.𝟐𝟓 𝒎 Phụ lục B Các môi trƣờng nuôi cấy, bảo quản bổ sung dinh dƣỡng cho nấm men  Môi trường YEPD (Yeast extract Pepton Dextrose) (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Glucose 20g Cao nấm men 10g Peptone 20g Nƣớc cất 1000ml Phụ lục C Các kết thí nghiệm bã rong Enteromorpha sp phƣơng pháp lên men SSF  ĐƢỜNG KHỬ Source DF SS MS F P yt1 10 8.4993 0.8499 13.91 0.000 Error 22 1.3438 0.0611 Total 32 9.8432 S = 0.2471 R-Sq = 86.35% R-Sq(adj) = 80.14% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+ 24.11 1.49 ( * ) 23.85 0.65 ( * ) 923.13 0.42 ( * ) 12 22.32 0.08 ( * ) 16 22.12 0.26 ( -* ) 20 21.44 0.55 ( * ) 24 21.33 0.22 ( * ) 28 21.03 0.04 ( * ) 32 20.55 0.10 ( * ) 36 20.24 0.07 ( * ) 40 20.24 0.14 ( * ) + -+ -+ -+ 7.80 8.40 9.00 9.60 Pooled StDev = 0.2471 Grouping Information Using Tukey Method yt1 N Mean Grouping 23.85 A 24.11 A 23.13 A B 12 22.32 A B C 16 22.12 A B C 20 21.44 B C D 24 21.33 B C D 28 21.03 CD 32 820.55 CD 40 20.24 D 36 20.24 D  ĐƢỜNG GLUCOSE Source DF SS MS F P yt1 10 1.323165 0.132317 132.80 0.000 Error 22 0.021920 0.000996 Total 32 1.345086 S = 0.03157 R-Sq = 98.37% R-Sq(adj) = 97.63% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -0 0.89147 0.06713 (-*) 0.37957 0.00000 (*-) 0.32616 0.00000 (*-) 12 0.25549 0.00942 (*-) 16 0.19455 0.00000 (-*) 20 0.18349 0.00000 (*-) 24 0.15291 0.00000 (*-) 28 0.16779 0.00000 (-*) 32 0.19208 0.03909 (-*) 36 0.22038 0.03201 (-*) 40 0.27180 0.06174 (-*) -+ -+ -+ -+ -0.25 0.50 0.75 1.00 Pooled StDev = 0.03157 Grouping Information Using Tukey Method yt1 N Mean Grouping 0.89147 A 0.37957 B 0.32616 B C 40 0.27180 CD 12 0.25549 CDE 36 0.22038 DEF 16 0.19455 DEF 32 0.19208 DEF 20 0.18349 DEF 28 0.16779 EF 24 0.15291 F  ETHANOL Source DF SS MS F P yt1 10 7.555885 0.755589 2883.25 0.000 Error 22 0.005765 0.000262 Total 32 7.561651 S = 0.01619 R-Sq = 99.92% R-Sq(adj) = 99.89% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -0 0.0000 0.0000 (*) 0.0200 0.0000 (* 0.0426 0.0000 *) 12 0.3208 0.0130 *) 16 0.4636 0.0260 *) 20 0.9072 0.0130 (* 24 1.1553 0.0130 (*) 28 1.1853 0.0260 (* 32 1.2004 0.0130 *) 36 1.1327 0.0260 *) 40 0.8621 0.0130 (* -+ -+ -+ -+ -0.00 0.35 0.70 1.05 Pooled StDev = 0.0162 Grouping Information Using Tukey Method yt1 N Mean Grouping 32 1.2004 A 28 1.1853 A 24 1.1553 A B 36 1.1327 B 20 0.9072 C 40 0.8621 C 16 0.4636 D 12 0.3208 E 0.0426 F 0.0200 F 0.0000 F