cố định enzyme bằng chất màng alginate

cố định enzyme bằng chất màng alginate tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả cá...

Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate

1)Khái niệm về cố định enzyme

 Enzyme cố định (immobilized) hay enzyme không hòa tan (insoluble enzyme) được Micheal Trevan định nghĩa là những phân tử enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ,pha này được tách riêng vớ pha dung dịch tự do nhưng

ở đó enzyme vẫn có khả năng xúc tác với những phân tử

cơ chất Pha enzyme không hòa tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

 Còn theo Klaus Mosbach thì định nghĩa về enzyme cố định theo nghĩa mở rộng và thực tế hơn Enzyme không hòa tan bao gồm các enzyme đã được cố định vào một chất mang và cả những enzyme có trong tế bào sống được

cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép tái sử dụng nhiếu lần

2)Lịch sử phát triển và tình hình nghiên cứu enzyme cố định trong và ngoài nước

 Enzyme cố định được nghiên cứu đấu tiên vào năm 1916 bởi Nelson và Griffin khi hai ông này quan sát khả năng thủy phân đường sacchaose của enzyme invertase từ nấm men háp phụ lên than hoạt tính

 1949,Michel và Iuers đã sử dụng phương pháp azid hóa các cacbonxylmethyl cellulose để cố định những chuỗi proein có hoạt tính

 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định enzyme carboxyl peptidase,diatase, pepsin và ribonuclease trên polyminostyene bằng liên kết đồng hóa trị (covalent binding)

 1956,Mizt cố định enzyme catalase trên DEAE-cellulose bằng liên kết ion(ionic binding)

 1964, Quiciio và Richards đã mô tả phương pháp khâu mạch (cross-linking) các enzyme carboxyl-peptidase với glutaralhyde Chang đã tiến hành tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase(microcapsule)

 1969,Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định.Chibata là người đầu tiên thực hiện thành công việc sản xuất vào công nghiệp

 1973,Chibata và cộng sự lần đầu tiên cố đinh thành công tế bào vi sinh và từ(E.coli) để sản xuất L-aspartate từ amonium fumarate bằng gel acrylamide

 Trên thế giới hiện nay đã sử dụng rộng rãi công nghê cố định enzyme vào trong các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm,y học,công nghiệp hóa chất,bảo vê môi trường và các lĩnh vực phân tích

 Ở Việt Nam,nghiên cứu cố định enzyme mới chỉ bắt đầu vài năm gần đây và thu được kết quả còn rất hạn chế.1994-1995,Viện Sinh học Nhiệt đới đã cộng tác với Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh nghiên cứu cố định enzyme glucoisomerase trên các hạt cylochrom B,hoạt hoá bằng glutaraldehyde Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định các enzyme thủy phân như: protease,amylase,urease,pectinase…Hiên nay Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng đang nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme glucoisomerase (Novo,Đan Mạch) để sản xuất fructose syrup,tuy nhiên mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm

 Những năm gần đây,phòng thí nghiệm công nghệ bức xạ,Viện Hạt Nhân Đà Lạt

đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định enzyme và tế bào ,các chất có hoạt tính sinh học khác bằng kỹ thuật bức xạ như: cố định enzyme glucoamylase,protease,vi khuẩn tả(Vibrio,Cholerae), tế bào nấm men, vi khuẩn

xử lý nước thải (Pseudomonas maltophilla) và hormon ptrogesteron trên các giá thể polymer tổng hơp được chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ

3) Đặc điểm của enzyme cố định

Enzyme cố định có những đặc điểm khác với enzyme hòa tan như:

• Enzyme cố định bền nhiệt hơn enzyme hòa tan do chúng được bảo vệ bởi chất mang

• Có khả năng bảo quản tốt hơn

• Có sự di chuyển pH tối thích sang kiềm hay acid so với enzyme hoà tan

• Có khả năng tái sử dụng nhiều lần

• Enzyme cố định tuân theo định luật Michaelis-menten,tuy nhiên cũng có sự sai khác như:

o Xảy ra hiện tượng cạnh tranh giữa cơ chất,enzyme và chất mang

o Hiện tượng cản trở sự khuếch tán cơ chất và sản phẩm của phản ứng dẫn đến vận tốc phản ứng giảm

• Hoạt tính của enzyme cố định thường thấp hơn enzyme hòa tan cùng loại do 2 nguyên nhân sau:

o Do ảnh hưởng điện tích của chất man nên làm thay đổi cấu trúc không gian của enzyme

o Do enzyme bị nhốt vào trong gel nên sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất với tâm hoạt động khó khăn

4)Ưu nhược điểm của enzyme cố định

Enzyme cố định ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do những

ưu điểm sau:

• Hiệu quả kinh tế cao ,do enzyme cố định là chế phẩm sinh học rất đắt tiền nếu

sử dụng dạng hòa tan thì chỉ sử dụng được 1 lần,khó thu hồi.Khi enzyme cố định trên giá thể thì sử dụng được nhiều lần,giá thành giảm,sử dụng được nhiều lần,giá thành giảm,nâng cao hiệu quả kinh tế,

• Sản phẩm thu được sau phản ứng được xúc tác bằng enzyme cố định khá tinh sạch do enzyme được cố định trên những pha riêng rẽ nên không lẫn vào sản phẩm Điều này đặc biệt có quan trọng trong sản xuất dược phẩm,trong công nghệ sản xuất hóa chất tinh khiết và trong phân tích

Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate

• Khi thực hiện bằng phản ứng enzyme cố định có thể dừng phản ứng ở bất kỳ giai đoạn nào cần thiết,chỉ cần tác enzyme cố định ra khỏi cơ chất.Đối với những trường hợp yêu cầu sản phẩm chỉ là các sản phẩm trung gian thì điều này

có ý nghĩa quan trọng

• Có thời gian bảo quản lâu hơn và bền vững hơn đối với các chất kìm hãm cũng như các tác nhân gây biến tính so với dạng hòa tan

• Vì được cố định trên giá thể nên enzyme có hoạt tính ổn định hơn so với enzyme tự do khi có sụ tác động cửa các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH…

• Enzyme cố định đặc biệt thích hợp với các quy trình công nghê liên tục,tự động hóa Enzyme cố định được nạp vào các thiết bị phản ứng như cột,tháp với dòng

cơ chất đi vào liên tục và đầu ra là sản phẩm

Tuy nhiên bên cạnh những ưu điểm thì enzyme cố định cũng có những nhược điểm sau:

• Làm hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất.Vì vây hoạt tính riêng(specfic activity) của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme hòa tan Đặc biệt trong trường hợp cơ chất có trọng lượng phân tử lớn như: protein,tinh bột,chitosan…

• Trường hợp enzyme cố định bằng phương pháp nhốt (entrapment method) trong khuôn gel thì chỉ phần enzyme nằm ở lớp ngoài của gel là hoạt động

Enzyme được cố định bằng phương pháp cộng hóa trị thì một lượng đáng kể enzyme bị mất hoạt tính do chất hoạt hoá và do phản ứng gắn không đặc hiệu xảy ra

ở trung tâm hoạt động của enzyme

5)Vật liệu cố định enzyme

Theo Trevan một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau:

• Giá thành rẻ là yêu cầu đầu tiên của một chất mang được sử dụng trong cố định bbenzyme

• Phải có tính chất cơ lý bền vững,ổn định,thì mới chịu đựng được các điều kiện của môi trường như khuấy trộn,áp lực trong các quy trình sản xuất

• Về mặt hóa học,chất mang phải bền vững,không tan trong môi trường phản ứng,chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme và không gây ra những hấp phụ không đặc hiệu

• Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao ,bền vững với sự tấn công của vi sinh vật

• Chất mang phải có độ trương nở tốt,diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất này của chất mang vứa tăng khả năng cố định enzyme,vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với ezyme,nhớ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố định và số lần tái

sử dụng

• Chất mang cò thể có cấu trúc lỗ xốp ,siêu lỗ,có thể ở dang hạt,dang màng,dạng phiến mỏng…

∗ Chất mang polymer hữu cơ: tự nhiên và tổng hợp

Tinh bột:phong phú,rẻ nhưng kém trương nở,khả năng cố định kém nên thường được ghép với các copolymer làm tăng độ trương nở,cải thiện tính chất cơ lý,tăng khả năng cố định vi sinh vật

Chitin,chitosan: có cấu trúc siêu lỗ,dễ tạo màng,tạo hạt,bền cơ lý,ổn dịnh Tuy nhiên kỵ nước,độ trương nở kém nên cải thiện ghép copolymer với các vinyl monomer

ưa nước

-Protein:thường sử dụng gelatin,keratin,albumin Dễ tạo màng,tạo hạt Tuy nhiên kém bền,dễ nhiễm khuẩn hay gây các phản ứng miễn dịch

b) Nhóm các polymer tổng hợp( synthetic polymer):

polyacrylamide,polyester,polyvinylalcohol,polyvinylacetate,polyacrylic,polystyren,polyet hylen ghép với các vinylmonomer

Bền cơ lý,bền nhiệt,bền vi sinh vật, trơ hóa học,độ trương nở tốt,có thể điều chỉnh kích thuớ siêu lỗ Tuy nhiên giá thành cao,quá bền vững nên gây ô nhiễm môi trường khi khó phân hủy

∗ Chất mang vô cơ:

Gồm sợi bông thủy tinh,silicium oxide SiO2 ,Alluminium oxide Al2O3 ,MgO có cấu trúc lỗ,có khả năng hấp phụ tốt Nhưng tan trong kie62mpH>7,5 ta khắc phục bằng cách phủ lớp ziconia bền vững với kiềm

Ngoài ra còn có ceramic,celite(diatomic)

Alginate

a)Nguồn gốc của alginate

Alginate là thuật ngữ dùng cho các muối

acid alginic Alginate đôi khi còn được gọi

bằng thuậ ngữ “algin”

Alginate là một polymer sinh học có

nguồn gốc từ tảo biển,có nhiều trong vách tế

bào tảo nâu(Paccophyceae) dưới dạng muối

canxi,magie,natri của acid alginic Alginate

có nguồn gốc từ biển nên nó rất linh động và

bền Tuy nhiên,dạng muối canxi và magie

alginate không tan trong nước ,phải qua quá

trình tách chiết Alginate để thu Alginate

dạng bột khô,tan trong nước và loại bỏ

những thành phần khác của tảo biển qua quá

trình kết tủa

b)Cấu tạo của Alginate

Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate

Công thức của acid Alginic là(C6H8O6)n từ đó công thức của natri alginate là (C6H7NaO6 )

n,

canxi Alginate(C6H7Ca1/2 O6 )n.

 Alginate là một polymer được cấu tạo từ 2 monomer là: acid β-D-Mannuronic(M)

và acid α-L_Gluconic (G),với các cầu nối là liên kết 1-4 glucoside,chỉ khác ở nhóm carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza Chúng tham gia vào cấu trúc thành và màng tế bào,chúng thường tồn tại ờ dạng ;G-G-G-G…;M-M-M-M…;M-G-M-G… Sự phân bố của thành phần M,G biến đổi nhiều theo loài, do đó

có nhiều loại Alginate và có tính chất khác nhau

c)Tính chất của Alginate

Việc sử dụng Alginate dựa trên 3 tính chất chính;

• Khi tan trong nước Alginate tạo dung dịch nhớt Các muối alginate (Na, K, Mg) đều hòa tan trong nước, tạo cho dung dịch có độ nhớt cao Độ nhớt alginate của rong thay đổi nhiều tùy thuộc vào loài, vào giai đoạn sinh trưởng của rong và kỹ thuật tách chiết alginate Độ nhớt tăng khi mức độ polymer hóa tăng, nồng độ alginate tăng và nhiệt độ giảm Bên cạnh đó, độ nhớt của alginate lại phụ thuộc rất lớn vào phương pháp tách chiết Để tăng độ nhớt, trong quá trình tách chiết alginate, ta có thể bổ sung một số phụ gia cần thiết

để thu được sản phẩm có độ nhớt mong muốn

Ngoài ra, độ nhớt alginate phụ thuộc vào quá trình bảo quản Khi ở dạng bột thành phẩm, alginate vẫn tiếp tục bị cắt mạch, sau một thời gian, độ nhớt của

nó giảm đáng kể Để khắc phục điều này, ta có thể cho vào alginate thành phẩm một lượng nhỏ canxi sao cho chưa đến ngưỡng tạo gel Khi sử dụng kết hợp alginate với các dạng gum khác như pectin sẽ làm tăng đáng kể độ nhớt của dung dịch

• Ở điều kiện bình thường, các gốc COO- của các phân tử guluronic sẽ hình thành liên kết hydro với ion H3O+ có trong dung dịch Khi ta đưa vào môi trường các ion kim loại như Ca2+ , Ba2+ , các cation này sẽ thay vào vị trí của

H3O+, nối các chuỗi guluronic lại với nhau, tạo thành một cấu trúc mạng lưới không tan trong nước, cấu trúc này được gọi là gel

Quá trình tạo gel của alginate được tiến hành ở các điều kiện bình thường về nhiệt

độ và áp suất Cấu trúc gel tạo thành bền ở nhiệt độ trong khoảng 0 – 1000C Vì thế, sự gia nhiệt hầu như ít làm hư cấu trúc gel Tuy vậy, gel có thể dễ dàng

Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate

hòa tan trở lại khi nhúng vào dung dịch chứa hàm lượng Na+, K+ hay Mg+ cao

Do vậy, nên duy trì tỉ lệ Na+/Ca2+ <= 25:1 để giúp cấu trúc gel được ổn định Khả năng tạo gel của alginate với các cation là không giống nhau, độ bền gel tăng dần theo thứ tự Ca2+ < Sr2+ < Ba2+ Trong đó, Ca2+ là tác nhân tạo gel được

sử dụng nhiều nhất do tính phổ biến và không độc hại của nó

• Alginate tạo dạng màng mỏng (films) của natri hoặc canxi Alginate với dạng sợi fibres) củz canxi Alginate Tính chất này của alginate được ứng dụng trong việc tạo nên các lớp phủ bên ngoài

d) Sản xuất Alginate

Trước khi đem trích ly để thu alginate, nguyên liệu sẽ được rửa bằng acid để loại

bỏ các chất khô hòa tan.Sau đó rửa qua nước để làm sạch.Tiếp đó mang đi nghiền.Trích ly alginate được thực hiện bằng cách ngâm nguyên liệu trong dung dịch kiềm (NaOH) Dung dịch sau trích ly sẽ mang đi lọc để loại bỏ các cặn không hòa tan

Sau đó, dịch lọc sẽ được mang đi tạo tủa với CaCl2 thu Calci Alginate Calci Alginate được xử lý acid để loại bỏ ion Ca2+.Tiếp đến, để thu được sản phẩm là muối alginate của cation nào, ta sẽ cho acid alginic tác dụng với muối cacbonat của cation đó Trong các sản phẩm tạo thành, chiếm số lượng lớn nhất là natri alginate, còn lại là một số muối alginate của kali, canxi Ở công đoạn này, cần kiểm soát thông số pH, hàm lượng axit alginic, muối cacbonate còn sót trong sản phẩm cuối cùng

Cuối cùng, alginate sẽ được mang đi sấy khô.Quá trình này sẽ quyết định hàm lượng chất khô sau cùng của sản phẩm cũng như cỡ hạt tạo thành

Tìm hiểu phương pháp cố định Enzyme bằng chất mang Alginate

RONG

MƠ

RỬA NƯỚC

VÀ ACID NGHIỀN

TRÍCH LY BẰNG

BASE

LỌC

DỊCH LỌC

KẾT TỦA VỚI CACL

2

AGINATE CALCI

XỬ LÝ ACID

XỬ LÝ

NA 2 CO 3

SẤY KHÔ

AGINATE NATRI

NGHIỀN THU TỦA

e) Ứng dụng của Alginate

*Trong công nghiệp thực phẩm:

- Alginate được dụng trong nước sốt,siro, kem

- Alginate gíup lớp đường phủ trên bề mặt bánh ngọt không thay đổi hình dạng, do đó việc nướng bánh dễ dàng hơn

- Những dịch nhũ tương có chứa nước và dầu như nước sốt, nước gia vị trong salad ít

bị phân lớp nếu có thêm propylene glycol alginate ( PGA ) vì chất này bền trong môi trường acid yếu Alginate giúp cải thiện độ đặc, tăng độ mịn của sữa chua còn PGA dung để làm bền cho protein sữa trong điều kiện acid

- Một lượng nhỏ PGA cho bọt bia bền vững lâu tan

*Trong dược và y học:

- Nếu một tia dung dịch natri alginate đưa vào một bồn chứa dung dịch CaCl2, canxi alginate được tạo thành dạng sợi Sợi polymer được kéo dài rất bền Các sợi này được

sử lý tạo thành vải không dính dung băng bó vết thương Chúng được hấp thụ bởi dịch cơ thể do canxi trong vải sợi được thay cho natri từ dịch cơ thể tạo ra natri alginate tan, do đó chúng có đặc tính hàn vết thương rất tốt

- Bột acid alginic nở ra khi ở trong nước nên được dung trong thực phẩm ăn kiên như bánh quy Ngoài ra alginate còn được dung để điều khiển sự phóng thích của thuốc và những chất hóa học khác

6)Các phương pháp cố định enzyme

a)Phương pháp hấp phụ

 Sử dụng chất mang có tính hấp

phụ cao như than hoạt tính hay

silicagel,oxit nhôm,gốm sứ…

các phân tử enzyme hấp phụ

lên bề mặt của chất hấp phụ

nhưng do lực hấp phụ nhưng

do lực hấp phụ yếu nên

enzyme dễ bị rơi khỏi chất

mang Có thể cải thiện :dùng

các chất mang có các nhóm

tích điện và enzyme dược gắn

với chất nang nhờ lực ion

nhưng có nhược điểm là

enzyme dễ bị rửa giải nếu nồng

độ muối trong dung dịch cao

b)Phương pháp tạo khuôn gel:

 Sử dụng cac polymer có khả

năng tạo gel (như

polyacrylamide,alginate,caranan…) và dồng hóa (trùng hợp) chúng với enzyme tạo khuôn gel nhốt các enzyme bên trong.Sau khi nhốt các enzyme ,tạo thành