Luận Văn Báo Cáo Tổng Kết Khoa Học Kỹ Thuật Đề Tài Nghiên Cứu Xây Dựng Quy Trình Tổng Hợp Cyclophosphamide Làm Thuốc Điều Trị Ung Thư.pdf

Microsoft Word KC10 hoan thien doc viÖn ho¸ häc viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt CÇu GiÊy Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt ®Ò tµi "nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæ[.]

viện hoá học viện khoa học công nghệ việt nam 18 Đờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: "nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th" GS TSKH Trần Văn Sung 6500 10/9/2007 Hà Nội, - 2006 Bản quyền 2006 thuộc VHH - VAST Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi ®Õn ViƯn tr−ëng VHH - VAST trõ tr−êng hỵp sư dụng cho mục đích nghiên cứu viện hoá học viện khoa học công nghệ việt nam 18 Đờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: "nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th" GS TSKH Trần Văn Sung Hà Néi, - 2006 B¶n th¶o viÕt xong 1/ 2006 Tài liệu đợc chuẩn bị sở kết thực Đề tài cấp Nhà nớc, mà số KC 10 25 Danh s¸ch c¸n bé tham giathùc hiƯn đề tài Họ tên Cơ quan công tác Chủ nhiệm đề tài GS.TSKH Trần Văn Sung Viện Hoá học, Viện KH CNVN Cán tham gia nghiên cứu PGS TS Nguyễn Hữu Định Khoa Hoá Trờng ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội ThS Nguyễn Việt Thắng ThS Trần Văn Lộc ThS Trần Văn Chiến nt ThS Trần Đức Quân nt CN Phạm Thị Ninh nt TS TrÞnh ThÞ Thủ nt TS Nguyễn Thị Hoàng Anh nt TS Nguyễn Thanh Đạm 10 ThS Ngun Tut Mai 11 DS Lª TiÕn Dịng 12 TS Phùng Thị Vinh nt Viện Hoá học, Viện KH vµ CNVN BƯnh ViƯn K Hµ Néi nt XN D−ỵc phÈm TW I ViƯn KiĨm nghiƯm Mơc lơc Tr Bài tóm tắt Phần báo cáo 2.1 PhÇn tỉng quan 2.1.1 Cyclophosphamide 2.1.1.1 Cơ chế tác dụng cyclophosphamide 2.1.1.2 Tổng hợp cyclophosphamide Tiêu chuẩn cyclophosphamide đợc mô tả Dợc điển Tình hình nghiên cứu, sử dụng cyclophosphamide Việt Nam Các dạng sản phẩm cyclophosphamide nhu cÇu vỊ thc cyclophosphamide 11 2.1.2 TrÝch dÉn nội dung thuyết minh Đề tài 14 2.2 Các kết nghiên cứu Đề tài 19 2.2.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide 19 Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide 28 Nghiên cứu khẳng định cấu trúc hoá học sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp đợc Kiểm nghiệm sản phẩm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh, BP 2001 Nghiên cứu độc tính cấp bán cấp sản phẩm cyclophosphamide 29 2.2.5 Nghiên cứu bào chÕ thc cyclophosphamide pha tiªm 36 2.2.6 Nghiªn cøu thư nghiệm lâm sàng thuốc cyclophosphamide pha tiêm 39 2.2.6.1 Đề cơng nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 39 2.2.6.2 Kết nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 42 2.2.7 Nghiên cứu độ bền cyclophosphamide 48 2.2.7.1 Nghiên cứu độ bền nguyên liệu cyclophosphamide Nghiên cứu độ bền cyclophosphamide dung dịch nớc 48 Các kết kh¸c 50 2.1.1.3 2.1.1.4 2.1.1.5 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.7.2 2.2.8 13 32 33 49 KÕt luËn vµ kiÕn nghị 51 Báo cáo toán tài Lời cảm ơn Tài liệu tham khảo 55 Bài tóm tắt 1.1 Đặt vấn đề Hiện Việt Nam phải nhập lợng lớn thuốc cyclophosphamide để điều trị ung th số bệnh khác có nguyên nhân tự miễn Theo dự tính, hàng năm số tiền để nhập cyclophosphamide riêng cho nhu cầu chữa bệnh ung th khoảng 26 tỉ đồng Đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th" có mà số KC 10.25 đặt mục đích sau đây: ã Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide có tính khả thi, tính kinh tế cao ã Nghiên cứu độc tính cấp bán cấp cyclophosphamide; Kiểm nghiệm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh BP 2001 ã Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm dây chuyền GMP Thuốc bào chế xong phải đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm Dợc điển Anh BP 2001 ã Nghiên cứu đánh giá lâm sàng giai đoạn I thuốc cyclophosphamide tổng hợp đợc bệnh nhân ung th 1.2 Nguyên liệu phơng pháp nghiên cứu: 1.2.1 Nguyên liệu: Các hoá chất đợc sư dơng cã ®é tinh khiÕt P A cđa h·ng Merck, CHLB Đức 1.2.2 Phơng pháp nghiên cứu: ã Các phơng pháp dùng để phân tích cấu trúc cyclophosphamide tổng hợp đợc đại phù hợp nh phỉ MS, LC/MS, IR vµ NMR (1H -, 13C NMR) đợc thực Viện Hoá học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam ã Các phơng pháp tổng hợp đợc dựa theo patent Đức, Liên minh Châu Âu, Mỹ có kết hợp với tài liệu tham khảo khác, đợc thực trờng ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội Viện Hoá học, Viện KH CNVN ã Các phơng pháp nghiên cứu y dợc đợc sử dụng phơng pháp quy chuẩn Bộ Y tế, đợc thực quan khoa học Bộ Y tế định nh Viện Kiểm nghiệm, xí nghiệp Dợc phẩm TW I bệnh viện K Hà Nội 1.3 Các kết đà đạt đợc: ã Đà tiến hành nghiên cứu đề đợc quy trình khả thi có hiệu kinh tế ứng dụng quy trình để tổng hợp 4250 gam cyclophosphamide ã Đà đa đợc phổ chuẩn cyclophosphamide tổng hợp đợc gồm: IR, MS, LC/ MS, 1H -, 13C - NMR ã Sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp đà đợc nghiên cứu độc tính cấp độc tính bán cấp, đợc phân tích, kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh BP 2001 Tất tiêu chí đạt ã Cyclophosphamide đà đợc bào chế thành thuốc bột pha tiêm dây chuyền GMP xí nghiệp Dợc phẩm TW I Thuốc nớc cất pha tiêm đạt tiêu chuẩn BP 2001 ã Thuốc cyclophosphamide đà đợc nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I bệnh nhân ung th tình nguyện bệnh viện K Hà Nội Kết quả: Với liều 750 mg/ m2 da thể bệnh nhân có đáp ứng phần Liều 750 mg/ m2 da thể liỊu sư dơng an toµn 1.4 KÕt ln vµ kiÕn nghị ã Đề tài đà hoàn thành tốt mục tiêu đà đề theo tiến độ ã Thanh toán tài theo dự toán quy định nhà nớc ã Đề nghị Bộ Khoa học Công nghệ xem xét phê duyệt giai đoạn Đề tài để nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II III nhằm đánh giá hiệu chống ung th thuốc đa sản xuất, đáp ứng nhu cầu nớc, thay thuốc nhập Phần báo cáo 2.1 Phần tổng quan 2.1.1 Cyclophosphamide Cyclophosphamide có tên khoa học (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino] tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide N,N-bis-[2-chloroethyl] N,Otrimethylendiamidophosphat (I); công thức tổng C7H15Cl2N2O2P H2O, khối lợng phân tử 279,1 Công thức cấu tạo là: Cl O H2C N Cl H2C P O HN H2O I Tinh thÓ cyclophosphamide có màu trắng gần trắng, tan nớc, dƠ tan cån, tan võa ph¶i ete 2.1.1.1 Cơ chế tác dụng cyclophosphamide Cyclophosphamide đợc sử dụng nhiều lâm sàng với phổ tác dụng rộng hiệu bệnh ung th ngời Ngoài lý tác dụng điều trị, cyclophosphamide có chế tác dụng độc đáo tính chọn lọc điều trị Hiện cyclophosphamide loại thuốc chống ung th đợc sử dụng nhiều điều trị hoá chất liều cao với tổng liều lợng dùng 500 -700mg/m2 da ngời đến ngày Là loại hoạt chất dễ nitơ, cyclophosphamide đóng vai trò ankyl hoá ADN làm cho ADN không tháo rời đợc, không tạo thành ARN dẫn tới việc tái sản xuất tế bào bị kìm hÃm, trớc hết hệ tế bào phát triển nhanh nh tuyến tiết, da, tuỷ xơng đặc biệt u ác tính [1,2] Các hợp chất có tính ankyl hoá công vào trình trao đổi chất a xít nucleic kìm hÃm phát triển tiêu diệt tế bào bị bệnh Tuy nhiên, chúng công tế bào lành liều hiệu dụng chúng có độc tính đáng kể Theo tác giả Charlotte le Roux cộng chế alkyl hoá cyclophosphamide đợc lý giải nh sau [6]: O HO O P O P CH Cl H 2N NH N CH2 CH2 Cl N -H + +H + O O P H 2N CH2 CH2 Cl N CH2 CH2 Cl CH Cl CH2 CH2 Cl (A) Cyclophosphamide (I) - Cl O O P H 2N O CH2 CH2 Nu N CH2 CH2 Nu + Nu - O O - Cl - P H 2N (B) H 2N N CH CH2 Nu O P CH2 CH2 Nu N CH2 CH2 Cl + Nu - O - O P H 2N N CH2 CH Cl Trong thể cyclophosphamide giải phóng chất phosphoramidat (A) tác nhân alkyl hoá có hoạt tính sinh học Hoạt tính sinh học chất (A) đợc giải thích qua dÃy phản ứng bao gồm: đóng vòng nội phân tử; mở vòng nucleophil Quá trình lặp lại hai lần dẫn đến sản phẩm cuối đợc alkyl hoá hai lần (B) Tuy nhiên, chế xác trình alkyl hoá chất (A) vấn đề đợc biết Các bớc theo trình tự bao gồm chất azinidin trung gian đà đợc minh chứng thí nghiệm đơtêrô hoá Nhng liệu chất (A) tham gia phản ứng alkyl hoá nguyên vẹn hay liên kết P-N bị cắt trớc alkyl hoá tranh cÃi [6] Theo nguyên lý ''dạng vận chuyển" (transport) '' dạng hoạt tính '' (active form) biệt dợc chất có tác dụng ankyl hoá hoạt chất cần đợc đa vào thể ''dạng vận chuyển'' tức dạng cha có hoạt tính Dạng chuyển thành ''dạng hoạt tính'' thể vị trí cần điều trị có nghĩa làm tăng độ chọn lọc thuốc Ví dụ: Đối với chất dễ bị loại nitơ hợp chất chứa nhóm oxit nitơ (NO) '' dạng vận chuyển'' thực thụ Nguyên lý đà đợc áp dụng với loại thuốc chữa ung th tiền liệt tuyến stilbeoestroldiphosphate Nh đà biết thể ngời bệnh, phận bị ung th có tồn enzym dạng phosphamidasa phosphatasa thuỷ phân đợc liên kết phosphamide este axit phosphoric Với ý tởng là: độ chọn lọc thuốc tăng đáng kể, ''dạng hoạt tính'' đợc tạo thành trực tiếp vị trí cần điều trị, ngời ta đà tổng hợp chất phosphamide este II để nghiên cứu động dợc học cyclophosphamide Cl H2C NH N Cl H2C P R1 O O R2 II 2.1.1.2 Tổng hợp cyclophosphamide Cyclophosphamide đà đợc Arnold, Bourseaux Hirsch [3,4] tìm lần năm 1956 phòng nghiên cứu nhà máy Asta với ký hiệu B518 Việc tổng hợp chất kết mong muốn áp dụng nguyên lý ''dạng vận chuyển" '' dạng hoạt tính '' Cyclophosphamide đợc sử dụng điều trị ung th từ năm 1958 1970 [1] Ngoài ra, cyclophosphamide đợc sử dụng nh chất ức chế miễn dịch để điều trị bệnh tự miễn nh nhợc cơ, thấp khớp, lupút ban đỏ đặc biệt để chống thải ghép ca ghép tạng [19, 24, 25] Arnold, Bourseaux Brock [7] đà nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc hoạt tính kháng ung th hợp chất Kết thu đợc chất cyclophosphamide khả quan mặt dợc lý lâm sàng [4] Cơ chế biến đổi cyclophosphamide thể đà đợc C.L Roux cộng tiếp tục nghiên cứu [6] 1.2 Các kết nghiên cứu Đề tài: 1.2.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide: Qua công tác su tầm tham khảo tài liệu phơng pháp tổng hợp cyclophosphamide nhà khoa học giới [18 - 24], việc tổng hợp cyclophosphamide dựa theo quyền sáng chế nhà khoa học Đức [22 - 24] tơng đối thuận lợi có tính khả thi cao C¸c c¸n bé khoa häc cđa ViƯn Ho¸ häc, ViƯn Khoa học Công nghệ Việt Nam trờng Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội đà tiến hành nghiên cứu tìm đợc quy trình tổng hợp tinh chế cyclophosphamide dợc dụng tối u quy mô phòng thí nghiệm nh sau: Quy trình I: a/ Tổng hợp bis - (2 - chloroethyl) amine hydrochloride HOCH2CH2 ClCH2CH2 NH + SOCl2 NH HCl CHCl3 HOCH2CH2 ClCH2CH2 100 ml SOCl2 100 ml CHCl3 đợc nhỏ từ từ (khoảng 30 phút) vào hỗn hợp gồm 50 ml diethanol amine 100 ml CHCl3 Hỗn hợp phản ứng tự sôi lên, sau chuyển dần dạng suốt Đun hồi lu nhẹ cho bay hết khí SO2 HCl (khoảng 30 phút); giữ hỗn hợp phản ứng nhiệt độ phòng giờ; hạ lạnh xuống 10 oC; sản phẩm phản øng tù kÕt tinh, läc, rưa s¶n phÈm b»ng ete làm khô áp suất thấp Kết tinh lại sản phẩm dung môi aceton thu đợc 50g sản phÈm tinh: §nc = 216 - 217 oC, hiƯu st 59% b/ Tỉng hỵp cyclophosphamide O Et3N POCl3 + HO CH2CH2CH2 NH2 CH2Cl2 O P Cl NH + Et3N HCl (S¶n phÈm trung gian I) O O O P NH Cl CH2CH 2Cl + Et3N CH2CH2Cl O P N HCl HN CH2CH 2Cl NH CH2Cl2 + Et3N HCl CH2CH2Cl (Cyclophosphamide) + Tæng hợp "Sản phẩm trung gian I" Dung dịch gồm 76g (1 mol) 3-amino-1-propanol vµ 222g (2,2 mol) triethyl amine 1000 ml CH2Cl2 đợc làm lạnh tới -10 oC hỗn hợp đá muối Sau vừa khuấy vừa nhỏ vào dung dịch giọt dung dịch gồm 153g (1 mol) POCl3 500 ml CH2Cl2 đà đợc làm lạnh trớc Quá trình nhỏ giọt diễn khoảng giờ, cho phản ứng đợc trì nhiệt độ không vợt -10 oC Tiếp tục khuấy thêm nữa, ngừng khuấy, để qua đêm + Tổng hợp cyclophosphamide từ "Sản phẩm trung gian I" Vừa khuấy vừa cho từ từ dung dịch đà đợc làm lạnh tới -5 oC hỗn hợp đá muối 178,5g bis-(2-chloroethyl) amine hydrochloride hoµ tan 1000 ml CH2Cl2 vào hỗn hợp phản ứng Sau tiếp tục nhỏ thêm giọt 222 g Et3N Quá trình nhá giät diƠn kho¶ng giê, cho phản ứng đợc trì nhiệt độ không vợt -5 oC Tiếp tục khuấy nhiệt độ phòng thêm nữa, ngừng khuấy, làm lạnh Lọc bỏ kÕt tđa Et3N.HCl, rưa l¹i víi 500 ml CH2Cl2, thu lấy phần nớc lọc, cô quay dới áp suất thấp Phần cặn thu đợc đợc hoà tan 600 ml H2O, để qua đêm + oC Lọc, rửa kết tủa nớc lạnh, thu đợc 218 g (78%) cyclophosphamide sạch: Đnc = 41 - 45 oC Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide: Để thu đợc cyclophosphamide dợc dụng cần phải tinh chế sản phẩm cyclophosphamide mà Đề tài đà tổng hợp đợc Qua trình nghiên cứu thử nghiệm đà chọn đợc giải pháp tối u để tinh chế cyclophosphamide: Kết tinh lại cyclophosphamide hỗn hợp dung môi ethanol/ nớc với tỷ lệ : (v/v) Cơ thĨ nh− sau: 100 g cyclophosphamide đợc hoà tan 300 ml hỗn hợp dung môi [ethanol : nớc (3: 5)], cho thêm vào dung dịch 1g than hoạt tính (đợc làm từ xơng động vật), vừa khuấy vừa đun nóng bếp cách thuỷ nhiệt độ 50 55 o C khoảng 15 phút, lọc bỏ than hoạt tính Phần nớc đợc để kết tinh qua đêm +5 o C, lọc, làm khô dới áp suất thấp, thu đợc 60 g cyclophosphamide dợc dụng: Đnc = 41 - 42 o C Kết luận: ã Quy trình tổng hợp cyclophosphamide đợc mô tả quy trình có độ ổn định cao, s¶n phÈm phơ, dƠ tinh chÕ, thêi gian ph¶n øng ngắn cho hiệu suất thu hồi sản phẩm cao ã Quy trình áp dụng để tổng hợp cyclophosphamide lợng lớn ã Phơng pháp tinh chế sản phẩm đợc Đề tài sử dụng đơn giản để thu đợc cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn nguyên liệu dùng cho bào chế thuốc pha tiêm ã Giá thành sản phẩm cyclophosphamide dợc dụng sản xuất nớc theo Quy trình tổng hợp tinh chế đà đợc nêu vào khoảng 50 60 % giá thành thuốc nhập (ở tính giá nguyên liệu) 1.2.2 Nghiên cứu khẳng định cấu trúc hoá học sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp đợc: ã Viện Hoá học, Viện KH CNVN đà tiến hành xác định thông số vật lý đo phổ cyclophosphamide tổng hợp đợc, có so sánh với cyclophosphamide chuẩn CHLB Đức nh sau: - Điểm chảy cyclophosphamide: Đnc: = 42 - 44 oC, đợc đo máy đo điểm chảy IA 9200 hÃng Electrothermal (Đan Mạch) sản xuất - Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng: Trên mỏng tráng sẵn hÃng Merck GF254 với hệ dung môi là: acid formic : aceton : n−íc : methylethylketon (2 : : 12 : 80) Sản phẩm cho vệt hoàn toàn trùng với vệt cyclophosphamide chuẩn Đức - Sắc ký lỏng/ khối phổ (LC/ MS) đợc đo máy 1100 LC/ MSD Trap h·ng Agilent (Mü) s¶n xuÊt: Trên phổ đồ có pic với thời gian lu 18,4 phót, sè khèi m/z = 260,9 Pic 260,9 lµ pic cđa ion ph©n tư cđa cyclophosphamide Cyclophosphamide cđa §Ị tµi vµ cyclophosphamide chn cho cïng thêi gian l−u phổ khối - Phổ hồng ngoại (IR): Đo dạng viên nén KBr máy IMPACT 410 hÃng Carl Zeiss Jena (CHLB Đức) Phổ IR cho đỉnh ν*max = 3479, 3436, 3193, 2965, 1454, 1223, 1186, 1051, 743 cm -1, trïng víi phỉ chn - Phỉ céng hởng từ hạt nhân phân giải cao 1H - 13C - NMR đợc đo dung môi CDCl3; m¸y Bruker AVANCE 500 MHz + H - NMR: δ (ppm): 4,44 m (1H); 4,29 m (1H); 3,62 m (4H); 3,48 m (5H); 3,40 m (1H); 2,64 s br (1H); 1,95 m (1H); + 13 C - NMR: δ (ppm): 67,4; 48,7;42,3; 41,5; 25,8 (m = ®a béi; s br = đơn bội tù) + Kết luận: Tất phổ sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp đợc đà đợc so sánh với phổ thuốc Endoxan (cyclophosphamide) hÃng Baxter Oncology GmbH - CHLB Đức sản xuất, đợc Bệnh viện K sử dụng điều trị bệnh ung th Kết cho thấy, phổ sản phẩm hoàn toàn giống (Xem phần phụ lục) 1.2.3 Kiểm nghiệm sản phẩm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh, BP 2001: Viện Kiểm nghiểm, Bộ Y tế đà tiến hành phân tích sản phẩm cyclophosphamide Đề tài theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh, BP 2001 Kết đợc nêu dới đây: STT Yêu cầu Kết Mô tả: Tinh thể màu trắng Đúng Định tính: Phải thể phép thử định tính cyclophosphamide Đúng Độ màu sắc dung dịch: Phải đạt quy định Đạt 10 Kim loai nặng: Không 20ppm Hàm lợng nớc: từ 6,0 đến 7,0% pH: Tạp chất liên quan: tạp chất 1,0% Định lợng: Hàm lợng cyclophosphamide phải đạt từ 98,0 Đạt (99,3%) đến 102,0% tính theo chất khan Clorid: Không 330ppm Đạt 10 Phosphat: Không 10ppm Đạt từ 4,0 đến 6,0 (dung dịch 2% kl/ tt) Đạt Đạt (6,3%) Đạt (5,3) Đạt Kết kiểm nghiệm cho thấy: Sản phẩm cyclophosphamide đề tài tổng hợp đợc đà đạt tiêu chuẩn Dợc điển Anh, BP 2001 1.2.4 Nghiên cứu độc tính cấp bán cấp sản phẩm cyclophosphamide: Sản phẩm cyclophosphmide Đề tài tổng hợp đợc đà đợc tiến hành nghiên cứu tiền lâm sàng (tìm LD50, thử độc tính cấp, bán cấp, quan sát đại thể, soi vi thĨ gan, thËn cđa ®éng vËt thÝ nghiƯm) Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế Bộ môn Giải phẫu bệnh, thuộc trờng Đại học Y Hà Nội Kết thu đợc nh sau: a/ Độc tính cấp: ã Thử chuột nhắt, đà xác định đợc liều gây chết 50% (LD50) 485 mg/kg (414,5 -567,5 mg/kg) víi P = 0,05 (theo c¸ch tÝnh cđa LitchfieldWilcoxon) ã Thử chó để thăm dò liều tối đa dung nạp liều gây chết áp dụng phơng pháp cải tiến "Up and Down" để tìm liều tối đa dung nạp chó Kết (khi tiêm tĩnh mạch chó) đà xác định đợc: + Liều tối đa không gây chết (dung nạp): 35 mg/kg + Liều gây chết chó: 50 mg/kg + Các triệu chứng ngộ độc chó quan sát đợc chủ yếu nôn, buồn nôn, chán ăn, mệt mỏi Mức liều cao gây triệu chứng nặng kèm theo xuất huyết đờng tiêu hóa, đờng niệu, xỉu dần chết 11 Độc tính bán cấp: b/ Kết quả: + Với hai mức liều 20mg/ kg/ lần 100mg/ kg/ lần so với nhóm chứng cha nhận thấy biểu khác đáng kĨ ë nhãm thá dïng liỊu thÊp (20mg/ kg) + Với nhóm dùng liều cao (100 mg/kg), hầu hết số huyết học thay đổi khác biệt rõ rệt, điển hình số tiểu cầu, hồng cầu, huyết sắc tố + Các số sinh hoá thay đổi không đáng kể thất thờng nhóm thử nhóm thử Hầu hết thỏ nhóm thử có biểu rụng lông + Quan sát đại thể tổ chức tim, gan, thËn sau thÝ nghiÖm nhËn thÊy: − Cã sù xung hut nhĐ ë thËn trªn mét sè thá ë nhóm Nhng khác biệt nhóm thử nhóm chứng cha rõ ràng + Quan sát vi thể cho thấy: Gan: Không có tổn thơng lô (16 con) tơng tự nhau, gặp tổn thơng thoái hoá thũng đục, thoái hoá hạt mức độ nhẹ: khác biệt lô Thận: (Phân tích 30 con): Thận biểu tổn thơng, lô tơng tự nhau, xung huyết cầu thận mô kẽ lô khác biệt Một lô có viêm cầu thận mÃn tính 1.2.5 Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm: Sản phẩm cyclophosphamide Đề tài tổng hợp đợc đà đợc nghiên cứu bào chế thành thuốc bột pha tiêm 200mg/ lọ nớc cất pha tiêm 10ml/lọ dây chuyền GMP Xí nghiệp Dợc phẩm TWI Kết quả: Sản phẩm thuốc bột cyclophosphamide pha tiêm Đề tài sau bào chế đà đợc kiểm nghiệm lại Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế đạt tiêu chuẩn thuốc thành phẩm đợc quy định Dợc điển Anh (BP 2001), đa vào thử nghiệm lâm sàng bệnh nhân tình nguyện Bệnh viện K Hà Nội 12 ảnh sản phẩm thuốc cyclophosphamide nớc cất pha tiêm Đề tài KC 10 25 1.2.6 Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng thuốc cyclophosphamide pha tiêm: 1.2.6.1 Đề cơng nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng Đợc cho phÐp cđa Bé Y tÕ, BƯnh viƯn K Hµ Néi đà tiến hành thử lâm sàng chế phẩm thuốc bột cyclophosphamide pha tiêm bệnh nhân tình nguyện theo Sơ đồ I Đối tợng phơng pháp nghiên cứu + Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân Chọn bệnh nhân số bệnh nhân vào viện thoả mn tiêu chuẩn sau: Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu (ký cam kết) Tuổi từ 18-70 Có chẩn đoán mô bệnh học: Ulympho ác tính không Hodgkin độ ác tính trung bình Có chẩn đoán Ulympho ác tính không Hodgkin giai đoạn 3-4 tái phát Xét nghiệm chức gan, thận giới hạn bình thờng Bệnh cha xâm lấn tuỷ xơng Không điều trị phác đồ có CPM trớc năm tuần trớc không điều trị hoá chất tia xạ Không khả điều trị phơng pháp khác 13 Sơ đồ I: nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng thuốc cyclophosphamide Chọn bệnh nhân x CPM 250 mg/m2 2/3BN có độc tính độ > 2/3BN có độc tính độ Làm lại lần Chun sang b−íc Dõng nghiªn cøu Chän bệnh nhân x CPM 500mg/m2 2/3BN có độc tính độ > 2/3BN có độc tính độ Làm lại lần Chuyển sang bớc Dừng nghiên cứu Chọn bệnh nhân x CK CPM 750mg/m2/21ng 6/9CK có độc tính độ > 6/9 CK có độc tính độ Làm lại lần Kết luận Dừng nghiên cứu 14 1.2.6.2 Kết nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng Các bệnh nhân tình nguyện đợc thử với ba mức liều dùng là: 250mg/m2 da thể; 500mg/m2 da thể 750mg/m2 da thể làm Nhận xét: + Với liều 250mg/m2 bệnh nhân biểu tác dụng phụ + Víi liỊu 500mg/m2 cã 1/3 CK biĨu hiƯn buồn nôn độ 1; 3/3 CK rụng tóc độ + Với liều 750mg/m2có 6/9 CK buồn nôn độ 1; 1/9 CK nôn độ 1; 9/9 CK rụng tóc độ ã Độc tính thuốc Theo khuyến cáo kinh nghiệm sử dụng Cyclophosphamide nhập ngoại Đức, thờng tập trung vào quan sát ghi nhận tác dụng phụ hay gặp nh : ức chế tuỷ xơng, ảnh hởng tới chức gan thận, buồn nôn, nôn, tiêu chảy đặc biệt gây viêm bàng quang dùng liều cao Để việc đánh giá tác dụng phụ thuốc đợc khách quan , làm tăng tính giá trị nghiên cứu, truyền thuốc Cyclophosphamide cho bệnh nhân không dùng thêm loại thuốc điều trị dự phòng tác dụng phụ nh thuốc chống nôn, thuốc có tác dụng hạ men gan Chỉ tác dụng phụ đợc quan sát ghi nhận bệnh nhân đợc dùng thuốc điều trị triệu chứng đà đợc khuyến cáo nh theo kinh nghiệm sử dụng + Cyclophosphamide nhập ngoại: Trên tất bệnh nhân tiêm truyền không thấy xảy độc tính cấp nh cảm giác khó chịu, sốc, choáng Trong nghiên cứu bệnh nhân có độ tuổi từ 38 đến 71 có số Karnofsky chủ yếu 90% Với mức liều khởi đầu cho nghiên cứu 250mg/m2 da thể : + Các số huyết học sinh hoá nằm giới hạn bình thờng Các tác dụng phụ khác nh buồn nôn, nôn, viêm niêm mạc , rụng tóc , viêm bàng quang hầu nh không xảy Kết nằm dự đoán chọn mức 250mg/m2 làm liều khởi đầu cho nghiên cứu 15 Với mức liều 500mg/m2 da thể : + Các tác dụng phụ huyết học bắt đầu xuất nhng mức độ nhẹ chủ yếu độ , có 1/3 CK hạ BC 1/3 CK hạ BCH độ 1, bệnh nhân + Chỉ số TC Hb thay đổi nhng nằm giới hạn bình thờng Qua theo dõi thấy số trở mức bình thờng sau bệnh nhân đợc nghỉ tuần + Chỉ số chức gan SGOT, SGPT biến đổi mức độ nhẹ, hai số tăng chứng tỏ có tổn thơng huỷ hoại tế bào gan, mức liều có 1/3 CK tăng GOT độ Với mức tăng chống định điều trị hoá chất + Chỉ số chức thận: Ure, Creatinin hầu nh không biến đổi + Các tác dụng phụ khác biểu nhiều mức liều này, buồn nôn gặp 1/3 CK mức độ 1, triệu chứng hết bệnh nhân đợc dùng thuốc chống nôn Rụng tóc gặp 3/3 CK mức độ Nôn, viêm niêm mạc , viêm bàng quang cha thấy xuất + Nh kết nghiên cøu ë møc liỊu 500mg/m2 cho thÊy ë tÊt c¶ số nghiên cứu có độc tính độ Do chuyển sang nghiên cứu tiếp b−íc Víi møc liỊu 750mg/m2 da c¬ thĨ : + Các tác dụng phụ Cyclophosphamide hầu nh xuất với mức độ nặng nhiều + Xuất độc tính thuốc tất bệnh nhân nhiều mức độ nặng nhẹ khác Dòng BC BCH thể nhạy cảm với thuốc nhng xu hớng giảm theo số chu kỳ điều trị + Về số BC, có 2/9 CK hạ BCH độ 1; 1/9 CK hạ BC độ 2; 2/9 CK hạ BC độ 1; 4/9 CK tăng GOT độ 1, TC thay đổi HC Hb biến đổi nằm giới hạn bình thờng + Chỉ số GOT GPT biến đổi nhẹ có 4/9 CK tăng GOT độ 1, bệnh nhân sau dùng thuốc bổ gan tuần số trở bình thờng 16 + Hai số Ure Creatinin giới hạn bình thờng Các triệu chứng khác xuất nặng nhiều Có 6/9 CK buồn nôn độ 1; 1/9 CK nôn độ 1; 9/9 CK rụng tóc độ Viêm bàng quang viêm niêm mạc hầu nh không xảy ã Hiệu điều trị: Mặc dù mục tiêu pha đặt chủ yếu để đánh giá độc tính tìm liều khuyến cáo cho thử nghiệm tiếp theo, tiến hành quan sát nhận thấy thuốc nhiều có hiệu điều trị Cụ thể liều 500mg/m2 da, đà có đáp ứng phần Kết thấy rõ mức liều 750mg chu kỳ sau Kết luận ã Cả bớc thử nghiệm cần tiến hành lần ã Trên bệnh nhân không xảy độc tính cấp truyền thuốc nh ban đỏ, sốc, choáng phản vệ • Tõ liỊu 500 mg/m2 da trë lªn thÊy cã độc tính nhẹ hệ tạo huyết ( giảm bạch cầu độ 1), tăng men gan (độ 1) Các độc tính xuất nhiều liều bớc 2, nhng giới hạn cho phép ã Cả bệnh nhân có đáp ứng phần dùng liều 750mg/m2 da thể ã Chế phẩm Cyclophosphamide Đề tài với liều 750 mg/m2 diện tích da thể liều sử dụng an toàn Kiến nghị Cần tiếp tục làm thử nghiệm lâm sàng pha II để đánh giá hiệu chống ung th thuốc 1.2.7 + Nghiên cứu độ bền cyclophosphamide Cyclophosphamide tơng đối bền điều kiện bình thờng Để bảo quản nguyên liệu cyclophosphamide trớc bào chế cần áp dụng phơng pháp bảo quản thông thờng nh: bảo quản chai, lọ kín, để nơi thoáng mát, không cần phải áp dụng phơng pháp bảo quản đặc biệt 17 + Chế phẩm cyclophosphamide Đề tài dung dịch nớc sau thời gian thử 03 tháng (90 ngày) không bị biến đổi so với mẫu so sánh Cyclophosphamide tơng đối bền dung dịch nớc 1.2.8 Các kết khác ã Về đào tạo: Hai học viên cao học sử dụng chế phẩm Đề tài làm nguyên liệu nghiên cứu cho luận văn tốt nghiệp ã Báo cáo khoa học: 01 báo cáo khoa học "Cyclophosphamide, thuốc điều trị ung th" đà đợc đăng Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Hoá học năm 2005, trang ã Bài báo: 01 báo "Tổng hợp cyclophosphamide" đợc đăng Đặc san ung th học, Quý III năm 2005, trang 298-301 01 báo kết nghiên cứu độc tính cyclophosphamide Đề tài gửi đăng tạp chí Kiểm nghiệm thuốc Kết luận kiến nghị 2.1 Kết luận ã Đề tài đà hoàn thành tốt mục tiêu đà đề ra: ã Đà nghiên cứu đa quy trình khả thi có tính kinh tế để tổng hợp cyclophosphamide Quy trình áp dụng để tổng hợp lợng lớn ã Đà tổng hợp đợc 4250 gam cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn Dợc điển Anh BP 2001 ã Đà nghiên cứu độc tính cấp bán cấp cyclophosphamide tổng hợp đợc ã Đà bào chế cyclophosphamide pha tiêm dây chuyên GMP xí nghiệp Dợc phẩm TW I Thuốc bột pha tiêm bào chế đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm theo BP 2001 18 ã Đà nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I thuốc cyclophosphamide bệnh nhân ung th tình nguyện Kết liều 750mg/ m2 da thể liều sử dụng an toàn có tác dụng ã Thanh toán tài dự toán theo quy định nhà nớc 2.2 kiến nghị ã Đề nghị Bộ Khoa học Công nghệ phê duyệt giai đoạn Đề tài để tổng hợp lợng lớn cyclophosphamide cho việc nghiên cứu tác dụng chữa ung th số bệnh có nguyên nhân tự miễn khác ã Tiến hành nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide dạng viên nén dùng đờng uống để tiện dùng cho vùng nông thôn miền núi Lời cảm ơn Chúng xin chân thành cảm ơn: * Bộ Khoa học Công nghệ * Ban chủ nhiệm chơng trình KC10 * Ban lÃnh đạo Viện KH CNVN * Ban lÃnh đạo Viện Hoá học * Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế Hà Nội, ngày Cơ quan chủ trì đề tài KC 10 25 Viện Hoá học / / 2006 Chủ nhiệm đề tài GS.TSKH Trần Văn Sung 19 Tài liƯu tham kh¶o N Brock, Cancer Res 49, (1989) D L Hill, A Review of Cyclophosphamide, Charles C Thomas, Springfield III (1975) H Arnold, F Bourseaux, Angew Chem 70, 539 (1958) W Hirsch, Brit Patent 1235022 (1969); C.A 75, 88653 x (1969) I Neda, R Sonnenburg, R Schmutzler, U Niemeyer, B Kutscher, J Engel, A Kleemann, A new Methode for the Preparation of Ifosfamide and Cyclophosphamide, Z Naturforschung 52b, 943-946 (1997) Charlotte le Roux, Agnes M Modro, Tomasz A Modro, Decomposition of Nphosphorylated Nitrogen Mustards: A Mechanistic Investigation, J Org Chem , 60, 3832-3839, (1995) R F Borch, G W Canute, Synthesis and Antitumor Properties of Activated Cyclophosphamide Analogues, J Med Chem., 34, 3044-3052 (1991) R E Borch, R R Valente, Synthesis, Activation and Cytotoxicity of Aldophosphamide Analogues, J Med Chem., 34, 3052-3058 (1991) M H Famy, Y Moride, Animal Breed Abstr., 52, 7-19 (1984) 10 N Baln et al., Modified Guanies Representing O-(6)-alkylation by the Cyclophosphamide Metabolites Acrolein and Chloroacetaldehyde: Synthesis, Stability and ab Mitio Studies, Chem Res.- Toxicol., 15 (3), 380-387 (2002) 11 I Shalit et al., Immunomodulatory and Protective Effects of Moxifloxacin Against Candida albicans-induced Bronchopneumonia in Mice Injected with Cyclophosphamide, Antimicrob Agents-Chemother 46 (8), 2442 (2002) 12 M R Gomes-Carneiro et al., Inhibition of Cyclophosphamide-induced Teratogenesis by Betaine, Toxicol Letters 138 (3), 205 (2003) 13 NguyÔn Hoán, Ngô Văn Thông, Nguyễn Hữu Định Cơ chế tác dụng sinh lý hợp chất phốt thể Tập san hoá học, (1965) 12-26 14 Nguyễn Hoán, Ngô Văn Thông, Nguyễn Hữu Định, Liễu Đình Đồng Tổng hợp số hợp chất phốt có hoạt tính sinh lý, Thông báo khoa học, Hoá học, 2, 3-17 (1966) Nhà xuất giáo dục, Hà Nội 1966 20 15 Nguyễn Hữu Định Đóng góp vào lĩnh vực tổng hợp hợp chất phốt Thông báo Khoa học, Hoá học, (1975) 93-101 Trờng Đại học Tổng hợp Hà Nội 1975 16 a) Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Chấn Hùng Xây dựng chơng trình qc gia phßng chèng ung th− ë ViƯt Nam giai đoạn 2001- 2005 Viện thông tin th viện Y học Trung ơng, trang 1-7; Hà Nội 8/2000 b) WHO - Western Pacific Region Manual on the Prevention and Control of Common Cancers, 1998 c) Nguyễn Bá Đức Hoá chất điều trị bệnh ung th NXB Y học, Hà Nội 2003 17 Tõ ®iĨn VIDAL ViƯt Nam 2000( tr 250-252) 18 R H Iwamatoet al J Org Chem 26, (1961), 4743 - 4745 19 Niemeyer et al DE 19739 159 C1 (6 97.) USP 6, 187, 941 (Feb 13, 2001) 20 Friedman and Seligman, J Am Chem Soc 76, (1954), 655 - 661 21 Herbert Arnold, Friedrich Bourseaux, Norbert Brock, Nature 29, (1958), 931 22 H Arnold et al DE 1057 119 ( 10 Feb 1956) 23 Sato et al USP 4, 238, 423 (Dec 1980) 24 Sato et al USP 4, 239, 709 (Dec 16 1980) 21