TỔNG QUAN
Tổng quan Thiên niên kiện
Tên dược liệu: Rhizoma Homalomenae
Tên thực vật: Homalomena occulta (Lour.) Schott
Tên thường gọi: Thiên niên kiện
Tên khác: Bao kim, ráy hương, sơn thục, vắt vẻo, vạt hương (Tày), hìa hấu ton (Dao), t’rao yêng (K’Ho), duyên (Ba Na).
Hình 1.1 Cây Thiên niên kiện
Thiên niên kiện là cây thân thảo to Thân rễ dài mọc bò ngang, thẳng hay cong queo, có nhiều đốt, bẻ ra có xơ cứng và có mùi thơm Lá mọc tập trung ở đầu thân rễ có thể dài đến 30 cm, rộng 18 cm Cuống lá dài 27 - 50 cm, gốc cuống phình và xòe ra chiếm 1/3 cuống tính từ dưới lên.
Cụm hoa là một bông mo hình lục nhạt, mỗi khóm thường có 3 - 4 bông mo. Cuống bông mo dài 5 - 15 cm Phần mang hoa cái hình bầu dục chỉ dài bằng một nửa phần mang hoa đực không có bao hoa Hoa cái có nhị lép hình khối, dài bằng đầu nhụy, bầu hình trứng, điểm những chấm mờ, noãn nhiều Hoa đực có bốn nhị rời, chỉ nhị rộng rất ngắn, bao phấn song song Quả mọng chứa nhiều hạt có vân. Mùa hoa vào tháng 4 - tháng 6, mùa quả tháng 8 - tháng 10.
Cây có công dụng tương tự: loài Homalomena tonkinensin Engl.,
Homalomena gigantea Engl., Homalomena pieereana Engl.
Thiên niên kiện là cây ưa ẩm và ưa bóng điển hình, thường mọc thành đám dọc theo các bờ khe suối dưới tán rừng kín Cây sinh trưởng và phát triển nhanh trong mùa mưa ẩm Mỗi năm cây mọc ra 3 - 5 lá mới, các lá cũ tồn tại trên một năm thì bị thay thế, đồng thời phần thân rễ cũng phát triển dài thêm từ 3 - 6 cm Thiên niên kiện có khả năng sinh chồi gốc khỏe Trong tự nhiên, cây thường tạo thành khóm với nhiều nhánh thân rễ từ gốc Cây trưởng thành ra hoa quả hàng năm Mặc dù số hạt trên mỗi bông khá nhiều (10 - 30), nhưng lượng cây con mọc từ hạt ít Cây trồng được bằng hạt và các đoạn thân rễ
Chi Homalomena Schott phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và châu
Mỹ Loài Thiên niên kiện Homalomena occulta có vùng phân bố rộng từ các tỉnh Nam Trung Quốc đến các nước trên bán đảo Đông Dương và khu vực Đông Nam Á Trong khi đó, loài Thiên niên kiện lá to chỉ thấy ở Trung Quốc và Việt Nam
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
Việt Nam 4 loài được dùng làm thuốc: Homalomena occulta (Lour.) Schott phân bố khá phổ biến ở các tỉnh vùng núi, cả ở miền Nam lẫn miền Bắc (độ cao phân bố từ 300 - 700 m hoặc hơn); Homalomena gigantea Engl có tên khác là Thiên niên kiện lá to được phát hiện ở xã Đinh Trang Hòa, Đinh Trang Thượng, huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng, vùng rừng Suối Lạnh thuộc xã Hòa Thịnh, huyện Tuy Hòa, tỉnh Phú Yên và vùng rừng Khe Lét, Hương Sơn tỉnh Hà Tĩnh (độ cao phân bố từ 100 - 600 m, riêng ở Khe Lét đã trên 700 m); Homalomena pieereana Engl., Thần phục hay Thiên niên kiện lá hình thìa, mới phát hiện được ở 2 điểm thuộc một số xã huyện Phước Sơn và Trà My tỉnh Quảng Nam (độ cao 600 - 700 m); Ngoài ra còn có loài Homalomena cochinchinensis Engl cũng ở phía Nam. Trong số 4 loài trên, loài Homalomena occulta có vùng phân bố rộng nhất Tất cả đều được khai thác Tất cả các loài này đều được khai thác và thu mua ở Việt Nam.
Thiên niên kiện là cây thuốc quý của Việt Nam, có trữ lượng khá phong phú trong khu vực Lượng khai thác hàng năm, ước tính từ 200 - 500 tấn để cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu Tuy nhiên, do khai thác liên tục nhiều năm, nguồn cây thuốc này đã bị giảm sút nhiều Mặt khác, nạn phá rừng trầm trọng và triền miên cũng là nguyên nhân làm thu hẹp vùng phân bố tự nhiên của Thiên niên kiện.
Thân rễ cắt thành từng đoạn dài 10 - 27 cm, sấy nhanh ở nhiệt độ dưới 50 o C cho khô bề mặt ngoài, làm sạch vỏ và bỏ các rễ con rồi phơi sấy ở nhiệt độ 50 o -
Trong thân rễ có khoảng 0,8 - 1% tinh dầu tính theo rễ khô kiệt Tinh dầu màu vàng nhạt, mùi thơm dễ chịu Trong tinh dầu có chừng 40% l-linalol, một ít terpineol và chừng 2% este tính theo linalyl acetat Ngoài ra còn có sabinen, limonen, terpinen acetaldehyde, aldehyd propionic.
Trong dân gian, Thiên niên kiện thường được dùng chữa thấp khớp, đau nhức khớp, đau dạ dày, làm thuốc kích thích tiêu hoá Còn dùng trị đau bụng kinh, trừ sâu nhậy.
Thiên niên kiện còn là nguyên liệu chiết tinh dầu dùng làm hương liệu và là nguồn nguyên liệu chiết linalol. Ở Vân Nam (Trung Quốc), thân rễ Thiên niên kiện được dùng trị đòn ngã tổn thương, gãy xương, ngoại thương xuất huyết, tứ chi tê bại, đau dạ dày, viêm dạ dày và ruột, gân mạch khó co duỗi, phong thấp đau lưng đùi, loại phong thấp đau nhức khớp xương. Ở Ấn Độ, thân rễ Thiên niên kiện được dùng làm chất thơm và kích thích. Bột thân rễ cho vào thuốc lá hoặc trong thành phần các thuốc bột để hít Toàn cây được dùng chữa bệnh ngoài da Tinh dầu Thiên niên kiện được dùng làm hương liệu trong kỹ nghệ nước hoa.
Cách dùng: Ngày dùng 6 – 12 g dạng thuốc sắc hay ngâm rượu uống. Thường phối hợp với Cỏ xước, Thổ phục linh, Ðộc lực để trị tê thấp, nhức mỏi.
Cũng dùng tươi giã ngâm rượu xoa bóp chỗ đau nhức, tê bại và phong thấp Ðể trị
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
6 đau bụng kinh, thường phối hợp với rễ Bưởi bung, rễ Bướm bạc, gỗ Vang, rễ Sim rừng cùng sắc uống Ðể trừ sâu nhậy, dùng thân rễ khô tán bột rắc Lá tươi giã với ít muối đắp chữa nhọt độc.
1.1.7 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
1.1.7.1 Các nghiên cứu ngoài nước
Wang YF và cộng sự (2007) đã cô lập được 3 chất mới thuộc nhóm eudesmane sesquiterpenoid, và 8 chất đã biết trước gồm mucrolidin, 1β,4β,7α- trihydroxyeudesmane, 1β,4β,6β,11-terahydroxyeudesman, oplodiol, bullatantriol, acetylbullatantriol, homalomenol, maristeminol từ Homalomena occulta Các chất này đều có hoạt tính kháng khuẩn trên 6 dòng vi khuẩn khác nhau và hầu hết đều có tính kháng khuẩn yếu [26].
Năm 2008, nhóm nghiên cứu trường đại học dược ở Trung Quốc đã xác định thêm 2 chất sesquiterpenoid (6,7) trong rễ Homalomena occulta cùng với 5 chất đã biết trước đây oplodiol, oplopanone, homalomenol C, bullatantriol, và 1β,4β,7α- trihydroxyeudesmane, đồng thời người ta cũng chứng minh được rằng các chất trong nhóm sesquiterpenoid có khả năng làm tăng sinh và biệt hóa các tế bào tạo xương trong ống nghiệm [15] Năm 2009, nhóm nghiên này cũng đã phát hiện ra được 3 chất mới trong nhóm sesquiterpenoid là 6α,7α,10α–trihydroxyisoducane đã được cô lập từ rễ Homalomena occulta [16].
Năm 2012, nhóm nghiên cứu trường đại học Sains ở Malysia đã cô lập được một số chất mới thuộc nhóm sesquiterpenoid, 1α,4β,7β-eudesmanetriol (1) cùng với những hợp chất đã biết 1β,4β,7β-eudesmanetriol (2) và oplopanone (3) từ rễ
Homalomena sagittifolia Nhóm (1), (2) ức chế sự phát triển của vi khuẩn Pseudomonas stutzer, chống lại hoạt động của enzyme acetylcholinesterase
(enzyme phá hủy acetylcholin là chất trung gian dẫn truyền thần kinh) [27].
1.1.7.2 Các nghiên cứu trong nước
Thiên niên kiện là cây thuốc được trồng ở vườn nhà trong vùng ổn định của Vườn Quốc Gia Tam Đảo Việc kinh doanh các dược liệu của người dân địa chủ yếu là dạng tươi hay qua chế biến sơ bộ ở dạng thô (Trần Văn Ơn, 2002) Bên cạnh đó, Thiên niên kiện được thu hoạch từ khu bảo tồn thiên nhiên Tà Kóu, rễ được sử dụng bởi những thầy thuốc địa phương Thiên niên kiện là một trong những loại cây thuốc thường được bán đến những vùng khác Vì thế, trong đề nghị của dự án là cần tư liệu hoá và phổ biến kiến thức bản địa về cây thuốc để phục vụ cho việc bảo tồn có hiệu quả (Lưu Hồng Trường, 2006).
Tổng quan Bách bệnh
Bách bệnh (Eurycoma longofilia), còn gọi là cây Bá bệnh, mật nhân hay hậu phác nam, tho nan (Tày) là loài thuốc quý được sử dụng hàng trăm năm nay tại các quốc gia Đông Nam Á như: Malaysia, Indonesia, Campuchia, Thái Lan… Tên Mã Lai của cây này là “Tongkat ali”, tên Indonesia là “Pasak bumi” và tên tiếng anh là
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
Bách bệnh là loài cây gỗ nhỏ, có lông ở nhiều bộ phận Thân nhỏ, ít phân cành Lá kép hình lông chim mọc so le, cuống lá có màu nâu đỏ Mỗi lá kép gồm từ
4 – 21 lá chét, mọc đối, hình bầu dục Cuống lá chét rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu nhọn, bề mặt trên của lá bóng còn mặt dưới có lông màu xám
Cây Bách bệnh là loài đơn tính khác gốc, nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái Hoa chùm kép mọc ở thân hoặc đầu cành, cuống hoa có lông màu rỉ sắt. Hoa và bao hoa phủ đầy lông màu nâu đỏ, hoa có màu nâu đỏ hay màu vàng Bầu hoa có 5 noãn hơi dính ở gốc Hoa nở vào tháng 3 – tháng 4 và cây có quả vào tháng 5 – tháng 6 Quả non màu xanh, chín chuyển sang màu đỏ sẫm Quả hình trứng chứa một hạt, trên hạt có nhiều lông ngắn.
Cây thường mọc ở vùng đồi núi có sườn dốc cao, vùng đất cát có tính acid,nghèo chất dinh dưỡng, những nơi có nhiệt độ trung bình 25 o C và độ ẩm khoảng86%.
Eurycoma Jack là chi nhỏ gồm những đại diện là cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á Vùng Đông Nam Á, Bách bệnh được phân bố rộng rãi từ Myanmar tới các nước Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, đảo Sumatra, Borneo (Indonesia) và Philippin Loài này còn xuất hiện ở Nam Trung Quốc, Ấn Độ và một vài nước khác. Ở Việt Nam, Bách bệnh phân bố rải rác ở các tỉnh vùng núi thấp (dưới 1000m) và trung du Bách bệnh mọc phổ biến nhất là ở miền Trung, Tây Nguyên, Tây Ninh đặc biệt là vòng quanh Biên Hòa, Trảng Bom, Định Quán Đồng Nai Cây có thể chịu được bóng râm nên thường gặp ở dưới tán rừng tương đối nguyên sinh, rừng thứ sinh, và đôi khi ở cả đồi cây bụi ở trung du Cây mọc ở vùng đồi có chiều cao thấp nhưng khi mọc ở tán rừng ẩm có thể cao tới 5m có khi 7m Cây Bách bệnh ra hoa quả nhiều, số lượng cây con tái sinh từ hạt lại hạn chế do quả chín rụng vào mùa mưa bị lũ cuốn trôi mất Trong tự nhiên gặp nhiều cây chồi, điều đó chứng tỏ Bách bệnh có khả năng tái sinh tốt khi bị chặt phá.
Bộ phận dùng là rễ, vỏ thân và quả, lá dùng để làm thuốc
Trong vỏ và gỗ Bách bệnh người ta đã chiết được các chất sau:
Các hợp chất quasinoid: eurycomalacton, 6α-hydroxyeurymalacton, longilacton, 5,6-dehydroeurycomalacton, 14,15-β-dihydroxykalaineanon, 11- dehydroklaineanon, các quassinoid này có tác dụng diệt vi trùng sốt rét plamodium falcifarum đã kháng thuốc.
Các hợp chất triterpen loại tirucalan: niloticin, dihydroniloticin, piscidinol
A, bourjotinolon A, espisapelin A, melianon và hyspirdon.
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
Các alkaloid loại canthin-6-on: 9,10-dimethoxycanthin-6-on, 10-hydroxy-
9methoxy-canthin-6-on, alkaloid carbolin, 10-hydroxy-9-methoxy-canthin-6-on, 5,9-dimethoxycanthin-6-on và 9-methoxy-3-methyl-canthin-5,6-dion.
Từ rễ đã phân lập được 3 quassinoid: eurycomanol, eurycomanol 2-0-β-D glucopyanosid và 13β,18-dihydroeurycomanol.
Trong vỏ và rễ cây Bách bệnh có thành phần chất quasinoid, triterpenoid (niloticin, dihydroniloticin, piscidinol A, bourjotinolon A, episapelin A, hyspidron), alkaloid (carbolin, 9,10–dimethoxycanthin), chất đắng (Eurycomalacton) giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể Khả năng tăng cường sinh lý, tăng cường sức khỏe tình dục của cây Bách bệnh được ứng dụng trong một số sản phẩm Thuốc được sử dụng dưới dạng thực phẩm chức năng tại nhiều nước ở Châu Á, Tây Âu và Hoa kỳ Đặc biệt, một số nghiên cứu cho thấy cây Bách bệnh có khả năng tăng tiết testosteron (hormon giới tính nam).
Theo y học cổ truyền: Bách bệnh có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi thấp, lợi tiểu, lương huyết, chửa lỵ, thường dùng chữa chàm ở trẻ nhỏ, tiểu tiện ra máu, nhức mỏi, ăn không tiêu, đầy hơi, chướng bụng… Ngày dùng 4 – 6 g dưới dạng thuốc sắc hay phối hợp với các vị thuốc khác.
1.2.7 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
Nghiên cứu về hiệu quả trị bệnh từ cây Eurycoma longifolia đã làm tăng lượng tinh dịch ở nam giới, nồng độ tinh trùng, tỉ lệ hình thái, nhu động của tinh trùng bình thường Nhóm nghiên cứu Tambi và cộng sự (2010) nghiên cứu trên 350 bệnh nhân uống liều 200 mg chiết xuất từ Eurycoma longifolia, cho uống hàng ngày và theo dõi chu kỳ 3 tháng 1 lần trong vòng 9 tháng Trong số 350 bệnh nhân thì có
75 bệnh nhân được khám đủ 3 lần trong 9 tháng Phân tích tinh dịch thì những bệnh nhân đều có tinh dịch tăng lên đáng kể [24].
Miyake và cộng sự (2010) đã cô lập được 24 chất quassinoid từ rễ eurycoma được phát hiện ra là những chất có tác dụng gây độc đến tế bào, chống lại 4 dòng tế bào ung thư, bao gồm 3 dòng tế bào ở chuột [ dòng ung thư đại tràng (26-L5), u ác tính (B16-BL6) và tế bào ung thư phổi (LLC)], và dòng tế bào phổi ở người (A549) [19].
Shuid và cộng sự (2011) nghiên cứu trên mô hình chuột 12 tháng tuổi gây loãng xương Sau 6 tuần thì nhóm cho uống Eurycoma longifolia và nhóm thay thế testosterone có thể ngăn chặn sự mất canxi xương ở chuột Eurycoma có tiềm năng trong điều trị bệnh loãng xương thiếu hụt androgen [23].
Low và cộng sự (2011) đã phân tích huyết tương để tìm hiểu về thời gian bán hủy của 4 chất thuộc nhóm quasinoid gồm 13α(21)-epoxyeurycomaone (EP), eurycomanone (EN), 13α,21-dihydroeurycomanone (ED), eurycomanaol (EL) sau khi cho chuột uống Fr 2 (chiết xuất từ trong Eurycoma longifolia Jack ) liều 200 mg/kg và tiêm qua đường tĩnh mạch liều 10 mg/kg Qua phân tích thấy EP và EN xuất hiện trong huyết tương, EP có thời gian bán hủy lâu hơn và nồng độ cao hơn. Còn EL, EP không thấy xuất hiện trong huyết tương vì nó biến chất trong dịch tiết của dạ dày sau 2 giờ EP và EN có thể là những chất có tác dụng trong điều trị bệnh sốt rét [17].
Eurycoma longifolia Jack được biết đến là một loại thảo dược trị các bệnh stress và có tác dụng tăng lực, còn có tác dụng làm tăng kích dục và testosterol khi nghiên cứu trên chuột Tambi và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu trực tiếp trên người, tiến hành cho 76 người trong 320 người bệnh nhân bị suy giảm testosterol uống Eurycoma longifolia với liều 200 mg trong vòng 1 tháng Kết quả là có sự tăng testosteron trong huyết thanh [25].
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
Năm 2006, đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Bách bệnh Các bước nghiên cứu ban đầu cho thấy cây Bách bệnh của Việt Nam có tác dụng không kém, có phần vượt trội so với xuất xứ từ các nước khác
Dương Thị Ly Hương, Trịnh Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Hải Hà, trường đại học Dược Hà Nội, nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống trắng ở dịch chiết nước rễ cây Bách bệnh thì thấy rằng ở liều uống 10 ml/kg thể trọng, trọng lượng các cơ quan sinh dục cơ nâng hậu môn, tinh hoàn, túi tinh đều tăng hoặc có xu hướng tăng ở các lô chuột uống dịch chiết rễ Bách bệnh Mức độ tăng ở lô dùng testosteron cao hơn rất nhiều so với lô dùng Bách bệnh (p < 0,0001).
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất, trang thiết bị, đối tượng nghiên cứu
Cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh được cung cấp từ BM Hóa-Chế phẩm, Trung tâm Sâm và Dược Liệu TPHCM Mẫu cao được tiêu chuẩn hóa theo các quy định của Dược điển Việt Nam IV và tiêu chuẩn cơ sở.
Aspirin pH8 (viên bao phim, chứa acid acetylsalicylic 500 mg, Mekophar) Acid acetic 0,6%
Nước muối sinh lý 0,9% Đệm phosphat 50mM
Các bộ kit định lượng protein toàn phần, triglyceride, urea, creatinin, GOT, GPT được cung cấp bởi hãng Human, Đức.
Hộp nhựa nuôi chuột, chai nước có đầu uống
Cân kỹ thuật Mettler Toledo AB204
Thiết bị đo thể tích chân chuột UgoBasile, Italia
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
Thiết bị nghiền đồng thể (IKA Works (Asia) Sdm.Bhđ, Malaysia)
Máy đo quang UV – Vis Heiosy (Unicam Limitted – Anh), cuvette thạch anh.
Máy ly tâm lạnh Sartorius (Germany)
Máy xét nghiệm các chỉ tiêu sinh hóa Screen Master 3000 (Arezzo, Italy) Ống lấy máu EDTA, Heparin chống đông máu
Micropipet cỏc loại 10 – 100 àl, 100 – 1000 àl. Ống nghiệm, giá ống nghiệm, kim, kéo, kẹp, bàn phẫu thuật và các dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm.
Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino trưởng thành được cung cấp bởi Viện Pasteur Nha Trang và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Chuột nuôi trong các lồng nhựa, mỗi lồng 10 con chuột Chuột được nuôi đầy đủ bằng thức ăn: thực phẩm viên được cung cấp bởi viện Pasteur Nha Trang.
Thể tích cho chuột uống và tiêm là 0,1 ml/10 g thể trọng chuột Thời gian cho chuột uống thuốc ở các thử nghiệm khoảng 8 – 9 giờ sáng.
Hình 2.1 Chuột chủng Swiss albino
Các phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý
2.2.1 Khảo sát độc tính cấp đường uống [2],[3],[8] Độc tính cấp của thuốc là độc tính xảy ra sau khi dùng thuốc một lần hoặc nhiều lần trong ngày.[3]
Nghiên cứu độc tính cấp của mẫu thử trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình nếu có (liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm LD50 lethal dose 50%) trong những điều kiện nhất định Biết LD50 mới xác định được chỉ số điều trị TI là một thông số rất quan trọng để quyết định liều điều trị, thường là khoảng 1/10 LD50 hoặc nhỏ hơn Chỉ số điều trị TI (therapeutic index) là tỉ số giữa liều chết trung bình LD50 và liều hữu hiệu trung bình ED50: [3]
Cho chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh ở liều tối đa mà thuốc có thể bơm qua kim tiêm (liều 0,2 ml/10 g thể trọng) [8] Cao thuốc được đưa vào dạ dày chuột bằng một kim cong đầu tù qua đường miệng Theo dõi và ghi nhận tình trạng chuột bình thường, hay các triệu chứng bệnh quan trọng ở chuột không chết hoặc trước khi chết (gãi mõm liên tục, chạy hoảng loạn, ngã xiêu vẹo, co giật, run rẩy, ra mồ hôi, tím tái ở tai, chân, đuôi, tư thế nằm, đứng ) và số chuột chết trong vòng 72 giờ Có 3 trường hợp xảy ra [2]:
Trường hợp 1: nếu cho chuột uống cao thuốc mà không có con nào chết thì ta tìm được liều cao nhất bơm qua kim tiêm mà không làm chết, được ký hiệu là
Dmax và liều tương đối an toàn Ds dùng cho thực nghiệm dược lý có thể bằng 1/5
Dmax hoặc lớn hơn 1/5 Dmax.
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
Trường hợp 2: nếu cho chuột uống mà tỉ lệ chết là 100 % thì đây là liều chết tuyệt đối, được ký hiệu là LD100 Ta tiếp tục tìm liều không làm chết con vật nào (liều LD0) sau đó suy ra liều LD50 LD50 được tính theo phương pháp Karber- Behrens.
Trường hợp 3: đã thử đến liều có động vật thí nghiệm chết, nhưng không có liều nào đạt mức độ chết 100% Khi đó tuy không xác định được LD50, nhưng vẫn xác định được liều tối đa mà không có con vật nào chết, gọi là liều dưới liều chết (infralethal dose) và được ký hiệu là LD0 Liều tương đối an toàn Ds dùng cho thực nghiệm dược lý được lấy giá trị bằng 1/5 - 1/10 LD0.
Khi cho chuột uống cao thuốc phải cho uống chậm và cẩn thận, nếu cho uống nhanh chuột dễ bị tắt thở, gây tổn thương đến cổ họng và dẫn đến chết.
2.2.2 Khảo sát độc tính bán trường diễn [2], [4], [6], [7]
Khảo sát tính an toàn của cao phối hợp Thiên niện kiện và Bách bệnh trong một thời gian dài sau khi uống, nếu có độc tính thì không được sử dụng lâu dài.
Cao thử nghiệm được hòa trong nước cất và cho chuột nhắt trắng uống với thể tích 0,1 ml/kg thể trọng chuột liên tiếp trong 60 ngày Thực hiện song song với lô chứng (chỉ uống nước cất)
Chọn chuột có trọng lượng 25 ± 2 g Chia lô thí lô chứng cho chuột uống nước cất, lô thử cho chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh Chuột uống liên tục trong vòng 2 tháng Lấy máu ở đuôi chuột xét nghiệm (lấy máu vào buổi sáng trước khi cho chuột ăn).
Thời điểm xét nghiệm: trước thử nghiệm, sau 1 tháng, sau 2 tháng, riêng các xét nghiệm đại thể lấy gan, tim, thận tiến hành lúc sau kết thúc thí nghiệm.
Các chỉ tiêu đánh giá: trọng lượng cơ thể, thông số huyết học (hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, tiểu cầu), thông số thuộc chức năng gan (GOT, GPT, protein toàn phần), thông số thuộc chức năng thận (creatinin, urea), triglyceride, trọng lượng gan, tim, thận.
2.2.2.3 Các thông số theo dõi a Theo dõi thể trọng cơ thể chuột
Ghi nhận trọng lượng cơ thể trước thử nghiệm, sau 1 tháng và sau 2 tháng để theo dõi tình trạng sức khỏe, khả năng hấp thu dinh dưỡng của chuột. b Các thông số huyết học [2], [6]
Số lượng và chất lượng các tế bào máu phản ánh tình trạng của cơ quan tạo máu Nếu thuốc tác động đến cơ quan tạo máu sẽ làm thay đổi số lượng và chất lượng các tế bào máu Những thông số huyết học thường tiến hành khi nghiên cứu độc tính trường diễn gồm:
Hồng cầu được sinh ra ở tủy xương và phát triển qua nhiều giai đoạn: tiền nguyên hồng cầu – nguyên hồng cầu ưa base – nguyên hồng cầu đa sắc – nguyên hồng cầu ưa acid – hồng cầu lưới và cuối cùng là hồng cầu trưởng thành hoạt động ở máu ngoại vi Những yếu tố cần cho sự sinh sản của dòng hồng cầu gồm: protein,
Fe 2+ , acid folic, vitamin B12 Hồng cầu có chức năng quan trọng nhất là vận chuyển oxy đến cho cơ thể và lấy CO2 ra khỏi cơ thể Ngoài ra, hồng cầu còn có một số enzym thuộc hệ thống enzym tiêu glucide, catalase, anhydrase carbonic và một số enzym khác. Để đánh giá sự ảnh hưởng của cao thuốc đến hồng cầu, tiến hành đếm số lượng hồng cầu trong một thể tích nhất định, đo thể tích hồng cầu.
Số lượng hồng cầu được biểu thị bằng tế bào hồng cầu/mm 3
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
Hemoglobin có vai trò quan trọng trong vận chuyển O2 từ phổi đến các mô do phân tử hemoglobin kết hợp với phân tử để tạo thành oxyhemoglobin theo phản ứng thuận nghịch:
KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Độc tính cấp
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của cao phối hợp
(g cao/kg thể trọng) Số chuột thử Số chuột chết
Bảng kết quả ghi nhận phân suất tử vong sau 72 giờ cho thấy liều tối đa của cao đặc phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh có thể bơm qua kim cho chuột nhắt trắng uống là 25 g/kg thể trọng chuột có phân suất tử vong là 60% Do đó không thể xác định được LD50 nhưng vẫn xác định được liều tối đa mà không có chuột nào chết, gọi là liều dưới liều chết LD0 = 21,5g cao/kg thể trọng chuột.
Sau khi uống cao đặc phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh liều 25 g/kg (liều cao nhất có thể bơm qua kim) chuột có biểu hiện đầu tiên là gãi mõm liên tục, hoạt động chậm, lông hơi xù, khó thở khoảng 2 – 3 giờ Sau 8 - 24 giờ thấy xuất
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
36 hiện chuột chết (tỉ lệ chuột chết 60 %) Số con chuột còn lại vẫn hoạt động và ăn uống bình thường
Chúng tôi tiếp tục pha loãng cao thuốc với nước cất để tìm ra liều an toàn không gây chết chuột (liều này phải thấp hơn liều có độc tính 25 g/kg), sau khi pha loãng ta được liều 24,15 g/kg thể trọng Những biểu hiện của chuột sau khi uống cao thuốc đều tương tự như lần thí nghiệm đầu tiên Sau 72 giờ có 30 % tỉ lệ chuột chết, các con chuột còn lại vẫn hoạt động bình thường Vậy cao phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh ở liều 24,15 g/kg cũng là liều có độc tính gây chết chuột.
Chúng tôi tiếp tục pha loãng cao thuốc với nước cất được liều 21,5 g/kg Sau
72 giờ uống cao thuốc tất cả con chuột đều ăn uống và hoạt động bình thường.
Cao phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh liều 21,5 g/kg là liều tối đa cho chuột uống nhưng không làm chết chuột.
Bàn luận về độc tính cấp
Chuột biểu hiện khó thở trong thời gian 2 – 3 giờ đầu do chuột uống cao thuốc khá đặc lại ít tan trong nước cất Khi cho chuột uống cao thuốc được đưa xuống cổ họng, thì chuột sẽ nuốt để đưa cao thuốc xuống dạ dày Lúc này thanh quản nâng lên ép chặt vào sụn nắp thanh quản do đó trong lúc nuốt chuột tạm nín thở, cao khá đặc nên việc nuốt của chuột trở nên khó khăn và thời gian dài nên gây ảnh hưởng đến đường hô hấp biểu hiện trên tất cả số chuột thí nghiệm sau khi uống cao Thiên niên kiện – Bách bệnh.
Sau 8 – 24 giờ cho chuột uống cao thuốc có một số chuột di chuyển chậm và chết, lúc này thuốc đã có hoạt tính gây độc Gan giữ vai trò quan trọng trong chuyển hóa thuốc, khử độc tính hoặc thải ra trong nước tiểu Trường hợp NH3 sinh ra trong phản ứng khử độc cao thuốc ở gan (khử amin) được tổng hợp thành ure và được bài tiết vào máu, một phần bài tiết vào máu dưới dạng tự do hoặc gắn với acid glutamic thành glutamin nhưng cuối cùng đều bài xuất ở thận Độc tính của cao Thiên niên kiện – Bách bệnh khá cao nên lượng NH3 tăng nhiều trong máu gây rối loạn đến hoạt động thần kinh và hô hấp (khó thở) là nguyên nhân gây chết cho chuột [4], [6].
Bàn luận về liều tương đối an toàn
Liều tương đối an toàn Ds trên chuột nhắt trắng có thể được lấy giá trị bằng 1/5-1/10 hoặc nhỏ hơn (1/20 - 1/100) của LD0 Liều tương đối an toàn trên người được ngoại suy từ liều trên chuột nhắt trắng theo cách tính như sau: Liều trên chuột nhắt trắng x 0,085 (= hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa chuột nhắt trắng và người) x thể trọng trung bình ở người trưởng thành (# 50 kg)
Do đó, liều thử nghiệm được chọn cho các thử nghiệm tiếp theo: 1/10 LD0 2,15 g/kg và 1/20 = 1,075 g/kg LD0.
Độc tính bán trường diễn
3.2.1 Trọng lượng cơ thể chuột a Trọng lượng cơ thể chuột trước thử nghiệm, sau 7 ngày, sau 14 ngày
Bảng 3.2 Trọng lượng cơ thể chuột trước thử nghiệm, sau 7 ngày, sau 14 ngày Lô
Trọng lượng cơ thể (g) Trước thử nghiệm Sau 7 ngày Sau 14 ngày Chứng - 20,43 ± 0,51 23,64 ± 0,91 26,29 ± 1,14
Trọng lượng của chuột sau khi uống cao thuốc liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/ kg ở các thời điểm sau 7 ngày và sau 14 ngày không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
Vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg, liều 2,15 g/kg đều không có tác dụng làm tăng thể trọng chuột sau 7 ngày, sau 14 ngày.
Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện và Bách bệnh
38 b Trọng lượng cơ thể chuột trước thử nghiệm, sau 1 tháng, sau 2 tháng
Bảng 3.3 Trọng lượng chuột trước thử nghiệm, sau 1 tháng, sau 2 tháng
Trọng lượng cơ thể (g) (N) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 24,10 ± 0,23 30,90 ± 1,93 35,80 ± 1,76
Cao phối hợp TNK - BB 2,15 25,30 ± 0,33 29,20 ± 1,16 34,30 ± 1,78
Trọng lượng của chuột sau khi uống cao thuốc liều 2,15 g/kg ở các thời điểm sau 1 tháng và sau 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
Vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không có tác dụng làm tăng thể trọng chuột sau 1 tháng và sau 2 tháng.
3.2.2 Các thông số huyết học a Hồng cầu
Bảng 3.4 Số lượng hồng cầu
(g/kg) Số lượng hồng cầu (triệu tế bào/àl)
(N) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 5,10 ± 0,19 6,64 ± 0,42 a 6,23 ± 0,22 a
TNK - BB 2,15 5,17 ± 0,14 8,43 ± 0,20 ab 6,39 ± 0,24 a a: P < 0,05 so với trước thử nghiệm b: P < 0,05 so với lô chứng
Số lượng hồng cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện
- Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, sau 2 tháng tăng đạt ý nghĩa thống so với thời điểm trước thử nghiệm
Số lượng hồng cầu giữa lô chứng và lô uống cao phối lượng hồng cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg ở thời điểm trước thử nghiệm, sau 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê.
Số lượng hồng cầu ở uống cao phối hợp lượng hồng cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng nhưng vẫn nằm trong giới hạn trị số hồng cầu của chuột nhắt bình thường.
Như vậy cao phối hợp lượng hồng cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu trong máu b Hemoglobin
(N) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 7,59 ± 0,75 11,12 ± 0,65 a 11,37 ± 0,71 a
TNK - BB 2,15 7,40 ± 0,10 13,35 ± 0,37 ab 10,75 ± 0,31 a a: P