Nghiễn cứu sự tác động ức chế của hợp chất triterpennoid saponin phân lập từ cây ardisia gigantifolia lên tế bào ung thư dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐÀM QUỐC ĐẠT NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT TRITERPENOID SAPONIN PHÂN LẬP TỪ CÂY ARDISIA GIGANTIFOLIA LÊN TẾ BÀO UNG THƢ DẠ DÀY TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 THÁI NGUYÊN, 2022 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Bảo Ngọc Phản biện 1: TS Nguyễn Thy Ngọc Phản biện 2: TS Phạm Bằng Phương Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn họp tại: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Vào hồi 09 00 ngày 23 tháng 01 năm 2022 Có thể tìm hiểu luận văn trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên Và thư viện Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việt Nam quốc gia có nguồn thực vật phong phú đa dạng với hàng ngàn thuốc ghi nhận vốn tri thức địa đồng bào dân tộc khác Cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia) phân bố nhiều nơi khác khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam, sử dụng phổ biến dân gian thuốc hữu hiệu điều trị số bệnh dày Triterpenoid saponin hợp chất chuyển hóa thứ cấp Trong năm gần đây, quan tâm đến Triterpenoid saponin tác dụng chúng tế bào khối u ngày tăng Đã có nghiên cứu chứng minh rằng, Triterpenoid saponin có hoạt tính chống ung thư phổ rộng, ức chế tăng sinh gây trình apoptosis khối u tế bào, giảm hoạt động xâm lấn tế bào ung thư; số dạng Triterpenoid saponin thể tác dụng chống viêm Một số hợp chất triterpenoid saponin Ardisia gigantifolia phân lập công bố vài tác giả khác nhiên, nghiên cứu khả ức chế ung thư dày chúng cịn hạn chế Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác động ức chế hợp chất Triterpenoid saponin phân lập từ Ardisia gigantifolia lên tế bào ung thư dày’’ Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá tác động ức chế hợp chất triterpenoid saponin phân lập từ Lá khôi Ardisia gigantifolia lên kiểu hình, sinh trưởng, biểu số gen tế bào gốc, apoptosis trình lão hóa tế bào ung thư dày mơ hình ni cấy in vitro Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thư dày AGS Nội dung 2: Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khơi lên khả sống sót tế bào AGS môi trường nuôi cấy Nội dung 3: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khôi lên biểu marker tế bào gốc ung thư dày CD44 Nội dung 4: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khôi lên biểu gen tế bào gốc ung thư Nội dung 5: Đánh giá tác động triterpenoid saponin từ Lá khơi lên hình thành turmosphere từ tế bào gốc ung thư dày AGS Nội dung 6: Nghiên cứu tác động triterpenoid saponin từ Lá khơi lên lão hóa tế bào tế bào ung thư dày AGS môi trường nuôi cấy 2 CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Lá khôi 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Thành phần hóa học Lá khơi 1.1.3 Tác dụng y học Lá khôi 1.2 Khái quát triterpenoid triterpenoid saponin 1.2.1 Giới thiệu chung triterpenoid saponin Hình 1.1 Các kiểu cấu trúc phổ biến triterpenoid Một lượng đáng kể triterpenoid saponin tìm thấy loại thực phẩm đậu, đậu nành, rau bina, đậu lăng yến mạch Thêm vào đó, chúng tìm thấy nhiều loại thực vật có giá trị Nhân sâm Radix et Rhizoma, Radix et Rhizoma glycyrrhizae, Radix astragli Những loại thuốc theo truyền thống sử dụng để điều trị số bệnh khác bao gồm ung thư, tiểu đường, bệnh tim mạch, nhiễm virus nhiễm khuẩn 1.2.2 Vai trò triterpenoid saponin ức chế tăng sinh tế bào ung thư Các sản phẩm từ tự nhiên nguồn quan trọng chứa đựng hợp chất có hoạt tính sinh học Một tỷ lệ lớn loại thuốc đại phát triển từ sản phẩm tự nhiên chất tương tự dạng tổng hợp Trong năm gần đây, nhiều triterpenoid saponin tự nhiên phát có tác dụng ức chế tế bào ác tính in vitro in vivo phát Các đặc tính chống ung thư chế tiềm sàng lọc rộng rãi nhiều loại tế bào ung thư nuôi cấy in vitro bao gồm dòng tế bào ung thư bàng quang, máu, não, vú, cổ tử cung, màng đệm, ruột kết, thực quản, gan, tuyến tụy, tuyến tiền liệt, dày, buồng trứng, biểu mô miệng, da sarcoma Đặc biệt, số saponin triterpenoid quan sát thấy có độ nhạy cao tế bào ung thư so với tế bào bình thường, cho thấy khả an tồn chúng chất chống ung thư có tính chọn lọc Hơn nữa, tính chống ung thư triterpenoid saponin đánh giá mơ hình động vật khác mang khối người động vật Đáng lưu ý, saponin triterpenoid thử nghiệm thường dung nạp tốt động vật với liều lượng gây thoái triển khối u khơng có độc tính quan sát được, chẳng hạn tổn thương quan thay đổi trọng lượng thể thay đổi trọng lượng thể Các chất chống ung thư thơng thường có độc tính cao khơng tế bào khối u mà tế bào bình thường Do đó, hợp chất chống ung thư tự nhiên cung cấp thay hấp dẫn cho hợp chất tổng hợp tính hiệu an tồn chúng [7] Năm 2010, nhóm nghiên cứu Li lần xác định hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khơi [8] Tiếp đến, nhóm nghiên cứu tiến hành thử độc tố tế bào hợp chất tế bào Hela, tế bào ung thư gan xác định số IC50 dao động từ 1,9 - 4,8 μM [9] Bên cạnh đó, Li cộng chứng minh dịch chiết ethanol từ Lá khôi giàu triterpenoid saponin có khả ức chế chu kỳ phân chia tế bào tế bào ung thư vú MCF-7 Đối với ung thư dày, có công bố Chun cộng Đại học Seun Hàn Quốc đề cập đến khả cảm ứng apoptosis đại thực bào hợp chất triterpenoid saponin phân lập từ Adenophora triphylla [8] 1.2.3 Triterpenoid saponin ức chế xâm lấn di điều hòa giảm số lượng tế bào gốc ung thư Mặc dù điều trị nhiều phương pháp khác phẫu thuật, hóa trị xạ trị, xong ung thư người với mức độ xâm lấn cao chỗ di xa dẫn tới tiên lượng xấu Sự xâm lấn di ung thư q trình sinh hóa phức tạp gồm nhiều bước, liên quan đến thay đổi sinh lý bệnh học khác Với việc xác định mục tiêu phân tử có liên quan chặt chẽ đến xâm lấn di căn, phát triển chất chống xâm lấn chống ung thư kỳ vọng mang tới chiến lược điều trị quan trọng cho bệnh ung thư [7] Các triterpenoid saponin đa dạng khác nhau, đáng ý Ardipusilloside I, Kalopanaxsaponin-A, Platycodin D, Rddeanin A, Rd, Rg3, Rh1 Saikosaponin-D thể đặc tính chống xâm lấn chống di đáng kể nhóm tế bào ung thư người nghiên cứu in vitro in vivo cách can thiệp vào đường tín hiệu chất trung gian phân tử liên quan đến xâm lấn di Ginsenoside Rd, sử dụng nồng độ từ 10 đến 100 μM, khơng có tác dụng gây độc tế bào tế bào ung thư gan HepG2 di cao kìm hãm đáng kể di cư xâm lấn tế bào ung thư Có nghiên cứu cho thấy giảm biểu MMP-1, MMP-2 MMP-7 thông qua việc bất hoạt gen MAPK (ERK1/2, JNK p38) yếu tố phiên mã AP-1, với ức chế q trình chuyển dịch biểu mô thành trung mô (EMT) với đặc điểm tăng biểu E-cadherin giảm biểu N-cadherin Ngoài ra, Rg3 ức chế di chuyển tế bào ung thư thơng qua kích hoạt p38 điều hòa giảm protein kênh aquaporin [10] Sử dụng triterpenoid saponin liệu pháp chống xâm lấn chống ung thư đánh giá rộng rãi chuột không lông (nude) mang số loại tế bào ung thư người Ví dụ, cho uống Kalopanaxsaponin-A (1 mg/kg, ba lần tuần 25 ngày) ức chế phát triển khối u chuột mang tế bào ung thư biểu mô vảy YD-10B làm giảm biểu số protein tham gia vào trình xâm nhập MMP-9, HuR, Rab1A [11] Tương tự, Platycodin D, dùng liều lượng mg/kg màng bụng 20 ngày, ức chế đáng kể phát triển ung thư vú di MDA-MB-231 chuột cấy ghép khối u Nhìn chung, kết cho thấy triterpenoids Kalopanaxsaponin-A, Platycodin D, Rd, Rg3 ứng cử viên tiềm chống xâm lấn chống ung thư ung thư vú, gan, tuyến tiền liệt ung thư miệng [12] Tế bào gốc ung thư với đặc tính đặc biệt khả tự làm (self renewal) có khả nhân đôi mạnh mẽ, xác định số bệnh ung thư khác người Chúng coi nguồn gốc trình sinh ung thư, tái phát di có liên quan đến việc kháng lại liệu pháp điều trị ung thư phổ biến Do đó, việc nhắm đích cụ thể loại trừ quần thể tế bào gốc ung thư kỳ vọng xem cách tiếp cận hiệu điều trị ung thư xu thế Một nghiên cứu rằng, chuột cấy ghép khối u phổi điều trị cách cho uống 500 ppm β-escin (một loại triterpenoid saponin) ức chế đáng kể hình thành khối u [10] Trong nghiên cứu khác, điều trị β-escin chuột cấy ghép tế bào ung thư phổi H460 người cho thấy giảm rõ rệt số lượng tế bào bào gốc (tế bào biểu ALDH) Nhóm nghiên cứu β-escin tăng cường biểu p21 tế bào ung thư phổi Những kết cho thấy ngăn cản phát triển tế bào gốc ung thư chế quan trọng hoạt động β-escin [13] 1.3 Ung thƣ dày Việt Nam nước có tỷ lệ mắc ung thư dày cao giới Tỷ lệ mắc ung thư dày Việt Nam hàng năm khoảng 15,9 trường hợp/100.000 dân [14] Một nghiên cứu thực khu vực khác Việt Nam tỷ lệ mắc ung thư dày Việt Nam cao so với Nhật Bản năm 2002 (31,3 so với 28,7 100.000 dân [15] Vai trò H pylori ung thư dày nghiên cứu rộng rãi, đáng ý chủng H pylori dương tính với CagA có liên quan chặt chẽ với phát triển ung thư dày Việt Nam [16] Tổng số trường hợp mắc năm 2018 17.527 trường hợp, nam giới 11.161 trường hợp nữ giới 6.366 trường hợp Tỷ lệ chết ung thư dày Việt Nam chiếm tỷ lệ cao (13,4 100.000 dân) Một nguyên nhân dẫn tới tỷ lệ mắc ung thư dày cao Việt Nam số quốc gia châu Á khác có liên quan đến lưu hành chủng vi khuẩn Helicobacter pylori đặc trưng Đông Á Bên cạnh đó, thói quen ăn mặn, ăn đồ hun khói, thịt đỏ uống nhiều rượu bia cho nguyên nhân làm tăng tỷ lệ mắc ung thư dày Tỷ lệ trường hợp ung thư dày có tính gia đình chiếm khoảng 10% [17] Hầu hết trường hợp mắc ung thư dày Việt Nam phát giai đoạn muộn nguyên nhân quan trọng làm tăng tỷ lệ chết bệnh nhân Hiện nay, giới có hệ thống phân loại khác sử dụng để phân loại ung thư dày gồm hệ thống Bormann, hệ thống phân loại Nhật Bản, hệ thống WHO hệ thống Laurén Trong hệ thống này, hệ thống Laurén sử dụng phổ biến tính đơn giản tiện lợi Theo hệ thống phân loại Laurén, ung thư dày phân thành týp týp ruột (intestinal type) týp phân tán (diffuse type) Týp ruột phổ biến xác định đặc điểm gồm cấu trúc hình ống nhiều lớp với tế bào có khả phân chia Týp phân tán xác định với đặc điểm gồm tế bào hình dạng nhẫn có tương đồng cao hình dạng kích thước nhân khả phân chia tế bào Ung thư dày týp ruột chủ yếu cho bắt nguồn từ nhiễm H pylori cịn týp phân tán lại chủ yếu liên quan tới đột biến di truyền gen cdh1 mã hố cho protein E-caderin, đóng vai trị gắn kết tế bào với tế bào [18] Trong nguyên nhân gây ung thư dày H pylori biết đến nguyên nhân quan trọng hàng đầu nghiên cứu kỹ Các chủng H pylori mang gen CagA xác định chủng có nguy gây ung thư dày cao so với chủng không mang gen Đáng lưu ý, số chủng mang đột biến gen CagA phân lập khu vực Đơng Á, điển Nhật Bản Hàn Quốc cho thấy có khả gây ung thư cao so với chủng khơng mang đột biến Bên cạnh tác nhân khác hút thuốc lá, rượu bia chế độ ăn uống góp phần làm tăng nguy mắc ung thư dày Sử dụng rượu có mối liên quan không đồng mức độ sử dụng rượu với ung thư dày Kết phân tích gộp cho thấy sử dụng rượu làm tăng nguy ung thư dày 1,39 lần so với không sử dụng rượu Chế độ ăn uống xem có ảnh hưởng đến phát sinh ung thư biểu mô dày, đặc biệt trường hợp ung thư biểu mô tuyến ruột Chế độ ăn nhiều muối, thịt đỏ uống nhiều xác định tăng nguy ung thư dày Muối biết đến yếu tố làm tăng trình viêm làm tăng tác dụng tác nhân gây ung thư dày N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine [19] Trái lại, chế độ ăn nhiều rau xanh, hoa giàu vitamin C lại giúp thể giảm nguy ung thư dày [18] 6 1.4 Tế bào gốc ung thƣ 1.4.1 Tổng quan tế bào gốc ung thư Tế bào gốc ung thư (cancer stem cell) định nghĩa tế bào ung thư có khả tự đổi biệt hóa thành tế bào ung thư khơng phải tế bào gốc ung thư khối u Trong khối u có tồn số lượng ổn định quần thể tế bào gốc ung thư, nhóm tế bào mang đặc điểm đặc trưng tế bào gốc, chịu trách nhiệm cho khởi phát, di căn, kháng liệu pháp điều trị tái phát sau điều trị khối u [20] Tế bào gốc ung thư dày lần Yang cộng mô tả năm 2007 Các tế bào gốc ung thư dày có nguồn gốc từ tế bào gốc dày (Gastric stem cells) tế bào có nguồn gốc từ tủy xương (BMDCs) [21] Lý thuyết tế bào gốc ung thư đời làm thay đổi chiến lược điều trị ung thư, việc phát triển liệu pháp điều trị nhắm đích trực tiếp tác động đến tế bào gốc ung thư Các liệu pháp điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư nghiên cứu sử dụng điều trị mang lại kết khả quan Tuy nhiên, không đồng chức kiểu tính dẻo vốn có tế bào gốc ung thư- đặc điểm cho phép tế bào gốc ung thư chuyển đổi trạng thái hoạt động không hoạt động, gây khó khăn việc điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư Do đó, việc sử dụng kết hợp liệu pháp truyền thống điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư cho hiệu tốt so với việc sử dụng liệu pháp điều trị [22] 1.4.2 Các marker tế bào gốc ung thư Tế bào gốc ung thư chiếm tỷ lệ nhỏ khối u, đó, nghiên cứu điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư, việc xác định xác tế bào gốc ung thư quan trọng Các phương pháp dấu hiệu sử dụng để phân lập xác định đặc tính tế bào gốc ung thư bao gồm xét nghiệm enzyme CD24, CD144, CD133 ALDH (Hình 1.2) Các marker tế bào gốc ung thư thường sử dụng đơn lẻ kết hợp khác xác định loại tế bào gốc ung thư khác Ví dụ, tế bào gốc ung thư dày có biểu CD44, CD133 cao với Lgr5 [23] Các tế bào gốc ung thư phổi biểu hiển số marker bao gồm CD133+, ALDH1+ CD44+ [24] Một số marker phổ biến nhiều loại tế bào gốc tế bào gốc ung thư khác nhau, nhiên, số marker dấu hiệu nhận biết chuyên biệt tìm thấy loại tế bào gốc ung thư ABCB5+ (melanoma) hay CD15+ (medulloblastoma) Sử dụng marker kháng nguyên bề mặt cho phép phân lập tế bào gốc ung thư từ khối u không đồng Tuy nhiên, cần lưu ý việc sử dụng marker xác định phân lập tế bào gốc ung thư khơng đem lại kết xác tuyệt đối yếu tố tính khơng đặc hiệu marker, phá vỡ marker trình tiến hành hay số lượng tế bào gốc ung thư khối u 7 Cùng với đó, việc sử dụng chất nhắm đích marker tế bào gốc khơng chun biệt (có tế bào gốc thơng thường) dẫn đến tác dụng phụ khơng mong muốn từ tác động thuốc đến tế bào gốc thể Hình 1.2 Các marker tế bào gốc ung thư biểu số bệnh ung thư người [25] Tế bào gốc ung thư dày xác định lần dựa vào marker bề mặt phương pháp quần thể phụ Năm 2002, tác giả Bjerknes cộng phân tích biểu marker tế bào gốc tiềm dòng tế bào ung thư dày rằng, quần thể tế bào CD44+ phân tách kỹ thuật dòng chảy tế bào FACS (Fluorescence- activated cell sorting), tế bào mang đặc tính tế bào gốc ung thư khả tạo tumorsphere in vitro hình thành khối u in vivo Tiếp theo đó, dựa phân tích quần thể phụ dịng tế bào ung thư dày phương pháp nhuộm Hoechst 33342, Fukada cộng tế bào quần thể phụ chiếm tỷ lệ từ 0,02% đến 1,96% có biểu mạnh gen vận chuyển ABC liên quan đến khả kháng thuốc mà điển hình gen MDR1 BCPR1 kháng lại cisplatin 5-fluorouracil Doxorubicin Đặc biệt, tế bào thuộc quần thể phụ thể hai đặc điểm tế bào gốc ung thư khả hình thành tumorsphere điều kiện in vitro hình thành khối u điều kiện cấy ghép in vivo vượt trội so với tế bào tách từ quần thể [26] Năm 2017, Nguyên cộng xác định tồn tế bào gốc ung thư dày dòng tế bào ung thư khối u dày từ bệnh nhân ung thư dựa sàng lọc in vitro in vivo Hơn nữa, kết nghiên cứu tế bào gốc ung thư dày không biểu marker đặc trưng CD44, ALDH mà chúng thể đặc tính kháng thuốc rõ rệt so với quần thể tế bào tế bào gốc ung thư [27] 8 1.5 Quá trình apoptosis Apoptosis chế tự nhiên tế bào để tế bào chết theo “chương trình”, có vai trị quan trọng phát triển cân nội môi để trì quần thể tế bào mơ Apoptosis phương thức đặc biệt quan trọng trình chết tế bào theo “chương trình”, tức loại bỏ tế bào xác định mặt di truyền Apoptosis xảy chế bảo vệ trường hợp tế bào bị tổn thương bệnh tật chịu tác động từ tác nhân có hại Cũng cần lưu ý tế bào có phản ứng khác với tác nhân gây apoptosis, số xảy chết apoptosis, số khác xảy chết hoại tử, có trường hợp tác nhân apoptosis tác động chọn lọc lên loại tế bào định 1.5.1 Hình thái tế bào apoptosis Các tế bào trải qua q trình apoptosis có thay đổi đặc trưng dễ dàng quan sát thấy kính hiển vi quang học (Hình 1.3) Trong giai đoạn sớm q trình apoptosis có xảy tượng co rút tế bào, làm tế bào có kích thước nhỏ với tế bào chất dày đặc Pyknosis kết ngưng tụ chất nhiễm sắc đặc điểm đặc trưng trình apoptosis Khi kiểm tra mơ học nhuộm hematoxylin eosin, trình apoptosis bao gồm tế bào đơn lẻ cụm tế bào nhỏ Tế bào apoptotic xuất dạng khối tròn bầu dục với tế bào chất bắt màu mạnh với chất nhuộm, có màu sẫm mảnh nhiễm sắc nhân dày đặc màu tím [28] Hình 1.3 Tế bào apoptotic kính hiển vi quang học [28] Ở giai đoạn sau trình apoptosis, tế bào apoptosis chia thành thể apoptotic nhỏ thông qua tượng “nảy chổi” (budding), Các thể apoptotic có phần màng sinh chất bao bọc không giải phóng vật chất tế bào mơi trường ngoại bào Cuối trình phân hủy thể apoptotic nhờ đại thực bào Khác với hoại tử (necrosis), suốt q trình apoptosis khơng xảy tượng viêm vật chất tế bào chết khơng bị giải phóng ngồi thể apoptotic nhanh chóng bị thực bào [28] 1.5.2 Cơ chế trình apoptosis Cơ chế trình apoptosis phức tạp, có liên quan tới kiện phân tử phụ thuộc vào lượng Cho đến này, có đường apoptosis nghiên cứu đường nội sinh (intrinsic pathway) đường ngoại sinh (extrinsic pathway) Ngoài ra, đường apoptosis khác quan tâm đường perforin/granzyme, gây độc tế bào qua trung gian tế bào T tiêu diệt tế bào phụ thuộc vào perforin, gây apoptosis thơng qua granzyme B granzyme A Các đường ngoại sinh, nội sinh granzyme B sau kích hoạt gây chết tế bào thông qua đường chung đường thực thi (excution pathway) với đặc trưng hoạt động caspase làm phân mảnh DNA nhân chia cắt protein nội bào dẫn đến liên kết chéo protein, bình thành thể apoptotic, biểu phối tử thụ thể tế bào thực bào cuối hấp thu tế bào thực bào Con đường granzyme A kích hoạt đường chết tế bào song song, không phụ thuộc vào caspase thông qua tổn thương DNA (Hình 1.4) Hình 1.4 Con đường apoptosis tế bào [28] Con đường ngoại sinh khởi đầu trình apoptosis thông qua tương tác với thụ thể xuyên màng thụ thể chết (death receptor) thuộc họ thụ thể yếu tố hoại tử khối u (TNF) Các thụ thể TNF có chung vùng cấu trúc giống gọi “vùng chết” (death domain), có vai trị quan trọng việc truyền tín hiệu chết từ bề mặt tế bào đến đường tín hiệu nội bào FasL/FasR, TNF-α/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 Apo2L/DR5 cặp phối tử/thụ thể liên quan đến 10 đường ngoại sinh biết Sau phối tử chết gắn với thụ thể tương ứng gây phản ứng dẫn đến hoạt hóa procaspase-8 thành dạng hoạt động caspase-8, từ thực giai đoạn khác trình apoptosis Quá trình apoptosis ngồi sinh bị ức chế c-FLIP thơng qua liên kết làm caspase-8 hoạt tính [28] Con đường nội sinh apoptosis phụ thuộc ty thể kích hoạt nhiều yếu tố nội bào vắng mặt số yếu tố tăng trưởng, hormone cytokine, xạ, chất độc, tình trạng thiếu oxy, tăng thân nhiệt, nhiễm virus gốc tự Các kích thích gây thay đổi màng ty thể dẫn đến việc mở lỗ chuyển tiếp tính thấm ty thể (MPT), làm điện xuyên màng ty thể giải phóng hai nhóm protein pro-apoptotic thường cô lập từ không gian nội màng vào bào tương Nhóm protein cytochrome c , Smac/DIABLO serine protease HtrA2/ Omi kích hoạt đường ty thể phụ thuộc caspase (caspase9) Nhóm thứ bào gồm AIF, endonuclease G CAD giải phóng giai đoạn muộn trình apoptosis gây phân mảnh DNA ngưng tụ nhiễm sắc nhân Họ protein BCL-2 có chức điều hịa q trình apoptosis thơng qua chi phối tính thấm màng ty thể Sự cân protein pro-apoptotic anti-apoptotic yếu tố định tiến trình apoptosis p53 protein có vai trị quan trọng việc điều hịa họ protein Bcl-2 [28] Các đường ngoại sinh nội sinh kết thúc điểm giai đoạn thực thi, giai đoạn cuối trình chết Việc kích hoạt caspase thực thi bắt đầu giai đoạn apoptosis Các caspase thực kích hoạt endonuclease tế bào chất, làm phân hủy vật chất hạt nhân protease làm phân hủy protein nhân tế bào Caspase-3, caspase-6 caspase-7 caspase thực thi, phân cắt chất khác bao gồm cytokeratins, PARP, protein tế bào màng sinh chất alpha fodrin, protein hạt nhân NuMA chất khác, cuối gây thay đổi hình thái sinh hóa thấy tế bào apoptotic Caspase-3 xem lad caspase thực thi quan trọng nhất, kích hoạt từ caspase khởi xướng (caspase-8, -9, -10) Caspase-3 kích hoạt CAD endonuclease, gây tổ chức lại vật chất tế bào phân hủy tế bào thành thể apoptotic [28] 1.5.3 Thay đổi apoptosis ung thư Ức chế apoptosis đặc trưng tế bào ung thư Có nhiều chất ức chế hai đường apoptotic biểu mức khối u [29] Tăng biểu protein chống apoptosis BCL-2 điều chỉnh giảm protein proapoptotic BAX hai phương pháp để tế bào chống lại trình apoptosis Các khiếm khuyết trình apoptosis cho phép tế bào khối u kháng lại liệu pháp truyền thống hóa trị xạ trị, từ phải nâng cao ngưỡng cần thiết cho trình chết tế bào trình điều trị Ngồi ra, khả 11 chống lại q trình apoptosis thúc đẩy sức đề kháng hệ thống miễn dịch tổng thể hệ thống miễn dịch phụ thuộc vào tính tồn vẹn đường apoptosis [30] Nhiều protein thuộc nhóm ức chế apoptosis BCL-2, BCL-xl, BCL-w, mcl-1, A1, NR-13, BHRF1, LMW5-HL, ORF16, KS-BCL-2 E1b-19K ghi nhận có biểu mức ung thư [31] Sự biểu mức protein ức chế q trình apoptosis từ nhiều nguồn tín hiệu khác ình trạng thiếu oxy, thiếu hụt yếu tố tăng trưởng stress oxy hóa [32] Trong protein anti-apoptosis biểu mức, protein pro-apoptotic lại biểu mức bình thường bị ức chế Caspases, đặc biệt caspases thực thi, biểu mức bình thường tế bào khối u [33] Các đột biến loại bỏ bất hoạt gen caspase quan sát thấy bệnh ung thư khác [32] Ngoài ra, hình thành blebbishield chế mà tế bào ung thư sử dụng để chống lại q trình apoptosis Hơn nữa, kích hoạt blebbishield liên quan đến trốn tránh miễn dịch, tạo khối u, tăng cường đường phân, tạo bất ổn nhiễm sác thể, kháng thuốc di tế bào ung thư [34] Một cách điều trị ung thư kiểm soát chấm dứt phát triển khơng kiểm sốt tế bào ung thư thơng qua tác động vào chế khác tế bào hoạt của chu kỳ tế bào, trình chết tự nhiên tế bào hay q trình lão hóa tế bào Sử dụng chế tự chết tế bào phương pháp mang lại hiệu cao Ngoài ra, apoptosis nhắm mục tiêu phương pháp điều trị không phẫu thuật thành công Nhắm mục tiêu theo phương pháp apoptosis có hiệu tất loại ung thư, trốn tránh apoptosis dấu hiệu chung bệnh ung thư không đặc hiệu cho nguyên nhân hay loại ung thư cụ thể Có nhiều loại thuốc chống ung thư nhắm vào giai đoạn khác theo đường nội sinh ngoại sinh Hai chiến lược phổ biến để nhắm mục tiêu điều trị kích thích phân tử pro-apoptotic ức chế phân tử anti-apoptotic Một số mục tiêu nghiên cứu bao gồm phối tử thụ thể chết, chất ức chế BCL-2, ức chế XIAP chất tương tự alkylphospholipid (APL) hoạt động tín hiệu apoptotic [34] Ngoài ra, số hợp chất từ thực vật nghiên cứu chứng minh có khả nhắm đích apoptosis cách chọn lọc có hiệu cao [35] 1.6 Lão hóa tế bào Lão hóa tế bào (cellular senescence) trạng thái tế bào, đặt kho tế bào bị căng thẳng (stress) trình sinh lý định, với đặc trưng ngưng trệ chu kỳ tế bào (cell-cycle arrest) kéo dài thường đảo ngược với đặc điểm tiết, tổn thương đại phân tử thay đổi chuyển hóa [36] Các đặc điểm phụ thuộc lẫn (Hình 1.5) Q trình lão hóa kích hoạt nhiều yếu tố rút ngắn telomere (tự nhiên 12 chất ức chế), chất gây độc cho gen (ức chế chếp, tổn thương DNA), rối loạn cân protein tế bào, suy giảm chức autophagy, rối loạn chức ty thể đặc biệt kích thích tế bào ung thư gây Các tế bào lão hóa có đặc điểm hình thái miêu tả tế bào trở nên dẹt to ra, xuất ổ dị sắc (DNA trở nên đặc bình thường) Các dấu hiệu thường sử dụng để xác định q trình lão hóa tế bào biểu thấp protein Ki-67 bromodeoxyuridine BrdU, kích hoạt chất ức chế khối u p53, p16INK4A, cyclin CDK Ngoài ra, thay đổi hoạt động trao đổi chất phát nhờ đo mức độ β-galactosidase xem xét đặc điểm gây chất tiết ngoại bào tế bào lão hóa SASP [37] Hình 1.5 Các đặc điểm kiểu hình lão hóa [36] Các tế bào hình lưỡi liềm (tế bào lão hóa) tiết mơi trường ngoại bào nhiều yếu tố bào gồm cytokine tiền viêm chemokine, chất điều biến tăng trưởng, yếu tố tạo mạch metalloproteinase ma trận (MMPs), gọi chung kiểu hình tiết liên quan đến tuổi già (SASP) SASP tạo thành dấu hiệu tế bào già làm trung gian cho nhiều tác động sinh lý bệnh lý SASP củng cố lan truyền lão hóa kiểu nội tiết kích hoạt phản ứng miễn dịch loại bỏ tế bào già Các yếu tố SASP làm trung gian cho q trình lão hóa phát triển, làm lành vết thương, ảnh hưởng đến độ dẻo mô góp phần gây tình trạng viêm mãn tính Thành phần độ mạnh SASP thay đổi đáng kể, tùy thuộc vào thời gian lão hóa, nguồn gốc kích thích tiền lão hóa loại tế bào [38] 13 Trong ung thư, thân q trình lão hóa tế bào yếu tố ức chế phát triển khối u Một số sinh ung thư chính, bao gồm biểu ras, cyclin E, raf E2F3, có liên quan đến cảm ứng lão hóa có vai trị ức chế khối u thơng qua việc ức chế gia tăng tế bào ác tính cách kích thích giám sát miễn dịch Q trình lão hóa ghi nhân mức độ cao tổn thương tiền ác tính mức độ thấp bệnh xâm lấn, cho thấy vai trị lão hóa việc ngăn chặn tiến triển ác tính Các đột biến sinh ung thư quan trọng thường kích hoạt q trình lão hóa để loại bỏ tế bào tiền ác tính trước chúng có thêm đột biến có khả xâm lấn Do đó, đột biến làm xuất số chế để tránh lão hóa đặc điểm tiến triển ác tính từ tiền ác tính sang bệnh xâm lấn Sự tác nhân gây lão hóa quan trọng, chất ức chế khối u p16 INKA4 hay p53, chế dẫn đến thất bãi q trình lão hóa, dẫn đến tiến triển thành tế bào ác tính Các tế bào lưỡi liềm tạo phản ứng miễn dịch chống khối u - gọi “giám sát lão hóa” thông qua chất tiết SASP [39] Tuy nhiên, số thành phần SASP cytokine tiền viêm, yếu tố tăng trưởng tạo mạch (amphiregulin; angiogenin; EGF; epiregulin; bFGF; heregulin; HGF; IGFBP-2, -3, -4, -6 -7; KGF; NGF; PIGF; yếu tố tế bào gốc (SCF); SDF-1; VEGF) kích thích dẫn đến hình thành tiến triển khối u Điều giải thích cho việc bệnh ung thư thường dễ xuất bệnh nhân có độ tuổi cao [39] 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Hai dòng tế bào ung thư dày AGS phịng thí nghiệm Inserm U1053 Viện Sức khỏe Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp Bordeaux cung cấp Cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.) thuộc họ Đơn nem (Myrsinaceae) thu thập huyện Ngân Sơn, tỉnh Bắc Kạn, bảo quản phịng Thí nghiệm Y Sinh - Khoa Cơng nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất Kính hiển vi soi ngược Nikon Eclipe Ts2 (Nhật Bản), kính hiển vi huỳnh quang Eclipse Ti2-U NIKON (Nhật Bản); tủ nuôi cấy tế bào ổn nhiệt CO2 (Memmert - Đức), Máy đo nồng độ DNA, RNA NanoDrop One (Thermo Scienetific), Máy realtime PCR qTOWER (Analytik Jena) thiết bị phụ trợ khác Các hóa chất sử dụng ni cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEMF12 RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết bò, trypsin, kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp) Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette số dụng cụ nhỏ khác Thermo Fisher cung cấp Các hóa chất sử dụng tách chiết RNA phản ứng Realtime PCR: Reverse Transcriptase (RT) Kit (Thermofisher), 2X SYBR green master mix (Thermo Fisher) Các primer dùng phân tích mức độ biểu gen tổng hợp PHUSABIOCHEM 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm Y Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Thời gian nghiên cứu: 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 2.4.2 Phương pháp phân tích tăng sinh tế bào 2.4.3 Phương pháp tách chiết tinh ARN tổng số 2.4.4 Phương pháp phân tích biểu gen Realtime PCR 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu phầm mềm chuyên dụng Prism - GraphPad 4.0, tiến hành theo phương pháp phân tích Mann-Whitney Sự khác biệt có ý nghĩa với giá trị p < 0,05 15 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin H3 từ Lá khơi lên hình thái tế bào ung thƣ dày AGS Hình 3.1 Tế bào AGS kính hiển vi soi ngược nồng độ triterpenoid saponin H3 khác (Thang đo 50 µm) Quan sát kết hình 3.1 thấy, môi trường đối chứng (không bổ sung 3.2 Đánh giá tác động hợp chất triterpenoid saponin từ Lá khơi lên khả sống sót tế bào AGS mơi trường ni cấy Để xác định xác khả ức chế triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên khả tồn tế bào ung thư dày AGS môi trường nuôi cấy, tiến hành xác định số lượng tế bào cịn tồn mơi trương sau mốc thời gian 24 tiếp xúc 48 tiếp xúc nồng độ xử lý khác bao gồm 0.5-1-2.5-5-10 20 µg/ml Số lượng tế bào so sánh với mốc 100% môi trường đối chứng khơng có bổ sung triterpenoid saponin H3 Tác động triterpenoid saponin H3 nồng độ khác khoảng thời gian khác có thay đổi đáng ý Kết xác định tỷ lệ tế bào môi trường nuôi cấy biểu diễn hình 3.2 Trong thời gian 24 tiếp xúc, mơi trường ni cấy có bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ 0.5 µg/ml, phần trăm số lượng tế bào sống môi trường nuôi cấy xác định 130% so với đối chứng, điều có nghĩa nồng độ 0.5 µg/ml, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả kích thích nhẹ khả sinh trưởng tế bào ung thư AGS sau 24 tiếp xúc Tuy nhiên, kết sau lại sau thời gian tiếp xúc dài hơn, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi bắt đầu có xu hướng ức chế tồn tế bào Cụ thể, sau 48 nuôi cây, tỷ lệ tế bào sống môi trường nuôi cấy giảm mạnh 85% so với đối chứng, giảm khoảng 45% so với lượng tế bào sống mốc thời gan 24 Do xác định rằng, nồng độ thấp triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi ban đầu có khả kích thích nhẹ sinh trưởng tế bào ung thư AGS, sau với kéo dài thời gian tiếp xúc, kích thích sinh trưởng dần giảm xuống cuối đảo ngược dẫn đến ức chế sinh trưởng tế bào Tác động kích thích sau đảo ngược dẫn đến ức chế sinh trưởng không phổ biến nghiên cứu, nhiên chúng xảy nhiều trường hợp khác Các chế dẫn đến q trình chịu tác động nhiều yếu tố phức tạp liên quan đến nội tế bào tác động từ môi trường bên ngồi Hình 3.2 Tỷ lệ phần trăm tế bào AGS sống sót xử lý với H3 nồng độ 16 khác so với đối chứng (100%),* p ≤ 0,05; n = Ở môi trường ni cấy tế bào AGS có bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi với nồng độ µg/ml, mốc thời gian 24 tiếp xúc, tỷ lệ tế bào nuôi cấy AGS sống xác định 50% so với đối chứng, nhiên, sau 48 nuôi cấy, tỷ lệ phần trăm tế bào sống xác định khoảng 85%, tương đương môi trường nuôi cấy với nồng độ triterpenoid saponin H3 0.5 µg/ml thời gian tiếp xúc 48 Từ kết thấy sau thời gian dài tiếp xúc, tác động ức chế sinh trưởng triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có xu hướng giảm sút Điều giải thích đặc tính hợp chất tự nhiên dễ chịu tác động từ yếu tố môi trường dẫn đến phân hủy hợp chất làm hoạt tính hợp chất trải qua thời gian dài Ở mơi trường có bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ 2.5 µg/ml, thời gian tiếp xúc 24 giờ, tỉ lệ tế bào AGS môi trường nuôi cấy đước xác định 35% so với đối chứng; sau 48 tiếp xúc, tỉ lệ tế bào sống môi trường nuôi cấy 70%, lớn nhiều so với mức giảm thời gian 24 tiếp xúc (35%) giảm 15% so với mức nồng độ µg/ml thời gian tiếp xúc Kết xác minh giả thuyết hợp chất triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi dễ bị phá hủy giảm hoạt tính sau thời gian dài tồn môi trường nuôi cấy Ở môi trường nuôi cấy AGS bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi nồng độ µg/ml, tỉ lệ tế bào AGS sống giảm mạnh, xác định 25% mốc thời gian 24 tiếp xúc 10% sau 48 tiếp xúc Ở môit rường nuôi cấy AGS bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ 10 20 µg/ml tỉ lệ tế bào AGS sống môi trường xác định 10% 5% mốc thời gian 24 tiếp xúc 48 tiếp xúc tỉ lệ 2% xấp xỉ Từ kết thấy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi hợp chất không bền, thời gian dài tồn mơi trường ni cấy bị phân hủy dẫn đến phần hoạt tính Cùng với đó, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả kích thích nhẹ q trình tăng sinh tế bào ung thư AGS thời gian ngắn tiếp xúc nồng độ thấp, sau có khả ức chế tăng sinh tồn tế bào AGS Khả ức chế tăng sinh tồn tế bào ung thư AGS triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi phụ thuộc vào nồng độ hợp chất cịn tồn môi trường nuôi cấy thời gian tiếp xúc với hợp chất Một hợp chất triterpenoid saponin khác từ Lá khôi A8 Mu cộng chiết xuất xác định khả ức chế tồn nhiều dòng tế bào ung thư khác điều kiện in vitro Kết nghiên cứu cho thấy sau 24 17 nuôi cấy, dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 giá trị IC50 3.80 µM, dịng tế bào BT-549 MDA-MB-157 giá trị IC50 xác định 0.73 1.38 µM Khả ức chế tăng sinh tế bào A8 dòng tế bào ung thư vú xác định phụ thuộc vào nồng độ hợp chất môi trường nuôi cấy [41] 3.3 Kết tác động tripterenoid saponin saponin H3 từ Lá khôi lên biểu marker tế bào gốc ung thƣ dày CD44 CD44 dấu ấn sinh học biểu nhiều dạng ung thư khác Biểu CD44 có liên quan đến tăng sinh, tự làm di tế bào ung thư Trong ung thư dày, CD44 định dấu ấn sinh học cho phương pháp tiếp cận chẩn đoán, điều trị tiên lượng tăng cường biểu CD44 có liên quan đến tiên lượng xấu bệnh nhân với việc gia tăng biểu đặc tính tế bào gốc ung thư thúc đẩy hình thành khối u [43] Đồng thời, ức chế CD44 làm giảm đáng kể hình thành tumorsphere giảm phát triển khối u [44] Trong nghiên cứu này, để nghiên cứu tác động triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên tế bào ung thư dày AGS, tiến hành xác định mức độ biểu marker CD44 bề mặt tế bào nuôi cấy AGS điều kiện nuôi cấy 2D sau thời gian 24 tiếp xúc với H3 nồng độ 2.5 µg/ml Kết nghiên cứu so sánh với mức độ biểu CD44 tế bào nuôi cấy môi trường không chứa triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi Kết biểu CD44 thể hình 3.3 Ở tế bào ung thư AGS ni cấy mơi trường khơng có triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi (nồng độ µg/ml), xác định có 92.4% tế bào ni cấy có biểu CD44 Từ thấy, tế bào ni cấy AGS sử dụng nghiên cứu tế bào gốc ung thư dày có biểu CD44 mạnh, với biểu mạnh “đặc tính gốc” tế bào gốc ung thư, môi trường nuôi cấy phù hợp cho phát triển biểu bình thường tế bào ni cấy, khơng có chứa yếu tố gây ức chế hoạt động biểu gen dòng tế bào AGS ni cấy Hình 3.3 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu marker tế bào gốc ung thư CD44 tế bào AGS mơ hình ni cấy 2D Các tế bào nuôi cấy môi trường triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ 2.5 µg/ml, sau 24 tiếp xúc, tế bào ni cấy AGS có mức độ biểu CD44 suy giảm nghiêm trọng, cịn 11.4% tế bào có biểu CD44, tỉ lệ tế bào biểu CD44 suy giảm 81% so với tế bào nuôi cấy mơi trường đối chứng Như trình bày trên, suy giảm biểu CD44 tế 18 bào có ảnh hưởng làm giảm “đặc tính gốc” tế bào gốc ung thư, đồng thời ức chế phát triển hình thành khối u Ở tế bào nuôi cấy AGS môi trường có bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi nồng độ µg/ml, sau 48 tiếp xúc, tỉ lệ tế bào AGS có biểu CD44 xác định 8.1%, giảm nhẹ so với mức nồng độ H3 môi trường nuôi cấy 2.5 µg/ml Như vậy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế biểu marker CD44 tế bào ung thư dày AGS môi trường nuôi cấy, tỉ lệ tế bào ni cấy AGS có biểu CD44 giảm mạnh theo tăng lên nồng độ triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có mặt mơi trường Thông qua ức chế biểu CD44, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế biểu đặc tính quan trọng tế bào gốc ung thư dày AGS, từ ức chế tăng sinh, tồn di tế bào ung thư 3.4 Kết tác động triterpenoid saponin H3 từ Lá khôi lên biểu gen tế bào gốc ung thƣ Sự biểu gen đặc trưng tế bào gốc tế bào gốc ung thư có ảnh hưởng lớn đến q trình sinh trưởng, phát triển, khả di đặc tính đặc trưng tế bào gốc Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định ảnh hưởng triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên biểu ba gen đặc trưng cho “tính gốc” tế bào gốc ung thư dày AGS Oct4, Nanog Klf4 nồng độ IC50 (1 µg/ml) sau 24 tiếp xúc Kết phân tích biểu gen so sánh với mức độ biểu gen tế bào AGS nuôi cấy mơi trường đối chứng Kết phân tích biểu gen thể hình 3.4 Oct4 gen đặc trưng cho hoạt động có “tính gốc” tế bào gốc thông thường ung thư Hoạt động oct4 có liên quan đến kiểu hình khơng biệt hóa loại tế bào gốc khác Kết nghiên cứu cho thấy, biểu oct4 tế bào ung thư dày AGS ni cấy- mơi trường có chứa µg/ml triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi, sau 24 tiếp xúc- giảm khoảng 5% so với biểu gen tế bào nuôi cấy mơi trường đối chứng Cùng với đó, gen nanog klf4 có suy giảm đáng kể so với đối chứng Sự biểu gen nanog xác định khoảng 60%, biểu gen klf4 55% so với đối chứng tế bào ni cấy mơi trường khơng có triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi Hình 3.4 Tác động Triterpenoid Saponin H3 lên biểu gen tế bào gốc ung thư Sự kết hợp biểu gen oct4, nanog klf4 có vai trị quan trong q trình tự làm (self-renewal) biệt hóa tế bào gốc Sự ức chế hoạt 19 động oct4, nanog klf4 tế bào gốc dẫn đến ức chế trình tự làm tế bào, đồng thời cảm ứng q trình biệt hóa tế bào dẫn đến làm ức chế “tính gốc” tế bào gốc [45], [46] Như vậy, nghiên cứu này, xác định triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế, làm giảm khả tự làm (self-renewal) thức đẩy biệt hóa tế bào gốc ung thư thơng qua giảm mức độ biểu gen liên quan đến đặc tính quan trọng tế bào gốc ung thư oct4, nanog klf4 3.5 Kết tác động triterpenoid saponin saponin từ Lá khôi lên hình thành turmosphere từ tế bào gốc ung thƣ dày AGS Tumorsphere dạng sinh trưởng tế bào điều kiện ni cấy 3D, có tương đồng cao mơ hình khối u thể sống (in vivo) Trong nghiên cứu này, để nghiên cứu tác động triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi lên hình thành tumorsphere từ tế bào ung thư dày AGS, tiến hành bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi với nồng độ nồng độ 0.5 µg/ml vào mơi trường ni cấy AGS hình thành tumorsphere ngày ni cấy thứ Sau 48 tiếp xúc với triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi, thay đổi hình thái tumorsphere ghi lại ảnh chụp kính hiển vi độ phóng đại 200 lần (Hình 3.4) Hình 3.5 Tác động triterpenoid Saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên tumorsphere điều kiện nuôi cấy 3D nồng độ khác Trong đó, mơi trường ni cấy có bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi với nồng độ 0.5 µg/ml, sau 48 tiếp xúc, hình dạng tumorphere có thay đổi rõ rệt Các tumorsphere bị tan rã, tế bào rời khả kết dính thành khối, cịn phần tế bào đơn tách rời thể hoạt động sống, tế bào lại chuyển sang trạng thái chết Ở mơi trường có bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ µg/ml, sau 48 tiếp xúc, khối cầu tumorpshere tan rã hoàn toàn, tế bào rời hồn tồn khả khả kết dính tế , hầu hết tế bào đơn chuyển sang trạng thái chết Điều chứng tỏ triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ thấp từ 0,5–1 µg/ml tác động mạnh, làm tan rã giết chết tumorsphere Hiện nay, mơ hình thử thuốc điều kiện ni cấy 3D đặc biệt quan tâm ưu điểm bật tương đồng với hình thành phát triển tế bào ung thư điều kiện in vivo Trong nghiên cứu này, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi xác định có khả ức ức chế tiêu diệt khối tế bào in vitro (tumorsphere) cách hiệu quả, mở tiềm ứng dụng hợp chất điều trị ung thư 20 3.6 Kết tác động tripterenoid saponin từ Lá khôi lên lão hóa tế bào tế bào ung thƣ dày AGS môi trƣờng nuôi cấy Trong nội dung nghiên cứu, để xác định tác động triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên lão hóa tế bào, chúng tơi tiến hành bổ sung triterpenoid saponin H3 vào môi trường nuôi cấy với nồng độ µg/ml (IC50) Sau 24 tiếp xúc, tế bào xử lý với X-gal để xác định enzyme β-galactosidase đặc trưng cho tế bào lão hóa Kết quan sát biến đổi kiểu hình lão hóa kính vi ghi lại hình 3.6A Kết phân tích xác định tỉ lệ tế bào lão hóa mơi trường ni cấy ghi lại hình 3.6B Kết nghiên cứu hình 3.6A cho thấy, môi trường không chứa triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi, tế bào nuôi cấy AGS gần không làm đổi màu chất nhuộm X-gal, điều cho thấy khơng có xuất hoạt động enzyme β-galactosidase tế bào nuôi cấy Các tế bào trạng thái hoạt động sinh trưởng phát triển mạnh, không trải qua trình lão hóa tế bào Hình 3.6A Hình ảnh tế bào AGS kính hiển vi soi ngược nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc với tripterenoid saponin H3 (Thang đo 50 µm) Trong mơi trường ni cấy bổ sung triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi nồng độ µg/ml, sau 24 tiếp xúc, quan sát thấy số tế bào AGS mơi trường ni cấy có xuất màu xanh đặc trưng chuyển hóa chất X-gal tác động enzyme β-galactosidase đặc trưng cho tế bào lão hóa Như thấy được, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi nồng độ thấp có khả gây trình lão hóa tế bào ung thư dày AGS điều kiện ni cấy Hình 3.6B Tỷ lệ tế bào AGS lão hóa xử lý với triterpenoid saponin H3 nồng độ IC50 sau 24 tiếp xúc Kết xác định tỷ lệ phần trăm tế bào AGS lão hóa hình 3.6B cho thấy, môi trường nuôi cấy không chứa triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi (nồng độ µg/ml), tế bào ni cấy AGS khơng xảy q trình lão hóa (0%), từ xác định môi trường nuôi cấy tế bào sử dụng nghiên cứu khơng có chứa yếu tố gây lão hóa tế bào Ở tế bào ni cấy AGS mơi trường có bổ sung µg/ml triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi, sau 24 tiếp xúc, tỷ lệ tế bào lão hóa xác định khoảng 9% Như thấy rằng, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả gây q trình lão hóa tế bào tế bào ung thư dày AGS điều kiện in vitro Như trình bày trên, q trình lão hóa tế bào với đặc trưng ngưng trệ chu kỳ tế bào ức chế q trình apoptosis, có vai trị ức chế phát triển 21 tế bào ung thư Trong nghiên cứu này, xác định triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả gây q trình lão hóa cho tế bào ung thư dày AGS, từ dẫn đến khả ức chế sinh trưởng phát triển té bào AGS môi trường nuôi cấy 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xác định triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có tác động lên kiểu hình tế bào ung thư dày AGS điều kiện nuôi cấy Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế khả sống sót tế bào ung thư dày AGS điều kiện nuôi cấy Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi làm giảm biểu marker tế bào gốc CD44 tế bào AGS nuôi cấy Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế biểu gen liên quan đến tính gốc tế bào AGS oct4,nanog klf4 Triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế phát triển gây chết tumorsphere tế bào AGS hình thành điều kiện ni cấy 3D Trong điều kiện nuôi cấy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả thúc đẩy lão hóa tế bào ung thư dày AGS Kết luận chung: Trong điều kiện nuôi cấy, triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khơi có khả ức chế sinh trưởng, phát triển tồn tế bào ung thư dày AGS, đồng thời giảm hoạt động gen xác định “tính gốc” gây lão hóa tế bào Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng triterpenoid saponin H3 chiết xuất từ Lá khôi lên lên phát triển dòng tế bào ung thư dày mức độ protein