Ảnh hưởng của phức hệ nano bạc galic acid lên apoptosis và chu kỳ tế bào của tế bào ung thư dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ THỊ THU ẢNH HƢỞNG CỦA PHỨC HỆ NANO BẠC-GALIC ACID LÊN APOPTOSIS VÀ CHU KỲ TẾ BÀO CỦA TẾ BÀO UNG THƢ DẠ DÀY TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 Thái Nguyên - 2022 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đắc Trung Phản biện 1: TS Trần Minh Đức Phản biện 2: TS Hoàng Phú Hiệp Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn họp tại: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Vào hồi 09 00 ngày 23 tháng 01 năm 2022 Có thể tìm hiểu luận văn trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên Và thư viện Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Gallic acid polyhydroxyphenolic sản phẩm trao đổi thứ cấp loài thực vật khác Một số dạng thực phẩm giàu gallic acid táo, nho, chuối Gallic acid nghiên cứu có nhiều hoạt tính chất khác chống oxy hóa chống lại tế bào ung thư, khả chống ung thư đặc biệt quan tâm Các nghiên cứu dẫn xuất gallic acid propyl, lauryl, methyl gallate có khả cảm ứng apoptosis ngăn cản phân chia tế bào ung thư khác thông qua chế tăng cường tăng cường stress oxy hóa tế bào ung thư Bên cạnh đó, gallic acid có khả gây đứt gãy DNA, làm chết bào cuối ngăn cản hình thành khối u di tế bào ung thư Nano bạc dụng phổ biến nhiều lĩnh vực khác so với dạng nano khác có hoạt tính sinh học mạnh, biệt khả ức chế vi sinh vât gây bệnh khả tiêu diệt tế bào ác tính khối u Việc tổng hợp phức hệ nano bạc gắn kết với phân tử thuốc có ý nghĩa quan trọng việc làm tăng cường khả dẫn thuốc tăng hiệu thuốc nồng độ thấp Một số nghiên cứu đề cập tới việc tổng hợp phức hệ nano bạc – gallic acid nghiên cứu số tính chất khả khác khuẩn kháng ung thư phức hệ nano Tuy nhiên, hiệu phức hệ nano bạc tạo phụ thuộc nhiều phương pháp, điều kiện sinh tổng hợp [1] Hiện nay, nghiên cứu chế phân tử tác động nano bạc – gallic acid (AgNPsGal) lên tế bào ung thư cịn hạn chế, địi hỏi có nghiên cứu sâu để xác định chế Ung thư dày dạng ung thư phổ biến Việt Nam có tỷ lệ gây chết cao sau ung thư gan ung thư phổi Việt Nam thuộc nhóm 20 quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dày cao giới Điều trị ung thư dày gặp nhiều khó khăn tượng kháng thuốc tái phát sau điều trị Chính vậy, nghiên cứu này, sử phức hệ nano bạc – gallic acid tổng hợp phương pháp tổng hợp xanh, có xúc tác tia plasma để nghiên cứu tác động chúng lên tế bào ung thư dày, với tên đề tài là: “Ảnh hưởng phức hệ nano bạc-gallic acid lên apoptosis chu kỳ tế bào tế bào ung thư dày’’ Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá ảnh hưởng phức hệ nano bạc-gallic acid lên chu kỳ tế bào, apopotosis cà khả tự làm tế bào ung thư dày gen liên quan Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nano bạc 1.1.1 Nghiên cứu khả diệt khuẩn nano bạc Nano hạt có kích thước siêu nhỏ 100 nanomet Hạt nano bạc có nhiều hình dạng khác tùy thuộc vào phương pháp chế tạo ứng dụng hạt Hạt nano bạc sử dụng thường có hình cầu, hình bát giác dạng mỏng [1] Nano bạc thường sử dụng để diệt khuẩn chúng có diện tích bề mặt lớn, giúp gia tăng khả tiếp xúc chúng với vi khuẩn, từ hỗ trợ trình diệt khuẩn tốt Trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe, nano bạc nghiên cứu nhiều dược học Cơ chế diệt khuẩn nano bạc công đầu nối disunfit HS-SH màng tế bào sinh vật, ức chế q trình vận chuyển oxy vào tế bào Từ ngăn chặn phát triển, chép vi khuẩn Nghiên cứu khác việc vơ hiệu hóa tế bào vi khuẩn kết trình tương tác tĩnh điện bề mặt tế bào ion bạc [2] Ion bạc có hoạt tính mạnh, dễ dàng liên kết với protein tích điện âm, RNA, DNA, ion clorid Việc đưa bạc vào tế bào vi khuẩn gây nhiều thay đổi cấu trúc hình thái Khi hạt nano bạc tiếp xúc với vi khuẩn, chúng bám vòa thành tế bào màng tế bào Sau đó, số ion bạc vào bên tương tác với hợp chất chứa phốt phát DNA RNA, phần khác bám vào protein chứa lưu huỳnh màng [3] Tương tác bạc-lưu huỳnh màng khiến thành tế bào trải qua thay đổi cấu trúc, giống hình thành lỗ lỗ rỗng Ở tế bào, hạt nano bạc ức chế nhân lên gây chết tế bào [4] Điều có liên quan đến việc ức chế enzym ức chế biểu protein liên quan đến khả sản xuất ATP tế bào Nano bạc dụng diệt lượng lớn loài vi khuẩn, loài nghiên cứu nhiều tụ cầu vàng Staphyllococcus aureus, Escherichia coli, Liên cầu tan máu Streptococcus, Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa Phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae Ngoài ra, tác dụng nano bạc nấm Candida albican số chủng virut nghiên cứu Nghiên cứu với S aureus nồng độ 3000 khuẩn/đĩa cho thấy, S aureus bị diệt hoàn toàn dịch keo bạc-silica nồng độ 60 mg/l [5] Nghiên cứu Jaiswal (2010) có mặt β-cyclodextrin làm tăng cường tác dụng kháng khuẩn nano bạc chủng P aeruginosa, E coli S aureus Ở nồng độ 50 ppm 100 ppm, nano bạc diệt 96 98% ba chủng vi khuẩn Shahverdi cộng (2007) tiến hành nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn nano bạc Kết nano bạc đường kính 5-32 nm tăng tác dụng diệt khuẩn nhiều loại kháng sinh Penicillin G, Amoxicillin, Erythromycin, Clindamycin, Vancomycin Staphylococcus aureus Escherichia coli [6] Vải sợi 100% cotton tẩm nano bạc đến bão hòa thể khả diệt khuẩn tốt loại trực khuẩn mủ xanh, liên cầu tan máu, tụ cầu vàng nấm Candida thời điểm ban đầu sau tháng Nano bạc điều chế từ phản ứng AgNO3 với dịch chiết củ Nghệ Curcuma longa nồng độ 50 mg/l ức chế đến 99,1 % chủng E coli BL-21 Ruparelia cộng (2008) công bố nồng độ diệt khuẩn tối thiểu bạc nhiều chủng E coli 60-220 mg/l [7] 1.1.2 Nghiên cứu khả chống ung thư nano bạc Nhiều nghiên cứu khả chống ung thư nano bạc chúng có tác dụng với nhiều loại ung thư khác Khi nghiên cứu chiết xuất nano bạc từ Bồ công anh Taraxacum officinale có tác dụng chống lại tế bào ung thư gan người (HepG2) [8] Kuppusamy et al tổng hợp phức hệ AgNPs từ chiết xuất từ Commelina nudiflora L., kết nghiên cứu cho thấy, phức hệ làm giảm khả tồn tế bào ung thư đại tràng Tổng hợp nano bạc từ chiết xuất Ổi Đinh hương cho thấy hiệu chống ung thư phức hệ Kết nghiên cứu in vitro cho thấy, phức hệ có khả ức chế dịng tế bào ung thư khác ung thư biểu mô tuyến trực tràng người, thận, bệnh bạch cầu mãn tính người, bệnh bạch cầu, tủy xương cổ tử cung người Các hạt nano bạc tổng hợp cách sử dụng sắc tố protein phycocyanin chiết xuất từ Nostoc linckia có khả gây ức chế phát triển tế bào ung thư vú MCF-7 Thí nghiệm in vitro nồng độ ức chế phức hệ (IC50) 27,79 ± 2,3μg /mL Bên cạnh đó, nano bạc tổng hợp hóa học có hoạt động chống ung thư cao, khả ức chế A549 (ung thư biểu mô phổi), HeLa (ung thư biểu mô tuyến cổ tử cung), MCF7 (ung thư biểu mô tuyến vú), MDAMB231 (ung thư biểu mô tuyến vú) SKBR3 (ung thư biểu mô tuyến vú) [9] Kuppusamy cộng tổng hợp thành công hạt nano bạc sử dụng chiết xuất etanolic Hoa hồng (Rosa indica), phức hệ chứng minh khả hoạt động chống ung thư biểu mô tuyến ruột kết người dòng tế bào HCT15 [10] Tiềm hóa trị liệu nano bạc đã chứng minh, chủ yếu hạt nano có kích thước 5-35 nm gây độc, dẫn đến gây chết tế bào Mặc dù hạt nano bạc nhỏ gây độc cho tế bào cao hơn, nhiên chế hoạt động apoptotic nm 35 nm giống hệt Hơn nữa, tính gây độc tế bào hạt nano bạc phụ thuộc vào loại tế bào [11] 1.2 Gallic acid nghiên cứu điều trị ung thƣ 1.2.1 Tổng quan gallic acid Gallic acid acid trihydroxybenzoic, hay gọi acid 3,4,5trihydroxybenzoic Hóa chất cơng thức C6H2 (OH) 3COOH, màu trắng vàng, tinh thể màu vàng nhạt, tan rượu, ete, glycerol axeton Gallic acid có mặt rộng rãi thực vật, phần lớn tìm thấy dạng tự dạng dẫn xuất nguồn thực phẩm khác hạch, chè, nho Thù du (Rhus coriaria L.) Các nguồn khác bao gồm óc chó, vỏ sồi, mật ong, loại mọng khác nhau, lựu, xoài khác trái cây, rau đồ uống Gallic acid tìm thấy mơ thực vật dạng este este đa dạng với đường glycosid, polyol phenol báo cáo Gallic acid tạo cách thủy phân acid tannic với acid kiềm tannase vi sinh vật, chúng dễ dàng giải phóng khỏi gallotannin q trình oxy hóa Trong dược phẩm, gallic acid sử dụng để tổng hợp loại thuốc kháng khuẩn trimethoprim [12] 1.2.2 Hoạt tính sinh học gallic acid Nghiên cứu gallic acid có khả kháng lại ký sinh trùng gây bệnh sốt rét Plasmodium, sử dụng thành phần thuốc chống sốt rét Bên cạnh đó, gallic acid chứng minh có hoạt tính chống nấm, kháng vi rút, kháng khuẩn (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus Escherichia coli) [13] 4 Gallic acid có hoạt tính chống oxy hóa tốt, sử dụng để điều trị albumin, bệnh tiểu đường trường hợp xuất huyết nội tạng Gallic acid phát có độc tính tế bào chống lại tế bào ung thư, mà không ức chế tế bào khỏe mạnh Nhiều dẫn xuất alkyl gallic acid có đặc tính chống ung thư, lauryl gallate, propyl gallate, epigallocatechin gallate (EGCG) [14] 1.2.3 Nghiên cứu hoạt tính chống ung thư gallic acid Gallic acid dẫn xuất phát chất chống ung thư mạnh Đã có nhiều tài liệu giải thích chất chống ung thư gallic acid số dẫn xuất chống lại tuyến tiền liệt ung thư, ung thư miệng, u ác tính, bệnh bạch cầu, ung thư hạch, ruột kết tế bào ung thư ung thư vú Ohno cộng nghiên cứu tác dụng gallic acid gây apoptosis bốn dòng tế bào ung thư phổi người, dòng ung thư biểu mô tế bào (SBC-3), ung thư biểu mô tế bào vảy (EBC-1), ung thư biểu mô tuyến (A549) cisplatin SBC-3 Thí nghiệm in vitro ra, sử dụng gallic acid gây thay đổi hình thái, phân mảnh DNA, khả chống khối u in vivo chuột đen C57 với tế bào cấy ghép LL-2 [15] Các tế bào xử lý gallic acid cisplatin, trọng lượng khối u chuột điều trị kết hợp cisplatin gallic acid (IC50: 200 mM) giảm so với cisplatin đơn Gallic acid gây apoptosis, phân mảnh DNA thay đổi hình thái tế bào Quá trình apoptotic cho thấy tham gia gallic acid vào trình hoạt hóa oxy hóa caspase Những kết gợi ý khả sử dụng gallic acid điều trị ung thư phổi, đặc biệt để tránh tình trạng kháng thuốc chống ung thư Gallic acid có tác dụng chống ung thư tế bào ung thư phổi Calu-6 A549 liên quan loại oxy phản ứng (ROS) glutathione (GSH) [16] Nghiên cứu hoạt động chống ung thư gallic acid tế bào ung thư tuyến tiền liệt ra, chúng có khả ngăn chặn phát triển tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU145 Gallic acid làm giảm khả tồn tế bào DU145 liên quan đến việc tạo ROS q trình apoptosis Gây trì hỗn chu kỳ tế bào pha G2/M hoạt hóa Chk1 Chk2 bất hoạt Cdc25C Cdc2 Hơn nữa, gallic acid phát có vai trị việc ngăn chặn tăng sinh tế bào DU145 [17] Quá trình tự oxy hóa gallic acid giết chết tế bào tuyến tiền liệt ác tính cách hiệu Quá trình tự oxy hóa tạo gia tăng đáng kể ROS Liu cộng thử nghiệm đặc tính chống ung thư gallic acid tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 Khi xử lý với gallic acid tế bào ung thư PC3, tỷ lệ tế bào sống sót phát giảm theo nồng độ (50, 100, 200 mM) [18] Vì tính chất đặc biệt AgNP chống ung thư Nano bạc tổng hợp với nhiều phương pháp khác vật lý, hóa học, sinh học Trong việc ứng dụng hóa học xanh có thành tựu định Phương pháp sử dụng vi sinh vật, dịch chiết từ thực vật polyme tự nhiên làm tác nhân khử, đem lại hiệu cao Trong đó, tổng hợp nano bạc từ gallic acid đề cập vài nghiên cứu gần Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu chế phân tử tác động nano bạc – gallic acid (AgNPs-Gal) lên tế bào ung thư 5 1.3 Khái quát chung ung thƣ dày 1.3.1 Dịch tễ học ung thư dày Hình 1.1 Tỉ lệ ung thư dày chuẩn theo tuổi (GLOBOCAN 2018) 1.3.2 Phân loại ung thư dày 1.4 Chu kỳ tế bào ung thƣ Hình 1.2 Chu kỳ tế bào tế bào nhân thực Pha G2 giai đoạn từ hoàn thành q trình nhân đơi DNA đến bắt đầu trình nguyên phân (mitosis) Trong pha G2, diễn tổng hợp RNA protein có liên quan trực tiếp đến trình nguyên phân vi sợi, tubulin, yếu tố điều hòa nguyên phân, để chuẩn bị cho trình nguyên phân Pha M chia thành prophase, metaphase, anaphase telophase, trình phân chia nhiễm sắc thể thành hai tế bào cách xác đồng DNA protein tế bào chia cho hai tế bào, hồn thành q trình nhân đơi tế bào Trong q trình sinh trưởng nhân đơi tế bào, phần cuối chu kỳ trước bắt đầu chu kỳ sau Tuy nhiên, số tế bào không bước vào chu kỳ mà tạm thời thoát khỏi chu kỳ tế bào bước vào pha G0 (Hình 1.2) Tế bào pha G0 chuyển sang pha G1 số tác động định Điều hòa chu kỳ tế bào loạt chế phức tạp liên quan đến việc điều chỉnh nhiều loại cyclin, kinase phụ thuộc cyclin, điểm kiểm tra chu kỳ tế bào đường tín hiệu chu kỳ tế bào [22] Trong chu kỳ phân bào, protein điều hòa chu kỳ tế bào liên kết với protein mã hóa chu kỳ hoạt hóa kinase phụ thuộc cyclin (cyclin-dependent kinase- CDK) tương ứng, từ thúc đẩy q trình phân chia tế bào (Hình 1.3) Ít 11 cyclin khác xác định A, B1, B2, C, D1, D2, D3, E, F, G H Tất loại cyclin chứa chuỗi axit amin bảo tồn, gọi khung cyclin, làm trung gian liên kết cyclin với CDK Trong tế bào động vật có vú, CDK, chất ức chế CDK (CDKI), retinoblastoma protein (Rb) kiểm soát chặt chẽ thay đổi cyclin giai đoạn khác chu kỳ tế bào Các tế bào thiếu cyclin liên quan bị chặn điểm kiểm soát G1/S Sự hoạt hóa cyclin D cyclin E thúc đẩy chuyển pha tế bào từ pha G1 sang pha S, đó, hoạt hóa CDC2 thúc đẩy chuyển đổi pha tế bào từ pha S sang pha G2/M Hoạt động CDK kiểm sốt q trình phiên mã chu kỳ tế bào đóng vai trị quan trọng việc điều chỉnh điểm kiểm tra trục (spindle checkpoint) CDK khởi động, thúc đẩy hồn thành hoạt động chu kỳ tế bào Việc kích hoạt CDK chuyển tế bào từ giai đoạn sang giai đoạn Chu kỳ tế bào kiểm soát nhiều phức hợp CDK cyclin CDK1 hoạt hóa phosphoryl hóa protein đích để tạo hiệu ứng sinh lý tương ứng, chẳng hạn phosphoryl hóa fibrin nhân, dẫn đến phân hủy fibrin nhân, làm biến màng nhân cô đặc nhiễm sắc thể Các phức hợp khác CDC2 CDK có chức khác CDK-G1 cyclin dimer điều hòa pha G1 S, CDC2-cyclin A B điều hịa q trình phân bào CDKI điều chỉnh ức chế chu kỳ tế bào Khi tế bào biểu mức cyclin không biểu CDKI, phát triển tế bào không bị kiểm soát Nhiều CDKI phát hiện, protein INK4 Cip /kip INK4 chất ức chế CDK4 CDK6, liên kết với CDK4/6 cản trở liên kết kinase với cyclin D Nó trì trạng thái phosphoryl hóa cao Rb cuối ngăn chặn chu kỳ tế bào Điều hòa chu kỳ tế bào bất thường kích hoạt CDK4/6 chế quan trọng tăng sinh tế bào khối u Cip/kip không chất ức chế cyclin E kinase CDK2 phụ thuộc A, mà cịn chất điều hịa tích cực kinase phụ thuộc cyclin D Cip/kip gây tích tụ cyclin D, tăng cường q trình phosphoryl hóa Rb làm tế bào bước vào pha S [23] Rb protein ức chế khối u, ức chế tiến triển chu kỳ tế bào chất ức chế khối u thơng qua CDK Phức hợp cyclin D-CDK4/6 phosphoryl hóa đầu C Rb Rb phosphoryl hóa ức chế gắn kết histone deacetylase (HDAC) cách tương tác với phân tử vùng trung tâm, ngăn cản q trình phiên mã tích cực Khi Rb khơng phosphoryl hóa, ức chế yếu tố phiên mã E2F cách ngăn chặn miền vơ hiệu hóa yếu tố phiên mã E2F liên kết HDAC E2F chất điều hịa quan trọng q trình điều hịa chu kỳ tế bào Giống protein pocket (PP), điều chỉnh gen tham gia trực tiếp vào q trình tế bào để kiểm sốt chức khác tế bào Khi kích thích, cyclin D-CDK4/6 bắt đầu q trình phosphoryl hóa PP, dẫn đến phá hủy phức hợp ức chế E2F/PP đầu liên kết yếu tố E2F Đồng thời, biểu protein hoạt hóa E2F (E2F1, E2F2 E2F3) kích thích phiên mã gen chu kỳ tế bào, làm cho tế bào chuyển từ pha G1 sang pha S [24] Hình Chu kỳ tế bào protein điều hịa [25] 1.5 Quá trình apoptosis Các tế bào xảy trình apoptosis (tế bào apoptotic) xảy biến đổi đặc trưng hình thái tế bào như: cô đặc tế bào chất, phân mảnh cô đặc vật chất di truyền hạt nhân từ hình thành nên túi nhỏ có tồn màng hồn chỉnh bao bọc gọi ApoBD (Hình 1.4) Các tế bào trải qua co rút đặc trưng giai đoạn đầu q trình apoptosis Kích thước tế bào nhỏ vật chất bên tế bào co rút trở nên dày đặc Một tượng khác pyknosis (sự ngưng tụ đảo ngược chất nhiễm sắc) xảy đồng thời giai đoạn đầu trình apoptosis Những thay đổi quan sát kính hiển vi quang học Sau giai đoạn đầu trình apoptosis, tượng khác xảy karyorrhexis, dẫn đến phân mảnh hạt nhân Karyorrhexis kèm với hình thành ApoBD nhỏ ApoBD chứa phần lại tế bào apoptotic (tế bào chất, bào quan nhân) vật chất tế bào apoptotic phân phối ngẫu nhiên cho thể ApoBD Do đó, bào quan thành phần hạt nhân có khơng có thể ApoBD cụ thể Các ApoBD sau bị tế bào thực bào, bạch cầu trung tính, đại thực bào tế bào gai (DC) nhận dạng thực bào Q trình thực bào đánh dấu bước cuối chu kỳ apoptotic, ngăn chặn giải phóng thành phần tế bào chết đóng gói tế bào apoptotic mơi trường xung quanh [35] Hình 1.4 Tế bào apoptotic giai đoạn sớm [35] Cơ chế sinh học trình apoptosis phức tạp Việc thực hồn tồn q trình apoptosis liên quan đến tác động lẫn loạt protein truyền tín hiệu đường truyền tín hiệu Hai đường apoptosis nghiên cứu là: đường bên (extrinsic pathway) đường bên (intrinsic pathway) (Hình 1.5) Con đường bên ngồi kích hoạt apoptosis qua trung gian thụ thể Các thụ thể chết đường ngoại lai gắn chặt vào màng tế bào thông qua vùng xuyên màng Khi tương tác với phối tử ngoại bào, thụ thể màng chuyển tiếp tín hiệu chết vào nội bào thơng qua vùng chết nằm phía tế bào chất Các thụ thể màng liên quan đến trình apoptosis thụ thể thuộc siêu họ thụ thể yếu tố hoại tử khối u (TNF), hoạt hóa chúng phụ thuộc vào hai phối tử TNF Fas TNF thụ thể (là TNFR-1 TNFR-2) chịu trách nhiệm bắt đầu đường apoptosis chính: đường TNF Sự tương tác TNF thụ thể chứng minh chuyển tiếp tín hiệu chết thơng qua liên kết hai protein tiếp hợp: vùng chết liên kết với thụ thể TNF (TRADD) protein vùng chết liên kết với Fas (FADD) hiệu ứng chết tế bào lập trình thơng qua hoạt động caspases Các phối tử TNF tạo thành đồng phân liên kết với thụ thể TNF màng Sau liên kết, protein tiếp hợp (TRADD, FADD RIP) liên kết vào thụ thể TNF phía tế bào chất, nơi vùng chết protein tiếp hợp tương tác với đối tác thụ thể FADD tương tác với protein hạ lưu nó, procaspase-8 thơng qua tương tác miền tác động chết (DED) Procaspase-8 sau hoạt hóa trải qua q trình tự động phân tách để tạo caspase-8 hoạt động, bắt đầu giai đoạn thực trình chết tế bào Caspase-8 phân cắt procaspase-3 để tạo caspase-3 hoạt động chịu trách nhiệm cho việc thực trình phân giải protein nhiều loại protein nội bào Con đường qua trung gian Fas trải qua trình truyền tín hiệu tương tự FasL (phối tử Fas) kích hoạt đường cách liên kết với thụ thể Fas (còn gọi CD95) FADD liên kết với thụ thể Fas thu nhận caspase8 Các thụ thể Fas, với FADD procaspase-8, tạo thành phức hợp tín hiệu gây tử vong (DISC) Một đường apoptosis thứ ba tương tự đường bên ngồi chứng minh có tồn sử dụng điều trị đường apoptosis liên quan đến TNF tạo phối tử (TRAIL) TRAIL, gọi Apo2L, loại protein xuyên màng loại II có chứa vùng ngoại bào, bị protease phân cắt giải phóng phần hoạt động phối tử Trimeric TRAIL liên kết với thụ thể màng DR4 DR5, sau kích hoạt dịng tín hiệu nội bào tương tự đường Fas Con đường TRAIL-DR4 /DR5 hoạt động loạt q trình sinh lý kích hoạt tế bào T hình thành khối u TRAIL chất ức chế khối u nhờ khả gây q trình apoptosis tế bào ác tính mô tế bào, TRAIL trở thành tác nhân chống khối u lý tưởng Con đường TRAIL hoạt động độc lập với p53 thường bị đột biến tế bào ung thư Tuy nhiên, số lượng đáng kể ung thư kháng lại điều trị TRAIL [36] 10 Hình 1.5 Quá trình chết apoptosis tế bào [37] Con đường nội trình apoptosis đặc trưng khởi đầu không qua trung gian thụ thể chịu tác động ty thể Trong đường nội tại, kích thích trực tiếp tạo tín hiệu nội bào dẫn đến thay đổi sinh hóa bên tế bào Khi có kích thích gây phá vỡ màng xuyên ty thể làm tiêu hao điện màng, làm cho dễ thấm Kích thích dẫn đến việc hình thành lỗ chuyển tiếp tính thấm ty thể (MPT) màng để dẫn việc yếu tố proapoptotic giải phóng vào bào tương Apoptosome phân cắt procaspase-9 để tạo caspase-9 hoạt động, từ kích hoạt caspase hiệu ứng (caspase-3) Một nhóm protein khác gọi SMAC (chất kích hoạt caspase có nguồn gốc từ ti thể nhỏ) liên kết với IAP (chất ức chế protein apoptosis) vơ hiệu hóa IAP, cho phép q trình apoptosis diễn Những protein ức chế IAP khác DIABLO Omi tham gia vào đường apoptosis phụ thuộc vào caspase Một nhóm protein thứ hai gọi yếu tố gây trình chết theo chương trình (AIFs) hoạt động đường khơng phụ thuộc vào caspase trình apoptosis AIF gắn vào màng ti thể Khi calpain phân cắt AIFs, AIFs chuyển vị vào nhân tín hiệu NLS (nuclear localization signal) để tạo phân mảnh DNA ngưng tụ nhiễm sắc [38] Caspases thành phần quan trọng trình apoptosis Cho đến nay, hai loại caspase xác định, caspase khởi tạo caspase hiệu ứng/ thực thi Caspase-2, -8, -9, -10 -11 caspase khởi tạo, đó, caspase-3, -6 -7 caspase hiệu ứng [39] Các protein họ protein Bcl-2 chịu trách nhiệm điều chỉnh q trình apoptosis, có phân nhóm trái ngược pro-apoptotic antiapoptotic [40] Ngoài ra, p53 chứng minh yếu tố điều chỉnh hoạt động họ protein Bcl2 p53 trực tiếp tạo phiên mã Bax protein pro-apoptotic [35] Quá trình apoptosis có liên quan đến nhiều loại bệnh lý bệnh tự miễn, bệnh thối hóa thần kinh, bệnh vi khuẩn virus, bệnh tim đặc biệt ung thư Cùng với đó, liệu pháp điều trị nhắm đích hướng tới việc tác động vào trình apoptosis ung thư đặc biệt quan tâm nghiên cứu [35] 11 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Dòng tế bào ung thư dày MKN45 phịng thí nghiệm Inserm U1053 Viện Sức khỏe Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp Bordeaux cung cấp 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất - Các thiết bị sử dụng nghiên cứu gồm: Kính hiển vi soi ngược NIKON- Ts2 (Nhật Bản); Kính hiển huỳnh quang T2U (NIKON); Tủ ni cấy tế bào ổn nhiệt CO2 (Memmert) thiết bị phụ trợ khác - Hóa chất: AgNO3 (Sigma Aldrick); mơi trường nuôi cấy tế bào RPMI1640 (Thermo Fisher), Kháng sinh Pellicilin, streptomycin, PBS, FBS (Invitrogen) 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư dày 100.000 tế bào từ dòng tế bào ung thư ni cấy hộp lồng thể tích 25cm2 mơi trường RPMI 1640 có bổ sung huyết bào thai bò (FBS) 10% 50 g/ml kháng sinh streptomycin 50 IU/ml penicillin Nuôi cấy điều kiện 37°C với có mặt 5% CO2 Dung dịch ni cấy thay dung dịch theo tần số ngày lần Sau tế bào phân bổ khoảng 70% bề mặt ni cấy tế bào xử lý trypsine cấy chuyển sang hộp lồng ni cấy 2.3.2 Phân tích chu kỳ tế bào Tác động phức hệ nano bạc – gallic acid lên chu kỳ tế bào tiến hành phân tích theo phương pháp nhuộm nhân với thuốc nhuộm PI (Propidium iodide) tóm tắt sau: 2x105 tế bào ung thư dày MKN45 nuôi cấy đĩa 24 giếng, 0,5 ml môi trường RMPI 1640 chứa 10% huyết bò Sau tế bào đạt đến mật độ khoảng 30% diện tích giếng, tiến hành xử lý môi trường chứa dịch chiết Đơn mặt trời nồng độ khác từ 0,05 – mg/ml 48h điều kiện 37oC, 5% CO2 Tiếp theo, xử lý tế bào 200 µl dung dịch trysin/EDTA (0,25%), ly tâm 1300 vòng/phút phút để thu nhận lại tế bào Nhuộm tế bào với dung dịch Fluorochrom (0,1% sodium citrate (w/v); 0,1% Triton X-100 (v/v), 50 mg/l PI nước khử ion vô trùng) thời gian 2h 4oC Chu kỳ tế bào phân tích hệ thống Flow cytometry BD Accuri™ C6 Plus Toàn liệu nghiên cứu xử lý phần mềm thống kê GraphPad Prism 5.0 2.3.3 Phương pháp tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA RNA tổng số tế bào MKN45 tách chiết Trizol theo hướng dẫn nhà sản xuất (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) Tế bào nuôi cấy đĩa giếng bổ sung 1000 µl Trizol, dùng pipette 1ml mix nhiều lần để tách tế bào khỏi bề mặt đĩa Ủ tế bào nhiệt độ phòng phút, sau ly tâm 12.000 rpm 10 phút 4oC Chuyển dịch sang ống eppendorf 12 Bổ sung ml chloroform, vontex mẫu 15 giây ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm 10.000 rpm/phút 15 phút 4oC Hút thận trọng dung dịch pha sang ống eppendoft Bổ sung 500µl Isopropanol ủ 10 phút nhiệt độ phịng sau ly tâm 10.000 rpm/phút 10 phút Loại bỏ dịch rửa RNA 1ml Ethanol 75% cách ly tâm 7000 rpm/phút phút 4oC, lặp lại lần Làm khô RNA 5-10 phút bổ sung 100 µl nước khử ion Đo quang phổ bước sóng 260/280nm máy đo quang phổ NanoDrop Sử dụng 1µg RNA để tạo cDNA Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (do Quiagen, Hilden, Germany cung cấp) theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.3.4 Phân tích biểu gen chủ chốt đường apoptosis Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho phản ứng PCR với tổng thể tích 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR Invitrogen cung cấp Danh sách gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương ứng trình bày bảng 2.1 Sự thay đổi mức độ biểu gen tính theo phương pháp Delta delta ct (ΔΔCt) Kết trình bày dạng trung bình lần lặp lại thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho lần thí nghiệm n=3 Dữ liệu thống kê phân tích phần mềm SPSS16.0F, sử dụng kiểm định Mann-Whitney Bảng 2.1 Danh sách trình tự mồi gen dùng nghiên cứu P 21 P 27 P21-F AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG P21-R TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG P27-F ATAAGGAAGCGACCTGCAACCG P27-R TTCTTGGGCGTCTGCTCCACAG 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thu từ thực nghiệm xử lý phầm mềm chuyên dụng Prism – GraphPad 4.0, tiến hành theo phương pháp phân tích Mann-Whitney Sự khác biệt có ý nghĩa với giá trị p < 0,05 13 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tác động phức hệ AgNPs-Gal ức chế phân chia tế bào ung thƣ dày MKN45 Để xác định tác động phức hệ AgNPs-Gal lên phân chia tế bào ung thư dày MKN45 môi trường nuôi cấy, dung dịch AgNPs-Gal với nồng độ 5-20-50-100-200 µM bổ sung vào mơi trường ni cấy tế bào có chứa tế bào KMN45 tiếp tục nuôi cấy Sau 48 nuôi cấy, tế bào xử lý quan sát kính hiển vi Hình 3.1A ghi lại kết hình ảnh tế bào ni cấy Hình 1A AgNPs-Gal tác động lên tăng sinh tế bào MKN45 điều kiện ni cấy 2D Thang đo 50 µm Quan sát kết ni cấy tế bào hình 3.1A cho thấy, mơi trường ni cấy khơng có AgNPs-Gal (nồng độ µM), tế bào KMN45 phát triển đồng bề mặt nuôi cấy, tế bào nuôi cấy có hình thoi dài ovan điển hình Như vậy, thấy mơi trường ni cấy sử dụng nghiên cứu phù hợp với sinh trưởng phát triển tế bào ung thư dày KMN45 Trong mơi trường ni cấy có chứa AgNPs-Gal với nồng độ µM Số lượng tế bào mơi trường ni cấy có suy giảm rõ rệt, mơi trường nuôi cấy xuất khoảng trống không quan sát tế bào phát triển, số lượng tế bào diện tích quan sát khoảng 60% so với môi trường đối chứng Như vậy, từ nồng độ µM, phức hệ AgNPs-Gal ức chế mạnh tăng sinh tế bào ung thư dày KMN45 dẫn đến giảm mạnh số lượng tế bào nuôi cấy quan sát đuwocj môi trường ni cấy Trong mơi trường ni cấy có chứa AgNPs-Gal với nồng độ 10-50-100200 µM, số lượng tế bào ni cấy quan sát diện tích tiếp tục suy 14 giảm với tăng lên nồng độ phức hệ AgNPs-Gal có mơi trường Đặc biệt, từ môi trường nuôi cấy chứa AgNPs-Gal nồng độ 100 µM, tế bào quan sát hầu hết có kiểu hình tế bào chết Để xác định ảnh hưởng phức hệ AgNPs-Gal lên phần trăm mức độ tăng sinh tế bào ung thư dày KMN45 điều kiện nuôi cấy, tiến hành xác định phần trăm mức độ tăng sinh tế bào theo mơi trường ni cấy có nồng độ AgNPs-Gal khác Kết nghiên cứu so sánh với mốc 100% môi trường đối chứng không chứa AgNPs-Gal (nồng độ µM) Kết phân tích thể hình 3.1B Kết hình 3.1B cho thấy mơi trường ni cấy có chứa AgNPs-Gal nồng độ µM, tỉ lệ tăng sinh tế bào ni cấy KMN45 môi trường giảm mạnh, 60% so với môi trường đối chứng Ở môi trường nuôi cấy chứa AgNPsGal nồng độ 20 tỷ lệ tăng sinh tế bào KMN45 môi trường nuôi cấy tiếp tục suy giảm khoảng 35% so với tế bào phát triển môi trường đối chứng Tỷ lệ tăng sinh giảm xuống mức 22% môi trường ni cấy có nồng độ AgNPs-Gal 50 µM tiếp tục suy giảm thêm xuống 15% mức nồng độ AgNPs-Gal 100 µM sau khơng giảm thêm nồng độ AgNPs-Gal môi trường nuôi cấy tăng lên 200 µM Nồng độ AgNPs-Gal mơi trường ức chế 50% phát triển tế bào ni cấy (IC50) xác định định 4.8 µM Hình 3.1B AgNPs-Gal ức chế tăng sinh tế bào MKN45 theo nồng độ *P< 0,05, n = Như vậy, từ kết nghiên cứu thấy phức hệ AgNPs-Gal có khả ức chế mạnh tăng sinh tế bào ung thư dày KMN45 điều kiện nuôi cấy nồng độ thấp, với tỷ lệ tăng sinh tế bào KMN45 giảm xuống tăng nồng độ AgNPs-Gal có mơi trường ni cấy Trong năm gần đây, phức hệ hạt nano bạc (AgNPs) hợp chất khác, đặc biệt hợp chất từ thực vật tổng hợp thử nghiệm 15 nhiều nghiên cứu Tác động phức hệ nano bạc lên tăng sinh tế bào ung thư chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố kích thước hạt nano bạc, chất tạo phức hệ, phương pháp tổng hợp loại tế bào chịu tác động [41] EINaggar cộng nghiên cứu tác động phức hệ AgNPs phycocyanin chiết xuất từ Nostoc linckia lên loại tế bào người khác xác định sau 48 tiếp xúc, giá trị IC50 phức hệ tế bào MCF7 27.79 ± 2,3 µg/ml; dòng tế bào nguyên bào phổi người (WI38) amnion người (WISH) 31,78 ± 2,2 32,97 ± 1,7 µg/ml Như vậy, so với dịng tế bào bình thường WI38 WISH, phức hệ AgNPs phycocyanin chiết xuất từ Nostoc linckia có tác dụng gây độc tế bào mạnh cho tế bào ung thư vú MCF-7 [42] Valsalam cộng tổng hợp xác định đặc tính phức hệ tạo thành từ AgNPs chiết xuất Tropaeolum majus L., theo đó, phức hệ nano bạc có khả ức chế tăng sinh tế bào Đối với dòng tế bào ung thư vú MCF7 giá trị IC50 công bố 2.49 μg/ml; dùng tế bào VERO giá trị xác định 5.3 μg/ml Kết nghiên cứu cho thấy tế bào ung thư vú MCF7 nhạy cảm với độc tính phức hệ nano bạc Hơn nữa, nghiên cứu việc tổng hợp phức hệ nano bạc làm tăng tính độc khả ức chế tăng sinh so với chiết xuất Tropaeolum majus sử dụng đơn lẻ [43] Satpathy cộng tổng hợp thành công phức hệ AgNPs chiết xuất Pueraria tuberosa đồng thời xác định khả ức chế tăng sinh phức hệ với dòng tế bào MCF-7, MDAMB-231, SKOV-3, U-87 NCI/ADR với giá trị IC50 3.859 µg/ml, 1.128 µg/ml, 29.36 µg/ml, 6.053 µg/ml 25,49 µg/ml [44] Thông qua kết nhiều nghiên cứu thấy mức độ ức chế tăng sinh phức hệ AgNPs có thay đổi lớn chất tạo thành phức hệ với nano bạc cụng mức độ nhạy cảm dòng tế bào khác với phức hệ 3.2 Tác động phức hệ AgNPs-Gal tác động lên pha chu kỳ phân chia tế bào MKN45 Để xác định tác động phức hệ AgNPs-Gal lên thay đổi pha chu kỳ phân chia tế bào ung thư dày KMN45 điều kiện nuôi cấy, chúng tơi tiến hành phân tích chu kỳ tế bào tế bào KMN45 nuôi cấy môi trường có chứa AgNPs-Gal nồng độ IC50, kết phân tích so sánh với tế bào KMN45 nuôi cấy môi trường đối chứng không chứa AgNPs-Gal (nồng độ µM) Kết phân tích ghi lại hình 3.2 16 Hình 3.2 AgNPs-Gal tác động lên chu kỳ tế bào ung thư dày MKN45 Quan sát kết phân tích chu kỳ tế bào hình 3.2 thấy được, tế bào ung thư dày KMN45 mơi trường có bổ sung AgNPs-Gal với nồng độ IC50 có thay đổi ttrong tỷ lệ pha chu kỳ tế bào Số lượng tế bào pha G0/G1 giảm mạnh, từ 58.4% (ở đối chứng) xuống 45.9% Tỷ lệ tế bào pha G2/M tăng lên rõ rệt, từ 23% đối chứng lên 33.6% môi trường AgNPs-Gal nồng độ IC50 Cùng với đó, tỷ lệ tế bào pha S khơng có thay đổi q rõ rệt Như vậy, kết nghiên cứu cho thấy phức hệ AgNPs-Gal có khả làm ngưng trệ chu kỳ phân chia tế bào ung thư dày KMN45 pha G2/M điều kiện nuôi cấy Chu kỳ tế bào đóng vai trị quan trong phát triển tồn tế bào Sự thay đổi chu kỳ tế bào gây tín bất thường phát triển tế bào, từ dẫn đến kích hoạt chế làm ngưng trệ chu kỳ tế bào gây chết tế bào thông qua apoptosis [45] Devanesan cộng công bố kết nghiên cứu xác đinh phức hệ AgNPs di-methyl flubendazole chiết xuất từ đu đủ Carica có tác dụng làm ngưng trệ chu kỳ tế bào tế bào ung thư gan HepG2 pha G0/G1 [46] Trên dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU145, phức hệ AgNPsPLE (phức hệ nano bạc chiết xuất đu đủ) có khả làm ngưng trệ chu kỳ tế bào pha G2/M sau 24 tiếp xúc [47] Phức hệ AgNPs-G (phứ hệ nano bạc glucose gây độc tính với tế bào ung thư biểu mơ tử cung Hela làm tích lũy tế bào Hela pha S G2/M môi trường ni cấy [48] Các phức hệ AgNPs có khả gây ngưng trệ chu kỳ tế bào, nhiên, khả gây ngưng trệ chu kỳ pha ngưng trệ chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố đặc biệt loại tế bào chịu tác động chất tạo phức hệ với AgNPs 3.3 Tác động phức hệ AgNPs-Gal lên trình apoptosis tế bào ung thƣ dày dịng MKN45 Q trình apoptosis đặc biệt quan tâm nghiên cứu ung thư với đặc điểm gây chết tế bào đơn lẻ nhóm nhỏ tế bào, đồng thời trình apoptosis gây chết tế bào mà khơng gây tượng viêm [35] Hơn nữa, trình chết apoptosis tế bào xử lý theo chế có sẵn thể mà khơng gây ảnh hưởng hay tổn hại đến tế bào xung quanh Chính vậy, nhắm 17 đích thúc đẩy tế bào ung thư tự chết apoptosis hướng nghiên cứu quan trọng điều trị ung thư Để đánh giá tác động phức hệ AgNPs-Gal lên trình apoptosis tế bào ung thư dày KMN45 môi trường nuôi cấy, nghiên cứu tiến hành xử lý tế bào nuôi cấy KMN45 với AgNPs-Gal nồng độ IC50, sau 48 giờ, tế bào nuôi cấy xử lý phân tích hệ thống Flow cytometry BD Accuri™ C6 Plus Hình 3.3 thể kết phân tích tỷ lệ tế bào apoptosis môi trường nuôi cấy chứa AgNPs-Gal nồng độ IC50 đối chứng không chứa AgNPs-Gal Hình 3.3 AgNPs-Gal tác động lên apoptosis tế bào MKN45 Kết phân tích hình 3.3 cho thấy, mơi trường đối chứng (nồng độ AgNPs-Gal µM) tế bào ung thư dày KMN45 môi trường có tỷ lệ tế bào apoptosis 8.7% Trong mơi trường có bổ sung phức hệ AgNPs-Gal nồng độ IC50, sau 48 tiếp xúc, tỷ lệ tế bào apoptosis tăng mạnh, lên mức 37.2% Như vậy, kết nghiên cứu xác định phức hệ AgNPs-Gal làm tăng tỷ lệ apoptosis tế bào ung thư dày KMN45 điều kiện in vitro Nano bạc (AgNPs) ghi nhận có khả gây độc tế bào thông qua tác động làm tăng cường tỷ lệ apoptosis dòng tế bào khác Jeyaraj cộng công bố kết nghiên cứu cho thấy phức hệ nano bạc phytochemical có khả ức chế tăng sinh kích hoạt q trình apoptosis dịng tế bào ung thư vú MCF7 Cụ thể, AgNPs làm tăng biểu gen Bax, Bcl2, caspases-6 9, PARP, p53 điều hịa giảm biểu Bcl-2 từ ảnh hưởng trực tiếp đến đường apoptosis nội sinh (phụ thuộc ty thể [49] Jang cộng xác định phức hệ AgNPs chiết xuất từ hoa Lonicera hypoglauca có tính độc đáng kể với dịng tế bào ung thư vú MCF7 thơng qua cảm ứng q trình apoptosis, nhiên, lại khơng gây độc cho tế bào miễn dịch bình thường RAW 264.7 [50] Phức hệ AgNps chiết xuất Beta vulgaris có khả gây độc cho dịng tế bào ung thư vú MCF7, ung thư phổi A549 ung thư họng Hep2 thơng qua cảm ứng q trình apoptosis điều kiện in vitro [51] 3.4 Tác động phức hệ AgNPs-Gal lên gen kiểm soát chu kỳ tế bào 18 trình apoptosis Chu kỳ tế bào q trình apoptosis có mối quan hệ chặt chẽ với thông qua nhiều chế khác Sự ngưng trệ chu kỳ dẫn tới tế bào thoát khỏi chu kỳ tế bào vào trình chết apoptosis Ngược lại, trình apoptosis kích hoạt có khả ức chế tiến triển chu kỳ tế bào [22] Protein p21 protein p27 yếu tố đóng vai trị vừa chất kiểm sốt chu kỳ tế bào đồng thời có tác động trực tiếp đến trình apoptosis Trong nghiên cứu này, để đánh giá tác động phức hệ AgNPs-Gal lên gen kiểm soát đồng thời chu kỳ tế bào apoptosis, tiến hành đánh giá tác động phức hệ AgNPs-Gal nồng độ IC50 sau 48 tiếp xúc lên biểu p21 p27 mức độ mRNA tế bào ung thư dày MKN4 Mức độ biểu mRNA so sánh với đối chứng biểu mRNA tương ứng tế bào ung thư dày KMN45 nuôi cấy môi trường khơng có chứa AgNPs-Gal Kết xác định biểu mRNA p21 p27 thể hình 3.5A 3.5B Protein p21 chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin (CKI) mạnh chất ức chế phức hợp cyclin/CDK, chủ yếu liên quan đến ức chế CDK2 Các tế bào có hoạt động p21 cao chuyển sang pha G0 đó, tế bào có biểu p21 thấp tiếp tục phân chia theo chu kỳ tế bào [52] Ngoài vai trị ức chế chu kỳ tế bào, p21 đóng vai trị quan trọng q trình lão hóa thông qua đường phụ thuộc p53 không phụ thuộc p53 p21 điều chỉnh chương trình tế bào khác trình apoptosis, phản ứng tổn thương DNA tái tạo xương tế bào actin Cảm ứng p21 dẫn đến ngăn chặn phát triển khối u thông qua việc ức chế phức hợp cyclin-kinase, kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh (PCNA), yếu tố phiên mã chất đơng hóa Cảm ứng p21 chứng minh quan trọng để thúc đẩy nhu động hình thành khối u tế bào ung thư [53] 19 Hình 3.4A Tác động AgNPs-Gal lên biểu mRNA p21 Kết hình 3.5A cho thấy, nồng độ IC50, sau 48 tiếp xúc với phức hệ AgNPs-Gal, mức độ biểu mRNA p21 tăng mạnh, lên mức 2.8 so với tế bào nuôi cấy môi trường đối chứng Singh cộng công bố kết nghiên cứu xác định phức hệ nano bạc (AgNps) chiết xuất đu đủ (PLE) có tác động làm ngưng trệ chu kỳ tế bào cảm ứng apoptosis dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU145 thông qua tăng cường mức độ biểu p21 [47] Halawani cộng nghiên cứu tác động phức hệ cefotaxime-CS-AgNPs lên tế bào người bình thường tế bào ung thu vú MCF7 Kết nghiên cứu cho thấy cefotaxime-CS-AgNPs khơng có tính độc với tế bào nồng độ thấp (đến 12 µg/ml 24 giờ), nhiên, tế bào ung thư vú MCF7, cefotaxime-CS-AgNPs có khả gây độc tế bào thơng qua cảm ứng apoptosis Các gen gen pro-apoptotic p53, p21 Bax tế bào MCF7 có biểu tăng đáng kể tiếp xúc với cefotaxime-CS-AgNPs với mức nồng độ hiệu xác định 24 µg/ml sau 48 [54] Hình 3.4B Tác động AgNPs-Gal lên biểu mRNA gen p27 Protein p27 tham gia vào điều hịa nhiều q trình khác tế bào di chuyển tế bào, ức chế phiên mã, autophagy, biệt hóa tế bào gốc, cytokinesis apoptosis P27 thường biết đến chất ức chế chu kỳ tế bào thông qua ức chế cyclin/CDK Sự bất thường cấu trúc mức độ biểu p27 ghi nhận nhiều loại ung thư khác [55] Trong nghiên cứu này, chúng tơi xác định phức hệ AgNPs-Gal có khả tác động đến biểu p27 mức độ mRNA Kết hình 3.5B cho thấy, sau 48 gờ tiếp xúc với AgNPs-Gal nồng độ IC50, mức độ biểu mRNA 20 p27 tế bào nuôi cấy ung thư dày MKN45 có gia tăng đáng kể, 1.8 lần mức độ biểu tế bào đối chứng Sự thay đổi mức độ biểu p27 tác động AgNPs khác ghi nhận nghiên cứu Singh cộng Nghiên cứu xác nhận phức hợp AgNPs chiết xuất đu đủ Carica làm tăng biểu protein p27 tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU145 điều kiện nuôi cấy [47] Như vậy, kết nghiên cứu phức hệ AgNPs-Gal có khả ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào trình apoptosis tế bào ung thư dày MKN45 thông qua điều chỉnh tăng cường hoạt động gen điều hòa p21 p27 Đặc biệt mức độ hoạt động gen p21 p27 mức độ mRNA có tăng cường lớn so với đối chứng 3.5 Tác động phức hệ AgNPs-Gal lên điều hòa khả tự làm tế bào ung thƣ dày dịng MKN45 Các tế bào gốc (stem cell) có đặc điểm chung khả tự làm (self-renewal) khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác Sự điều chỉnh khả tự làm biệt hóa tế bào gốc chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố phiên mã Oct4, Sox2, Nanog, KLF4 MYC [56] Trong khối u, gen tự làm tế bào Sox2, Nanog, Oct4 KLF4 thường có xu hướng hoạt động mạnh để tăng cường khả tự làm tế bào ung thư Sự hoạt động gen thường tế bào gốc ung thư, liên quan mật thiết tới đặc tính tế bào gốc ung thư khả phân chia, biệt hóa, kháng thuốc di Đặc biệt, tế bào có biểu mạnh gen thường có khả kháng lại trình apoptosis, dẫn tới kết tế bào có khả sống sót cao bị xử lý với thuốc đồng thời trì khả phân chia nhiều lần so với tế bào khác [57] Trong nghiên cứu này, để xác định ảnh hưởng phức hệ AgNPs-Gal lên khả tự làm tế bào ung thư dày MKN45, tiến hành xác định mức độ biểu gen mức độ mRNA gen điều hịa q trình tự làm quan trọng dòng tế bào gốc ung thư quan tâm KLF4 Sox2 tế bào tiếp xúc với phức hệ AgNPs-Gal 48 , nồng độ IC50 Kết phân tích mức độ biểu gen so sánh với biểu gen tương ứng tế bào MKN45 nuôi cấy môi trường đối chứng (nồng độ AgNPs-Gal µM) Kết phân tích biểu mRNA KLF4 thể hình 3.6A kết phân tích mRNA Sox2 ghi lại hình 3.6B 21 Hình 3.5A AgNPs-Gal tác động lên biểu mRNA KLF4 KLF4 hoạt động yếu tố phiên mã điều chỉnh chức sinh học khác cách kích hoạt ức chế mạng lưới gen liên quan đến kiện phát triển tồn tế bào Sự tích tụ KLF4 mơ thuộc đường tiêu hóa tuyến tụy thúc đẩy trình biến đổi ác tính [58] KLF4 bốn yếu tố để tạo tế bào gốc đa năng, suy giảm hoạt động KLF4 dẫn đến suy giàm “tính gốc” tế bào gốc ung thư Kết phân tích biểu mRNA gen KLF4 hình 3.6A cho thấy, sau 48 tiếp xúc với phức hệ AgNPs-Gal nồng độ IC50, biểu gen KLF4 mức độ mRNA có sụt giảm nghiêm trọng, khoảng 30% so với biểu mRNA tương ứng té bào KMN45 nuôi cấy môi trường đối chứng khơng có chứa AgNPs-Gal Như vậy, phức hệ AgNPs-Gal có khả làm suy giảm “tính gốc” (khả tự làm mới) tế bào gốc ung thư dày MKN45 điều kiện nuôi cấy thông qua tác động làm suy giảm hoạt động KLF4 Sox2 yếu tố phiên mã quan trọng tế bào gốc ung thư Sox2 trì trình tự đổi tế bào gốc, thúc đẩy hình thành khối u ức chế biết hóa tế bào gốc ung thư (duy trì “đặc tính gốc” tế bào gốc ung thư) [57] Sự gia tăng biểu Sox2 ghi nhận nhiều loại tế bào ung thư khác giúp trì kiểu hình tế bào gốc biệt hóa Kết phân tích biểu mRNA gen Sox2 tế bào ung thư dày MKN45 sau 48 tiêp xúc với phức hệ AgNPs-Gal nồng độ IC50 cho thấy, mức độ biểu mRNA Sox2 suy giảm đáng kể so với đối chứng Mức độ biểu mRNA tế bào chịu tác động AgNPs-Gal băng khoảng 55% so với tế bào đối chứng không tiếp xúc với AgNPs-Gal Qua kết nghiên cứu thấy phức hệ AgNPs-Gal có khả làm suy giảm đặc tính quan trọng tế bào gốc ung thư khả tự làm thông qua điều chỉnh giảm hoạt động gen quan trọng trì “đặc tính gốc” tế bào KL4 Sox2 22 Hình 3.5B AgNPs-Gal tác động lên biểu mRNA Sox2 Trong nghiên cứu khác, nhóm nghiên cứu Gurunathan nhận thấy phức hệ nano bạc Graphene oxide (GO-AgNPs) có khả làm giảm mức độ biểu gen liên quan đến trình tự đổi tế bào SH-SY5Y (tế bào giống nguyên bào thần kinh) Cụ thể, GO-AgNPs làm giảm biểu mức độ khác tất gen quan trọng liên quan đến tự làm xác định REX1, NANOG, OCT3/4, SOX2, C-MYC, DAX1, FOXD3 KLF4 Hơn nữa, nghiên cứu mức giảm biểu gen tự làm chịu tác động phức hệ GO-AgNPs lớn nhiều so với mức giảm biểu gen chịu tác động AgNPs hay GO Như thấy, tạo thành phức hệ nano bạc làm tăng hoạt tính hợp chất [59] 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Phức hệ AgNPs-Gal có khả ức chế phân chia tế bào ung thư dày MKN45 môi trương ni cấy Phức hệ AgNPs-Gal có tác động làm ngưng trệ chu kỳ phân chia tế bào ung thư dày KMN45 pha G2/M chu kỳ tế bào Phức hệ AgNPs-Gal làm tăng tỷ lệ tế bào apoptosis tế bào ung thư dày KMN45 điều kiện in vitro Phức hệ AgNPs-Gal làm giảm biểu mRNA p21 p27 có liên quan đến kiểm sốt chu kỳ tế bào trình apoptosis Phức hệ AgNPs-Gal có tác độn làm giảm biểu gen liên quan đến trình tự làm tế bào gốc KLF4 Sox2 Kết luận chung: Trong điều kiện ni cấy, phức hệ AgNPs-Gal có tác động có khả ức chế tăng sinh cảm ứng apoptosis giảm khả tự làm tế bào gốc ung thư dày MKN45 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng phức hệ AgNPs-Gal lên phát triển dòng tế bào ung thư dày gen quan trọng khác tế bào gốc ung thư