BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VŨ HUỲNH KIM LONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis, Araliaceae) THEO HƯỚNG TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN Ngành[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VŨ HUỲNH KIM LONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis, Araliaceae) THEO HƯỚNG TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN Ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Năm 2023 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nguyễn Minh Đức Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Giới thiệu luận án: a Lý tính cần thiết nghiên cứu Hiện nay, bệnh liên quan đến thận, suy thận cấp suy thận mạn tăng nhanh cộng đồng gây ảnh hưởng đến sức khỏe, chất lượng sống người bệnh, chí dẫn đến tử vong Các nguyên nhân dẫn đến suy thận đa dạng, có nguyên nhân tác dụng phụ thuốc thuốc chữa ung thư (cisplatin…), thuốc ức chế miễn dịch (cyclosporin A), kháng sinh (gentamicine, aminoglycosid…) Vì vậy, nhiều nghiên cứu thực nhằm hạn chế tác hại thuốc thận phục hồi chức thận bị giảm thuốc Sâm Việt Nam loài sâm quý đặc hữu Việt Nam Thành phần Sâm Việt Nam saponin khung dammarane, đặc biệt saponin khung ocotillol majonoside-R2, vina-ginsenoside-R2 chiếm hàm lượng cao Các saponin khung ocotillol chứng minh đóng vai trị tác dụng điều trị Sâm Việt Nam kháng ung thư, giảm stress, bảo vệ gan, kháng viêm… Bên cạnh đó, Sâm Việt Nam cịn chứa thành phần khác polyacetylene, polysaccharide, vitamin, khống chất, đó, thành phần polyacetylene đóng vai trị tác dụng chống oxy hóa kháng khuẩn Các nghiên cứu Sâm Việt Nam chế biến tác nhân nhiệt tiến hành cho thấy trình hấp làm tăng tác dụng chống oxy hóa, kháng khối u Sâm Việt Nam Tuy nhiên, thay đổi thành phần hóa học Sâm Việt Nam trồng qua q trình sinh trưởng chế biến chưa nghiên cứu nhiều Ngoài ra, tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam chưa chế biến Sâm Việt Nam chế biến nhiệt độ áp suất cao chưa nghiên cứu cơng bố Vì vậy, tiến hành nghiên cứu thay đổi thành phần hóa học Sâm Việt Nam q trình sinh trưởng, trình hấp nhiệt độ áp suất cao nghiên cứu thành phần hóa học Sâm Việt Nam chế biến theo hướng tác dụng bảo vệ thận b Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu thực với mục tiêu sau: - Đánh giá phát triển sinh khối tích lũy saponin trình phát triển Sâm Việt Nam trồng - Đánh giá thay đổi thành phần hóa học tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam qua trình hấp nhiệt độ áp suất cao - Nghiên cứu thành phần hóa học Sâm Việt Nam định hướng tác dụng bảo vệ thận - Đánh giá tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam c Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: - Thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam 2-7 tuổi trồng Trà Linh, Lâm Đồng - Thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam tuổi Phương pháp nghiên cứu - Định lượng saponin G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 HPLC-ELSD để đánh giá tích lũy saponin thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam - Khảo sát thay đổi thành phần hóa học Sâm Việt Nam qua q trình hấp HPLC-QToF-MS thống kê metabolomics - Khảo sát thay đổi tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam thời gian hấp khác nghiên cứu thành phần hóa học Sâm Việt Nam chế biến mơ hình in vitro với dịng tế bào thận LLC-PK1 sử dụng cisplatin làm tác nhân gây độc - Đánh giá tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam chế biến mơ hình in vivo sử dụng cyclosporin A làm tác nhân gây độc chuột nhắt trắng đánh giá tác dụng thông qua thông số BUN, creatinin huyết, MDA, GSH thận chuột - Đánh giá chế tác dụng bảo vệ thận panaxynol mơ hình in vitro in vivo với tác nhân gây độc thận cisplatin Trên mơ hình in vitro, thơng số đánh giá bao gồm mức độ sống tế bào, đánh giá q trình chết theo chu trình dịng chảy tế bào, đánh giá khả giảm viêm Western Blot Trên mơ hình in vivo, đánh giá số BUN, creatinine huyết, định lượng protein q trình viêm Real-time PCR d Những đóng góp nghiên cứu mặt lý luận thực tiễn Nghiên cứu khảo sát phát triển sinh khối tích lũy saponin Sâm Việt Nam phương pháp HPLC kết cho thấy Sâm Việt Nam sau năm trồng đạt sinh khối hàm lượng saponin tối đa thu hoạch Đề tài khảo sát tối ưu thông số cho phương pháp in vitro sử dụng dòng tế bào LLC-PK1 tác nhân cisplatin gây độc thận để đánh giá tác dụng bảo vệ thận Phương pháp đơn giản, rẻ tiền sử dụng để đánh giá hàng tác dụng bảo vệ thận hàng loạt mẫu thời gian ngắn Chúng khảo sát cho thấy trình hấp 120 °C làm tăng tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam Thời gian hấp 12 h cho tác dụng bảo vệ thận cao Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất có tác dụng bảo vệ thận bao gồm panaxynol, ocotillol genin, 20(S)-ginsenoside-Rh2, 20(R)-ginsenoside-Rh2, 20(S)ginsenoside-Rg3, 20(R)-ginsenoside-Rg3, ginsenosideRk1 ginsenoside-Rg5 Đây lần ginsenosideRh2 phân lập từ Sâm Việt Nam chế biến Đây lần saponin thuộc khung ocotillol ocotillol genin cơng bố có tác dụng bảo vệ thận Tác dụng bảo vệ thận hợp chất saponin phân lập so sánh kết cho thấy saponin khung protopanadiol cho tác dụng mạnh Đề tài phát ginsenoside có nhóm đường cho tác dụng bảo vệ thận mạnh, đồng phân dạng R cho tác dụng mạnh dạng S Tác dụng bảo vệ thận panaxynol chứng minh mơ hình in vitro cho thấy chế trình thơng qua việc giảm q trình apoptosis giảm trình viêm tế bào thận gây cisplatin Tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam chế biến chứng minh mơ hình in vivo với tác nhân gây độc cyclosporin A bên cạnh tác nhân cisplatin e Bố cục luận án Luận án gồm 151 trang: Mở đầu trang, tổng quan tài liệu 40 trang, nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết nghiên cứu 47 trang, bàn luận 30 trang, kết luận kiến nghị trang Tổng quan tài liệu a Sâm Việt Nam Sâm Việt Nam phát lần đầu vào năm 1973 vùng núi Ngọc Linh, tỉnh Quảng Nam đặt tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv thuộc họ Araliaceae Thành phần hóa học Sâm Việt Nam chủ yếu saponin thuộc khung protopanaxadiol (PPT), protopanaxatriol (PPD) đặc biệt saponin khung ocotillol (OT) với hàm lượng cao, hợp chất majonoside-R2 có hàm lượng >5 % Sâm Việt Nam chứng minh sở hữu nhiều tác dụng sinh học ứng dụng trị liệu kháng khuẩn, kháng oxy hóa, bảo vệ gan, chống stress, chống trầm cảm… Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam b Sự thay đổi thành phần hóa học saponin qua trình hấp Quá trình hấp tác nhân nhiệt độ làm thay đổi đáng kể thành phần hóa học lồi Sâm thuộc chi Panax Các q trình biến đổi bao gồm thủy phân nhóm đường khử nước vị trí C-20 ginsenoside khung PPT PPD để thu ginsenoside phân cực Các ginsenoside chứng minh có tác dụng sinh học mạnh ginsenoside nguyên thủy, đặc biệt tác dụng chống oxy hóa, chống khối u tác dụng bảo vệ thận Các nghiên cứu trước cho thấy saponin khung OT vị trí C-20 bị đóng vịng nên bị biến đổi trình hấp mà chủ yếu bị thủy phân nhóm đường thơng qua đường chế biến tác nhân vi sinh vật đường ruột c Bệnh thận tác dụng bảo vệ thận dược liệu chi Panax Thận quan quan trọng thể đóng vai trị đào thải nước tiểu cân nội mơi Về mặt giải phẫu, người có thận, thận phải nằm sát khung sườn 12 thấp thận trái Đơn vị thận nephrone đóng vai trị tiết nước tiểu, tái hấp thu thu động trì định nội mơi Bệnh suy thận tình trạng tổn thương thận làm suy giảm chức tiết nước tiểu, cô đặc nước tiểu bảo tổn chất điện giải cho thể Suy thận có hai loại suy thận cấp tính mạn tính Suy thận cấp tính tình trạng suy giảm nhanh chóng đột ngột khả lọc cầu thận với triệu chứng điển hình tăng creatinin BUN Một nguyên nhân gây suy thận thuốc cisplatin, cyclosporin A,… Suy thận mạn tính tình trạng tổn thương nhu mô thận từ từ, không hồi phục nặng dần Cisplatin thuốc chống ung thư sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh ung thư mơ cứng đầu, mặt, cổ, tinh hồn… Tuy nhiên, tác dụng phụ, độc tính thận nguyên nhân giới hạn việc sử dụng thuốc điều trị Cisplatin gây suy thận cấp thông qua chế gây stress oxy hóa tế bào biểu mơ thận, kích hoạt q trình viêm, gây chết theo chu trình (apoptosis) gây hoại tử (necrosis) tế bào biểu mô thận, dẫn đến suy thận cấp Các triệu chứng suy thận cấp cisplatin bao gồm giảm độ lọc cầu thận, tăng BUN creatinin huyết Bên cạnh cisplatin, cyclosporin A thuốc ức chế miễn dịch có tác dụng phụ gây độc tính thận, dẫn đến hoại tử tế bào thận suy thận cấp Nhân sâm sau trình chế biến tác nhân nhiệt làm tăng đáng kể tác dụng bảo vệ thận thông qua thử nghiệm độc tế bào tác nhân cisplatin Các nghiên cứu mặt hóa học hướng tác dụng bảo vệ thận cho thấy tác dụng bảo vệ thận chủ yếu đến từ saponin phân cực sinh trình chế biến ginsenoside-Rk3, -Rh4, -Rg3, -Rk1, -Rg5 Đối tượng phương pháp nghiên cứu a Đối tượng nghiên cứu - Thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam 2-7 tuổi thu hái Trạm Dược liệu Trà Linh, Quảng Nam, sấy khô nhiệt độ 60 °C, tách riêng thân rễ, rễ củ xay thành bột có kích thước 0,5 mm - Thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam tuổi thu hái Trạm Dược liệu Trà Linh, Quảng Nam, sấy khô nhiệt độ 60 °C xay thành bột có kích thước 10 mm b Phương pháp nghiên cứu i Kiểm nghiệm nguyên liệu - Kiểm nghiệm vi học: kiểm nghiệm vi phẫu thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam, soi bột rễ Sâm Việt Nam - Định tính sắc ký lớp mỏng: định tính sắc ký lớp mỏng silica gel với hai hệ dung môi chloroform-methanolnước (65:35:10, lớp dưới) n-butanol-nước-acid acetic (4:5:1, lớp trên) - Định lượng phương pháp HPLC-ELSD: thăm dị quy trình chiết xuất, tinh chế qua cột chiết pha rắn (SPE) Quy trình thẩm định với tiêu: tính tương thích hệ thống, độ chọn lọc, độ lặp lại, độ Quy trình áp dụng để đánh giá tích lũy saponin thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam 2-7 tuổi định lượng hàm lượng saponin nguyên liệu ii Xây dựng quy trình thử nghiệm tác dụng bảo vệ thận in vitro Mơ hình thử nghiệm tác dụng bảo vệ thận in vitro sử dụng tế bào biểu mô thận lợn LLC-PK1 với tác nhân gây độc cisplatin Nghiên cứu tối ưu hóa số thông số sau: - Xác định nồng độ cisplatin gây độc: 20, 25, 30, 40, 50 100 µM Nồng độ tối ưu mức độ sống tế bào 11 khoảng 50 % - Xác định mật độ tế bào: 1×104, 2×104, 3×104 tế bào/giếng Mật độ tối ưu mức độ sống tế bào khoảng 50 % - Xác định nồng độ chứng dương N-acetylcystein phục hồi tế bào bị giảm độc tính cisplatin - Thử nghiệm nồng độ dimethylsulfoxide (DMSO) sử dụng Nồng độ tối ưu mức độ sống tế bào khơng tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm khơng có DMSO iii Phân tích thay đổi thành phần hóa học tác dụng sinh học Sâm Việt Nam qua trình chế biến - Chế biến chiết xuất: Bột Sâm Việt Nam (100 mg) hấp cóng thép với ml nước cất 120 °C thời gian 0-20 h Bột dược liệu sau hấp chiết với MeOH cô áp suất giảm thu cao Sâm Việt Nam chế biến Các cao hòa DMSO thành dung dịch mẹ có nồng độ 100 mg/ml - Đánh giá thay đổi thành phần hóa học Sâm Việt Nam qua trình chế biến: Dung dịch mẹ pha loãng methanol với tỷ lệ 1:1000 phân tích UPLC-QToF-MS chế độ ion dương, diện tích đỉnh peak xử lý thống kê đa biến công cụ Metaboanalyst 5.0 - Đánh giá thay đổi tác dụng bảo vệ thận Sâm 12 Việt Nam qua trình chế biến: Cao chiết Sâm Việt Nam đánh giá tác dụng bảo vệ thận nồng độ 0-200 µg/ml mơ hình in vitro xây dựng Đánh giá điều kiện hấp Sâm Việt Nam cho tác dụng mạnh iv Nghiên cứu thành phần hóa học Sâm Việt Nam hướng tác dụng bảo vệ thận - Bột Sâm Việt Nam (45 g) hấp điều kiện tối ưu xác định, sau đơng khơ chiết methanol phương pháp siêu âm Dịch chiết cô áp suất giảm thu cao khô Sâm Việt Nam chế biến Cao khô đánh giá tác dụng bảo vệ thận so sánh với cao Sun Ginseng công ty Ginseng Science (Hàn Quốc) cung cấp - Cao khô phân tách thành phân đoạn nhỏ phương pháp lắc phân bố, sắc ký cột silica gel Các phân đoạn đánh giá tác dụng bảo vệ thận mơ hình in vitro Phân đoạn tiềm phân tách sắc ký lỏng bán điều chế để thu hợp chất tinh khiết - Các hợp chất sau phân lập xác định phương pháp phổ nghiệm MS NMR so sánh tác dụng bảo vệ thận mơ hình in vitro v Đánh giá tác dụng bảo vệ thận panaxynol mơ hình in vitro in vivo - Cơ chế tác dụng bảo vệ thận hợp chất panaxynol 13 theo hướng giảm apoptosis định lượng phương pháp dòng chảy tế bào Mức độ giảm phosphoryl hóa protein JNK, p38 mức độ biểu cleaved caspase-3 panaxynol trước độc tính cisplatin đánh giá phương pháp Western Blot - Hợp chất panaxynol đánh giá tác dụng bảo vệ mơ hình in vivo sử dụng chuột đực C57/BL6 tuần tuổi Chuột cho uống panaxynol liều 10 mg/kg 50 mg/kg N-acetylcyctein liều 1000 mg/kg ngày Vào ngày 2, chuột tiêm cisplatin với liều 16 mg/kg đường tiêm phúc mô Vào ngày 5, chuột gây mê lấy máu từ tim để định lượng BUN creatinin Thận cô lập khảo sát RT-PCR biểu chemoattractant cyclooxygenase-2, protein-1 monocyte hypoxanthine phosphoribosyltransferase-1 vi Đánh giá tác dụng bảo vệ thận cao chiết Sâm Việt Nam chế biến mơ hình in vivo với tác nhân gây độc cyclosporin A - Bột rễ Sâm Việt Nam (30 g) phân tán với 200 g nước cất hấp autoclave 105 °C h, sau làm nguội đơng khơ thu bột Sâm Việt Nam chế biến Bột Sâm Việt Nam chế biến chiết với methanol 70 % phương pháp siêu âm Dịch chiết cô áp suất giảm thu 15 14 g cao khô Sâm Việt Nam chế biến có độ ẩm 4,5 % Chuột nhắt trắng Swiss albino đực (7-8 tuần tuổi) - dùng cho nghiên cứu Chuột chia thành lô bao gồm: Lô sinh lý: uống nước cất; Lô chứng bệnh: uống nước cất; Lô chứng dương: uống NAC liều 100 mg/kg; Lô Sâm Việt Nam: uống cao Sâm Việt Nam liều 100 mg/kg; Lô Sâm Việt Nam chế biến: uống cao Sâm Việt Nam chế biến liều 100 mg/kg - Chuột cho uống nước cất NAC mẫu thử Sâm Việt Nam lần/ngày 14 ngày liên tiếp Vào ngày 12, 13, 14, chuột lô sinh lý tiêm phúc mạc nước cất pha tiêm, chuột lơ cịn lại tiêm phúc mạc cyclosporin A pha nước cất pha tiêm liều 100 mg/kg với thể tích tiêm 10 ml/kg Ngày 15, chuột gây ngạt đá CO2, mổ lấy máu tim để định lượng ure creatinin huyết tương, thận tách ra, nghiền đồng thể KCl 1,15% để định lượng malonyl aldehyde (MDA) glutathion (GSH) Kết a Kiểm nghiệm nguyên liệu i Vi học: Vi phẫu cấu tử Sâm Việt Nam có đặc điểm mơ tả Dược điển Việt Nam V ii Định tính sắc ký lớp mỏng: Trên mỏng hai hệ dung môi, sắc ký đồ mẫu thử có vết có màu sắc Rf tương đương với vết chuẩn G- 15 Rb1, G-Rg1, M-R2, V-R2 iii Định lượng HPLC-ELSD: Quy trình định lượng tối ưu hóa bao gồm quy trình chiết quy trình tinh chế Phương pháp định lượng thẩm định đạt tiêu chí Tính tương thích hệ thống, Độ chọn lọc, Độ xác Độ Quy trình định lượng ứng dụng để đánh giá tích lũy saponin kết cho thấy hàm lượng saponin tăng nhanh thời gian 2-4 tuổi, sau thay đổi khơng đáng kể Quy trình ứng dụng để định lượng saponin nguyên liệu Sâm Việt Nam hàm lượng saponin G-Rg1, M-R2, G-Rb1 G-Rd 3,95 %; 5,76 %; 1,51 % 0,74 % Tổng hàm lượng saponin 11,96 % b Đánh giá thay đổi thành phần hóa học tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam qua q trình chế biến i Thành phần hóa học: Quá trình hấp làm giảm ginsenoside phân cực khung protopanaxadiol protopanaxatriol xuất ginsenoside phân cực Các saponin khung ocotillol giảm chậm bắt đầu xuất ocotillol genin Phân tích metabolomics cho thấy trình hấp từ 2-12 h làm thay đổi đáng kể thành phần hóa học Sâm Việt Nam Khi tăng thời gian hấp lên 12-20 h, thành phần hóa học thay đổi không đáng kể Hàm lượng ginsenoside phân cực tăng cao thời điểm 12 h, 16 hàm lượng ocotillol genin tiếp tục tăng đến thời điểm 20 h ii Tác dụng bảo vệ thận: Khả phục hồi tế bào thận dịch chiết Sâm Việt Nam chế biến (PVG) nồng độ 200 µg/ml tăng dần theo thời gian hấp đạt cao thời điểm 12 h, giúp tăng tỷ lệ sống tế bào từ 50,9 % lên 86,4 % Khi tăng thời gian hấp, tỷ lệ tế bào sống khơng tăng thêm Vì vậy, điều kiện hấp 120 °C 12 h lựa chọn để chế biến Sâm Việt Nam hướng tác dụng bảo vệ thận Ở nồng độ 100 µg/ml, PVG cho khả phục hồi tế bào sống khoảng 80 %, cao so với cao chiết Sun Ginseng (66,1 %) c Nghiên cứu thành phần hóa học Sâm Việt Nam hướng tác dụng bảo vệ thận - Bột Sâm Việt Nam (45 g) hấp ở 120 °C 12 h sau chiết thu hồi dung môi thu 27 g cao khô PVG Cao chiết phân bố với dung môi diethyl ether (Et), ethyl acetate (EA), n-butanol bão hòa nước (Bu) Các phân đoạn đánh giá tác dụng bảo vệ thận kết cho thấy phân đoạn Et EA cho tác dụng mạnh Vì hai phân đoạn lựa chọn để tiếp tục phân tách - Từ phân đoạn Et phân tách cột silica gel thu phân đoạn Et1-Et8, phân đoạn Et3 Et5 cho tác dụng mạnh Từ phân đoạn Et3 phân tách cột silica gel thu hợp chất panaxynol có tác dụng bảo vệ thận Từ 17 phân đoạn Et5 thu hợp chất ocotillol genin thể tác dụng bảo vệ thận - Phân đoạn EA phân tách sắc ký cột silica gel thu phân đoạn EA1-EA6, phân đoạn EA4 EA6 thể tác dụng bảo vệ thận Từ phân đoạn EA4 phân lập sắc ký lỏng điều chế (prep-HPLC) thu hợp chất 20(S) 20(R)-ginsenoside-Rh2 có tác dụng bảo vệ thận Phân đoạn EA6 hòa methanol thu phần không tan 20(R)-G-Rg3 có tác dụng bảo vệ thận Phần dịch phân tách prep-HPLC thu hợp chất 20(S)-G-Rg3, G-Rk1 G-Rg5 thể tác dụng bảo vệ thận - Các hợp chất phân lập xác định cấu trúc phổ MS độ phân giải cao, 1H 13C-NMR so sánh tác dụng bảo vệ thận thông qua nồng độ phục hồi 50 % tỷ lệ tế bào bị (RC50) Kết cho thấy hợp chất panaxynol có tác dụng mạnh với RC50 = 6,18 ± 3,84 µM Đồng phân 20(R) G-Rh2 G-Rg3 có tác dụng bảo vệ thận mạnh với RC50 6,67 ± 0,42 µM 8,39 ± 0,3 µM, thấp đồng phân dạng 20(S) 8-10 lần 20(S)-G-Rg3, tiền chất G-Rk1, có RC50 = 88,4 ± 54,62 µM, cao 1,4 lần so với G-Rk1 (RC50 = 62,60 ± 17,3 µM) Tuy nhiên, đồng phân G-Rk1 G-Rg5 lại có RC50 = 180,83 ± 33,27 µM, cao gấp lần G-Rk1 OT có RC50 cao (226,19 ± 66,16 µM) thấp 6,8 lần so với chứng dương N- 18 acetylcystein với RC50 = 1543,6 ± 74,07 µM d Đánh giá tác dụng bảo vệ thận in vitro in vivo panaxynol - Trên mơ hình in vitro, phương pháp đo dịng chảy tế bào, cisplatin 25 µM làm tăng tỷ lệ tế bào bị apoptosis lên 39,96 ± 1,76 %, panaxynol nồng độ µM µM làm giảm tỷ lệ tế bào bị apoptosis 26,23 ± 1,51 % 15,96 ± 1,53 % Điều cho thấy panaxynol có tác dụng bảo vệ thận thông qua đường giảm apoptosis Bằng phương pháp Western Blot, kết cho thấy panaxynol µM µM làm giảm biểu JNK, p38 bị phosphoryl hóa caspase-3 bị phân cắt - Trên mơ hình in vivo, panaxynol làm tăng đáng kể khối lượng thể, phục hồi chức thận thông qua việc làm giảm BUN creatinin huyết tăng lên cisplatin Bên cạnh đó, panaxynol làm giảm phản ứng viêm tế bào thận gây cisplatin, mức độ biểu COX-2 mRNA MCP-1 mRNA đánh giá RT-PCR e Đánh giá tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam chế biến mơ hình in vivo - Đối với tác nhân cyclosporin A gây độc, Kết cho thấy cyclosporin A tiêm phúc mạc liều 100 mg/kg làm suy giảm đáng kể chức thận thông qua việc làm tăng số BUN 70,2 % từ 8,42 mM lên 14,33 mM, tăng số creatinin huyết 93,1 % từ 44,87 mM lên 86,64 mM Cao chiết Sâm Việt Nam chưa chế biến liều 100 19 mg/kg giúp phục hồi số BUN creatinin xuống 10,76 mM 62,29 mM tương đương với chứng dương NAC liều 100 mg/kg Cao chiết Sâm Việt Nam chế biến liều 100 mg/kg phục hồi số BUN creatinin huyết xuống tương đương với lô sinh lý với nồng độ 8,61 mM 47,92 mM - Trên thử nghiệm stress oxy hóa mơ thận, cysclosporin làm giảm 29,2 % lượng GSH tăng 33,1 % lượng MDA so với lô sinh lý Cả chứng dương N-acetylcystein, cao chiết Sâm Việt Nam Sâm Việt Nam chế biến liều 100 mg/kg phục hồi lượng GSH bị giảm cyclosporin A tương đương với lô sinh lý Tuy nhiên, số MDA, có cao chiết Sâm Việt Nam chế biến làm giảm đáng kể hàm lượng MDA so với lô chứng bệnh Kết luận kiến nghị i Kết luận Sau trình thực nghiên cứu, đề tài thu kết sau: Đánh giá phát triển sinh khối tích lũy saponin thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam − Đã nghiên cứu động thái tích lũy saponin thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam 2-7 tuổi trồng Trà Linh, Quảng Nam phương pháp HPLC-ELSD cho thấy thời điểm năm sau trồng, thân rễ rễ củ đạt hàm lượng saponin cao thay đổi không đáng kể 20 năm sau Ở thời điểm 4-7 tuổi, hảm lượng saponin thay đổi không đáng kể Trong đó, phát triển sinh khối thân rễ rễ củ Sâm Việt Nam tăng nhanh thời gian 2-5 tuổi sau tăng khơng đáng kể Nghiên cứu thành phần hóa học Sâm Việt Nam định hướng tác dụng bảo vệ thận − Nghiên cứu xác định thông số phương pháp thử nghiệm tác dụng bảo vệ thận in vitro dòng tế bào LLC-PK1 với tác nhân gây độc cisplatin bao gm liu cisplatin 20 àM, mt t bo 1ì104 tế bào/giếng, nồng độ DMSO tất giếng kiểm soát mức 0,2 %, chứng dương dùng N-acetylcystein liều 1.000 µM − Q trình hấp Sâm Việt Nam 120 °C từ 0-20 h làm thay đổi thành phần hóa học tác dụng sinh học o Về mặt hóa học: Phân tích LC-QToF-MS với metabolomics cho thấy thời gian hấp từ 0-12 h làm thay đổi đáng kể thành phần hóa học, tăng thời gian hấp lên 20 giờ, thay đổi hóa học dịch chiết Sâm Việt Nam khơng đáng kể Q trình hấp làm chuyển hóa ginsenosid khung protopanaxadiol protopanaxatriol thành saponin phân cực Các saponin khung ocotillol vina-ginsenosid-R2, majonosid-R2 giảm chậm với tạo thành ocotillol genin 21 o Về mặt sinh học: Tác dụng bảo vệ thận dịch chiết Sâm Việt Nam tăng lên với thời gian hấp đạt tối đa thời điểm 12 h Khi tăng thời gian hấp lên 12 h, tác dụng bảo vệ thận khơng tăng lên Vì 12 h xem thời gian hấp tối ưu để dịch chiết Sâm Việt Nam đạt tác dụng bảo vệ thận tối đa − Đề tài phân lập hợp chất có tác dụng bảo vệ thận từ dịch chiết Sâm Việt Nam chế biến bao gồm: panaxynol, 20(S) 20(R)-ginsenosid-Rh2, 20(S) 20(R)-ginsenosid-Rg3, ginsenosid-Rk1, ginsenosid-Rg5, ocotillol genin − Đã so sánh tác dụng bảo vệ thận hợp chất phân lập được, hợp chất panaxynol có tác dụng mạnh với RC50 6,18 ± 3,84 µM Ocotillol genin hợp chất có RC50 cao xem đặc trưng Sâm Việt Nam chế biến có tác dụng bảo vệ thận Đánh giá tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam chế biến mô hình in vivo − Trên mơ hình in vivo với tác nhân gây độc cyclosporin A, cao Sâm Việt Nam chế biến thể tác dụng bảo vệ thận rõ rệt thông qua việc giảm hàm lượng BUN creatinin huyết, giảm hàm lượng MDA phục hồi hàm lượng GSH tế bào thận Đánh giá tác dụng bảo vệ thận panaxynol mơ hình in vitro in vivo 22 Trên mơ hình in vitro, panaxynol làm giảm tỷ lệ tế bào chết theo chu trình (apoptosis) gây cisplatin thông qua chế làm giảm biểu protein caspase-3 bị phân cắt, giảm phosphoryl hóa protein JNK, p53 Trên mơ hình in vivo, panaxynol cải thiện chức thận thông qua làm giảm số BUN creatinin huyết chuột tăng lên độc tính cisplatin thận Về mặt chế, panaxynol làm giảm phản ứng viêm gây cisplatin thông qua làm giảm biểu COX-2 mRNA ii Kiến nghị − Nghiên cứu tác dụng bảo vệ thận Sâm Việt Nam chế biến phương pháp khác tác nhân vi ba lên men bên cạnh sử dụng tác nhân nhiệt − Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng xây dựng tiêu chuẩn cho Sâm Việt Nam chế biến áp suất nhiệt độ cao − Tiếp tục nghiên cứu phân đoạn, phân đoạn phân cực để tìm hợp chất khác có tác dụng bảo vệ thận − Nghiên cứu dạng bào chế từ Sâm Việt Nam chế biến hợp chất có tác dụng để bào chế thành sản phẩm có tác dụng phịng điều trị suy thận độc tính cisplatin 23 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Lê Thanh Tuyền, Vũ Huỳnh Kim Long, Lê Thị Hồng Vân, Nguyễn Minh Đức, Đỗ Thị Hồng Tươi (2020), “Khảo sát tác động bảo vệ thận Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae) chuột nhắt gây tổn thương thận cyclosporin A”, Tạp chí Dược học, số (số 526 năm 60), trang 64-67 TẠP CHÍ QUỐC TẾ Kim Long Vu-Huynh, Huy Truong Nguyen, Thi Hong Van Le, Chi Thanh Ma, Gwang Jin Lee, Sung Won Kwon, Jeong Hill Park, Minh Duc Nguyen (2020), "Accumulation of Saponins in Underground Parts of Panax vietnamensis at Different Ages Analyzed by HPLC-UV/ELSD", Molecules, 25 (13), 3086 Kim Long Vu-Huynh, Thi Hong Van Le, Huy Truong Nguyen, Hyung Min Kim, Ki Sung Kang, Jeong Hill Park, Minh Duc Nguyen (2019), "Increase in Protective Effect of Panax vietnamensis by Heat Processing on Cisplatin-Induced Kidney Cell Toxicity", Molecules, 24 (24), 4627 Dahae Lee, Jaemin Lee, Kim Long Vu-Huynh, Thi Hong Van Le, Thi Hong Tuoi Do, Gwi Seo Hwang, Jeong Hill Park, Ki Sung Kang, Minh Duc Nguyen, Noriko Yamabe (2019), "Protective Effect of Panaxynol Isolated from Panax vietnamensis against CisplatinInduced Renal Damage: In Vitro and In Vivo Studies", Biomolecules, (12), 890 24