KHỐI PHỔ LC MS mass spectrometry LC MS

Máy MS chuyển các Phân tử thành các ion ở thể khí và tách chúng theo tỷ số m/z và ghi lại cường độ từng ion, cho một phổ khối.. Các thành phần một máy MSDetector ion Ch ân không cao X ử

KHỐI PHỔ & LC-MS

Mass Spectrometry & LC-MS

Phạm gia Huệ

Hà nội 07-08-2009

 Công cụ PT hay dùng nhất hiện nay.

 Kỹ thuật cung cấp thông tin về:

1 Khối lượng và công thức phân tử 1 hợp chất

2 MS cùng với NMR và IR cho phép nghiên cứu cấu trúc phân tử

3 Thành phần định tính và định lượng của một hỗn hợp

4 Máy MS chuyển các Phân tử thành các ion ở thể khí và tách chúng theo tỷ số m/z và ghi lại cường độ từng ion, cho một phổ khối

5 PT được mẫu rất nhỏ, dạng rắn, lỏng, khí của các chất PTL nhỏ cỡ (một số Da) tới các protein (cỡ trên 300 000 Da) (Dalton (Da) = amu)

Khối phổ (MS) là gì?

Khối phổ (MS) là gì?

Nguyên lý cơ bản là

• sự tạo thành các ion ,

• và được phát hiện

Các thành phần một máy MS

Detector ion

Ch ân không cao

X ử lý và lưu dữ

liệu

Tr ánh ion PT va chạm với các phân tử trong không khí

1 Nguồn ion hoá

 Biến đổi chất PT, tạo thành các ion phân tử

(molecule) và các ion mảnh (fragment)

 Hai kỹ thuật chính hay dùng:

• Bắn phá electron ( Electron Impact - EI ) :

tạo ion dùng chùm electron năng lượng cao: phương pháp “cứng”

• Ion hoá hoá học ( chemical ionization -CI ) tạo ion thông qua phản ứng với các ion thuốc thử: phương pháp “mềm”

• Ví dụ: Electron bắn phá methanol:

tạo cation gốc methanol, một ion phân tử :

CH3OH + 1 e-  CH3OH+. + 2

e-• Chỉ một số (~0.01%) phân tử chất PT (M) được ion hoá

• Phần lớn các ion phân tử bị phá thành các mảnh nhỏ hơn (cation, gốc, phân tử trung hoà nhỏ

hơn)

1.1 Bắn phá electron (EI)

+ +

Sợi đốt

Khu vực Gia tốc ion

PT khối

Chùm electron

1.1 Bắn phá electron (EI)

Chỉ các mảnh tích điện được phát hiện

+

+

Mảnh cation

Mảnh cation

Mảnh gốc

Gốc

Các LK dễ gãy là các LK yếu nhất, tạo các mảnh bền

Phổ MS của

pentobarbita l,

bắn phá bằng electron

• Ion phân tử M+., có m/z 226, mất gần hết.

• Tạo thành các mảnh m/z 197, 156, 141, 112, 98, 69, and 55,

• Các pic này là dấu vết các mảnh trong cấu trúc của phân tử M

• Pic lớn nhất trên phổ MS là pic cơ bả n (coi như có cường độ 100%) Cường độ pic khác tính theo

% của pic cơ bản

Pic cơ bản

Molecular ion peak MPic ion phân tử +.

Khối lượng phân tử =226

1.2 Ion hoá học (CI) – PHƯƠNG PHÁP mềm

• Tạo ít mảnh.

• Dùng thừa thuốc thử dạng khí như CH4.

• Chùm electrons (100–200 eV) chuyển CH4 thành các SP như CH5+

CH 5 + là chất cho proton mạnh, phản ứng hoá học với chất phân tích tạo ra phân tử proton hoá MH + , có nhiều trên phổ

MS ion hoá hoá học dùng methan

3 5

4 4

4

CH CH

CH CH

e CH

e CH

.

Pic của ion phân tử MH+ ở m/z 227 (M+1) là pic lớn thứ nhì

Ít các pic của mảnh so với phổ EI

pentobarbital

Ion hoá Hoá học

2 Bộ Phân tích Khối

• Trái tim của máy khối phổ , có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt

• Phân loại:

Bộ phân tích từ,

Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)

Bộ phân tích bãy ion tứ cực (Ion trap)

Bộ phân tích thời gian bay (TOF)

•Sau đây là bộ phân tích từ

mV 2

Ion Beam

Detector Magnetic Field

2.2 Bộ phân tích tứ cực

(Quadrupole)

• Một số ion có tỷ số m/z xác

định cộng hưởng với thế xoay

chiều xác định có thể đi thẳng qua

khoảng không đến detector Trong

2.2 Bộ phân tích tứ cực

Bẫy ion (Quadrupole Ion trap)

• Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tíchkhối tứ cực; chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ

và đưa dần ra khỏi bẫy

• Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, cácion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không

để đến detector

2.3 Bộ phân tích tứ cực Chập Ba (Triple Quadrupole)

Ba bộ tứ cực nối tiếp nhau :

Ở Q1 : Ở các ion được tách

Ở Q2 : Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như nitơ, argon, heli Bộ Q2 tạo ra phân ly do va chạm chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions)

Ở Q3 : làm nhiệm vụ tách các ion con

Độ phân giải của máy khối phổ

• Đó là khả năng của máy có thể phân biệt được 2 pic cókhối lượng gần nhau m1 và m2 Độ phân giải R là:

R = m 2 / (m 2 - m 1)

• Hai pic cạnh nhau đươc coi là đã tách riêng khi phần chồng lấp giữa hai pic đó nhỏ hơn 10% pic nhỏ.

• Bộ phân tích từ hội tụ đơn có trị số R khoảng 5000

• Cần có máy với độ phân giải cao hơn để phân biệt cácion có khối lượng gần nhau

• Ví dụ: để phân biệt 2 ion có m1= 280,2881 và m2= 280,2768

máy MS cần có R= 25 000

2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight )

2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight )

Xác định tạp

3 Detector

Nhân electron (electron multiplier):

Tác động của một ion lên bề mặt các dynode khác để tạo ra các electron ngày càng nhiều electron

1  10 6 (hình bên)

Nhân quang (photomultiplier):

Các electron tạo ra theo cách trên va chạm với một bề mặt phát quang

để tạo ra photon Các photon này được thu nhận và số lượng của

chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu

WS 2005

Máy MS tứ cực chập 3 (Trip Quad)

TSQ (Thermo)

Waters Micromass Q-Tof Premier

1

2

3

4

Waters Micromass Q-Tof Premier

1 Phun: Z-spray sạch hơn

2 T-Wave = ion optics = ion guide: tạo thành hình ống hướng ion vào giữa, ít mất mát ion trên đường đi

3 T-Wave thứ hai: cho MS2

4 TOF: Lựa chọn V mode/ W mode

Tách bằng GC Xác định bằng MS

Có thư viện phổ chuẩn

Mass spectrometer acts as a detector for GC

Interface

• Tách bằng LC Xác định bằng MS

• Khó kh ăn : loại ảnh hưởng của dung môi và các

thành phần trong pha động; không có thư viện phổ

• Để ghép nối giữa LC và MS:

• giao di ện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI

(atmospheric pressure chemical ionisation)

• giao di ện phun điện ESI (electrospray)

ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI

động tạo thành một sol khí hay khí dung (aerosol) củakhí nitơ và các giọt nhỏ dung môi

chất được ion hoá nhờ các phản ứng ion-phân tử ở ápsuất khí quyển, các electron và các ion sơ cấp được tạo

ra do phóng điện

APCI: Atmospheric Chemical Ionization

giao diện phun điện ES

Các giọt dung dịch thu nhỏ và tăng điện tích.

Các phân tử dung môi không tích điện bị loại

Ion hóa bằng phun điện ESI (Electrospray Ionization)

• Tách bằng LC Xác định bằng MS

• Khó kh ăn : loại ảnh hưởng của dung môi và các

thành phần trong pha động; không có thư viện phổ

• Để ghép nối giữa LC và MS:

• giao di ện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI

(atmospheric pressure chemical ionisation)

• giao di ện phun điện ES (electrospray)

Ví dụ Ứng dụng LC-MS

• LC: pha động ACN-amoni ethanoat, C18

• giao diện phun điện

tạp ra trước và sau đó

•

thuộc ion (M+H)+ xuất hiện ở m/z = 225 và 227 theo tỷ

lệ 3:1 cho thấy sự có mặt của nguyên tử clo Chất tạp làquinazolin có 3 nhóm thế

Ví dụ Ứng dụng LC-MS

Sắc đồ TIC

MS pic phút 8,35

Trình bày dữ liệu

• Dạng TIC (Total Ion Chromatogram)

• Dạng SIM (Single Ion Monitoring)

Trình bày dữ liệu

• Dạng TIC (Total Ion Chromatogram)

• Dạng SIM (Single Ion Monitoring)

• Dạng MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Tất cả