Cố định tế bào Bacillus Subtilis Natto bằng phức chất mang Alginate Chitosan để lên men Nattokinase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HỒ THỊ HIỀN CỐ ĐỊNH TẾ BÀO BACILLUS SUBTIUS NATTO BẰNG PHỨC CHẤT MANG ALGINATE-CHITOSAN ĐỂ LÊN MEN NATTOKINASE LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HÒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60420201 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO BACILLUS SUBT1L1S NATTO BẰNG PHỨC CHẤT MANG ALGINATE- CHITOSAN ĐÊ LÊN MEN NATTOKINASE Cán hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Học viên thực hiện: Hồ Thị Hiền - MSHV: 13310298 TP HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Hồ Thị Hiền MSHV: 13310298 Ngày, tháng, năm sinh: 13/05/1987 Nơi sinh: Tỉnh Hà Tĩnh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: “Cố định tể bào Bacillus subtilis natto phức chất mang alginate - chitosan để lên men nattokinase ” NHỆM VỤ VÀ NỘI DƯNG: - Tối ưu hóa trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto phức chất mang alginate - chitosan - Khảo sát trình lên men nattokinase tế bào cố định - Khảo sát số lần tái sử dụng tế bào cố định II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 17/08/2015 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/03/2016 IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯONG Tp HCM, ngày tháng năm 2015 CÁN BỘ HƯỚNG DÃN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỎNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM Cán bướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Hữu Phúc (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: TS Phan Ngọc Hòa (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 22 tháng 07 năm 2016 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghỉ rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng TS Phan Ngọc Hòa TS Nguyễn Hữu Phúc PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên TS Hoàng Anh Hoàng Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khỉ luận văn sửa chữa (nếu cố) CHỪ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương - người Thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Tôi học nhiều điều quý báu kiến thức, nhiệt huyết, tình u thương tinh thần trách nhiệm Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Bách Khoa tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Xin cảm ơn bạn bạn học viên cao học ngành Cơng nghệ Sinh học khóa 2013 bạn sinh viên giúp đỡ động viên q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình thân u ln khích lệ ủng hộ tơi mặt vật chất lẫn tinh thần để tơi hồn thành chương trình cao học Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện thời gian để tơi hồn thành luận văn TĨM TẮT Nattokinase enzyme thủy phân huyết khối mạnh, có tiềm việc điều trị bệnh tim mạch Trong nghiên cứu này, sử dụng kết hợp phức chất mang alginate - chitosan để cố định tế bào Bacillus subtilis natto nhằm mục đích lên men nattokinase Sáu thông số ảnh hưởng đến hiệu suất cố định tế bào sàng lọc ma trận Plackett-Burman bao gồm: nồng độ alginate, nồng độ chitosan, pH chitosan, nồng độ CaCh, mật độ giống bổ sung, thời gian lắc bổ sung chitosan Kết trình tối ưu xác định hai yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định tế bào nồng độ alginate (2,5%), mật độ giống bổ sung (khoảng 5,86 triệu tế bào/ml) Với hai yếu tố tối ưu, yếu tố khác giữ mức giá trị trung tâm hiệu suất cố định tế bào đạt 90,73% Từ kết tối ưu thơng số q trình cố định, tiến hành ứng dụng tế bào cố định vào lên men nattokinase Sau 24 lên men, hoạt độ enzyme nattokinase đạt 71,80 ± 0,19 FƯ/ml Tế bào Bacillus subtilis natto cố định tái sử dụng lần lần tái sử dụng thứ ố hoạt tính enzyme nattokinase thu giảm 2,7% so với lần tái sử dụng thứ ABSTRACT Nattokinase is a potent fibrinolytic enzyme with the potential for fighting cardivascular disease In this study, Bacillus subtilis natto were immobilized in the alginate - chitosan complex for fermentation of nattokinase enzyme Six factors affecting the efficiency of immobilization cells were screened by Plackett - Burman design including: concenttation of alginate, concenttation of chitosan, pH of chitosan, concenttation of CaCh, added cells density, shaking time after supplementing chitosan Results of optimization have identified two factors affecting the efficiency of cell immobilization They are concenttation of alginate (2.5%) and added cells density (approximately 5.86 million colonies per milliliter) With these two factors optimized and others kept at the normal level, immobilization efficiency reached 90.73% After Bacillus subtilis natto had been immobilized by optimization of parameters, we conducted application for fermenting nattokinase For 24 hours of fermentation, nattokinase enzyme activity reached 71.80 ± 0.19 FU/ml Immobilized Bacillus subtilis natto cells were reused times and on the 6th time of reuse, nattokinase enzyme activity only decreased 2.7% in compared with the 1st reuse LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Hồ Thị Hiền DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Nutrion agar (Môi trường dinh dưỡng agar): NA Nutrion broth (Môi trường dinh dưỡng lỏng): NB Response surface methodology (Phương pháp đáp ứng bề mặt): RSM Central Composite Designs (Thiết kế cấu trúc có tâm): cc Fibrinolytic unit (Đơn vị thủy phân fibrinolytic): FU Colony-forming units per milliliter (Số đơn vị khuẩn lạc ml mẫu): CFU/ml Standard Deviation (Độ lệch chuẩn): SD Elementary mode analysis (Phương thức phân tích bản): EM A Statistical Analysis Systems (Hệ thống phân tích thống kê): SA DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis natto Hình 1.2: cấu trúc bậc nattokinase .7 Hình 1.3: cấu trúc hóa học nattokinase Hình 1.4: Các hiệu ứng sinh lý nattokinase lên fibrin Hình 1.5: cấu tạo alginate 13 Hình 1.6: Quá trình tạo tế bào cố định gel alginate calcium phương pháp bẫy nhốt 14 Hình 1.7: Sự hình thành gel alginate Ca2+ 14 Hình 1.8: Cơng thức hóa học chitosan, với n khoảng 700 - 4500 16 Hình 1.9: Liên kết alginate chitosan 17 Hình 1.10: Hạt gel alginate - chitosan kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.11: Minh họa trình cố định tế bào phức chất mang alginate - chitosan 18 Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc chủng giống 41 Hình 3.2: Hình thái chủng giống 42 41 Pha lag từ đến giờ: giai đoạn vị khuẩn bắt đầu thích nghi với mơi trường sinh khối bắt đầu tăng nhẹ từ 6,919 log CFU/ml lên 6,939 log CFƯ/ml Pha diễn ngắn tế bào chủng giống pha sinh trưởng logarit tăng sinh điều kiện nên dễ thích nghi với môi trường lên men Pha log từ - 24 vi khuẩn sinh trưởng phát triển nhanh thể đường biểu diễn (đồ thị 3.1) Quá trình trao đổi chất diễn mạng mẽ dẫn đến sinh khối tế bào tăng nhanh đạt cực đại 7,461 log CFƯ/ml thời điểm 24 lên men Từ 24 đến 28 giờ, chủng Bacillus subtilis natto bước vào pha cân bằng, đường biểu diễn giảm nhẹ tức có chết sinh để thay nên mật độ tế bào giai đoạn tương đối ổn định từ 7,461 log CFU/ml đến 7,411 log CFU/ml Pha tương đối ngắn nên việc lên men thu sinh khối tế bào nên thu giai đoạn từ 22 đến 24 lên men tốt Sau 28 lên men, chủng Bacillus subtilis natto bắt đầu bước vào giai đoạn suy vong Tế bào bắt đầu chết chất giảm, sản phẩm trình trao đổi chất mơi trường lên men tích tụ nhiều làm kìm hãm phát triển tế bào, nồng độ chất dinh dưỡng môi trường lên men giảm nên xảy tượng cạnh tranh chất dinh dưỡng làm cho mật độ tế bào giảm Dựa vào kết khảo sát biến động sinh trưởng chủng giống, nhận thấy mật độ tế bào đạt cực đại thời điểm 22 đến 24 lên men nên tiến hành thu nhận enzyme thời điểm 24 lên men Hoạt độ enzyme nattokinase thời điểm sau 24 lên men 39,18 FU/ml Kết cao kết nghiên cứu trước Nguyễn Anh Tuấn Nguyễn Thúy Hương 31,06 ± 0,297 FU/ml [36], 42 3.2 Tối ưu quy trình cố định tế bào Bacillus subtìlis natto phức chất mang alginate chitosan 3.2.1 Sàng lọc yếu tổ ảnh hưởng đến trình cổ định Khả tạo hạt gel độ bền hạt gel ảnh hưởng đến hiệu suất cố định tế bào tiến hành khảo sát nồng độ alginate từ 1,5% đến 3,5% nồng độ alginate 1,5% độ bền hạt gel hình dạng hạt gel khơng giống hình cầu Hạt gel khơng bền kích thước lỗ gel lỏng lẻo nên tế bào dễ bị thất ngồi Với nồng độ alginate lớn 3,5% dung dịch có độ nhớt cao nên tế bào khó hòa lẫn vào dung alginate nên lượng tế bào hạt gel giảm [47,48,49], Sự ảnh hưởng nồng độ chitosan đến hiệu suất cố định tế bào thông qua kết hợp nhóm amino chitosan nhóm cacbonat alginate làm tăng độ bền hạt gel giảm thất thoát tế bào trình lên men Khi nồng độ chitosan 0,2% kích thước lỗ gel lớn nên tế bào dễ bị thất ngồi hạt gel Ngược lại, nồng độ chitosan lớn 0,6% hạt gel bền tính thấm giảm nên khuếch tán chất dinh dưỡng sản phẩm trao đổi chất qua màng hạt gel khó khăn Bên cạnh đó, giá trị pH chitosan ảnh hưởng đến độ bền hạt gel phát triển tế bào cố định Với pH nhỏ khả liên kết nhóm amino chitosan nhóm cacbonat alginate yếu, mặt khác đặc điểm sinh lý chủng giống Bacillus subtilis natto phát triển mơi trường có pH nhỏ Với pH lớn chitosan khơng thể hòa tan chitosan tan mơi trường acid yếu [47], Trong trình cố định định tế bào, ảnh hưởng nồng độ CaCb tới hiệu suất cố định tế bào thể qua khả tạo gel alginate ion Ca2+ Khi nồng độ CaƠ2 nhỏ 1% trình tạo hạt gel chậm xảy khơng hồn tồn, kích thước lỗ gel lớn nên tế bào dễ bị thất thoát môi trường lên men nên hiệu suất cố định tế bào thấp Khi nồng độ CaCh lớn 3% trình tạo gel diễn nhanh, nhiên nồng độ CaƠ2 cao tăng áp suất thẩm thấu CaƠ2 muối háo nước nên nồng độ cao áp suất thẩm thấu lớn làm cho tế bào bị nước, co lại chết [26,47], Giống bổ sung yếu tố cần quan tâm tăng giảm lượng giống bổ sung tác động trực tiếp lên hiệu suất cố định tế bào 43 Thời gian lắc sau bổ sung chitosan ảnh hưởng tới hiệu suất cố định tế bào bời thời gian lắc ngắn độ bền hạt gel giảm liên kết alginate chitosan lỏng lẻo Ngược lại thời gian lắc kéo dài liên kết alginate chitosan tăng lên, hạt gel bền Tuy nhiên, thời gian lắc dài làm cho kích thước hạt gel giảm lớp màng chitosan bao quanh hạt gel dày lên, ngăn ngừa trương nở hạt gel làm giảm hấp thu nước Đồng thời, lớp màng bao quanh hạt gel dày dẫn đến tính thấm hạt gel giảm, điều làm giảm khuếch tán chất dinh dưỡng sản phẩm trao đổi chất môi trường tế bào cố định hạt gel Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố: Xi: nồng độ alginate % (w/v); X2: nồng độ chitosan % (w/v); X3: pH chitosan; X4: nồng độ CaCh % ; X5: giống bổ sung (triệu tế bào/mL); XĨ: thời gian lắc (phút); Thí nghiệm sàng lọc thiết kế dựa yếu tố với 12 thí nghiệm trình bày qua bảng 3.2 44 Bảng 3.2: Hiệu suất cố định thí nghiệm sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định TN Xi X2 X3 X4 Xs Xe Hiệu suất cố định (%) -1 -1 1 -1 51,24 1 -1 -1 -1 47,64 -1 1 -1 -1 55,40 1 -1 1 -1 71,67 -1 -1 -1 -1 -1 -1 33,10 1 -1 1 64,12 -1 -1 -1 -1 58,15 -1 -1 -1 1 40,00 -1 -1 -1 -1 32,56 10 -1 1 -1 27,48 11 -1 -1 -1 1 12 -1 1 -1 73,62 37,00 Chú thích: TN: Thí nghiêm; Xỉ nồng độ alginate (%); X2: nồng độ chitosan (%;); X3: pH chitosan; X4: nồng độ CaCỈ2(%); Xs: giống bể sung (triệu tế bào/mL); XĨ: thời gian ỉẳc(phút) Trong 12 thí nghiệm khảo sát, hiệu suất cổ định tế bào dao động khoảng 27,48% - 73,62% khỉ ta thay đổi giá trị yếu tố Hiệu suất cổ định cao 73,62% (thí nghiệm 11) thấp 27,48% (thí nghiệm 10) Thơng qua mức biến Ưong thí nghiệm ảnh hưởng chúng lên hỉệu suất cố định tế bào bảng 3.3 chứng cố sổ nhận xét sau: X2: nồng độ chitosan % (hệ số ảnh hưởng 0,1; p= 0,767); X3: pH chitosan (hệ số ảnh hưởng 0,09; p= 0,774); X4: nồng độ CaCỈ2 (hệ số ảnh hưởng 6,61; p=0,604); XỒ: thời gian lắc (hệ số ảnh hưởng 5,75; p=0,062) yếu tố có giá trị p lớn mức ý nghĩa tt = 0,05 nên yếu tố khơng có ảnh hưởng đến hiệu suất cố định tế bào (bảng 3.3) Bảng 3.3: Các mức biến thí nghiệm ảnh hưởng biến lên hiệu suất cố 45 định (R-sq = 95,10%; p < 0,05 chấp nhận) Mức độ Mức độ ảnh Giá trị hưởng p Ký hiệu Thấp (-1) Trung tâm (0) Xi 1,5 2,5 3,5 39,9 0,01 Nồng độ chitosan (%) X2 0,2 0,4 0,6 0,1 0,767 pH chitosan Nồng độ CaC12 (%) x3 x5 0,09 5,61 45,56 0,774 0,064 Giống bổ sung (triệu tế bào/ml) Thời gian lắc (phút) 5,5 55 5,75 0,062 Các biến Nồng đô alginate (%) X4 x6 10 20 30 Cao (+1) 100 40 0,01 R-sq: mơ hình tìm phù hợp với thực nghiệm Trong Xi: nồng độ alginate (hệ số ảnh hưởng 39,9, p = 0,01) Xs: giống bổ sung (hệ số ảnh hưởng 45,56, p = 0,01) có giá trị p nhỏ mức ý nghĩa a = 0,05 nên thay đổi giá trị hai yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất cố định tế bào (bảng 3.3) Căn vào hệ số ảnh hưởng phải tăng nồng độ alginate (X1), giống bổ sung vào (X5) mức cao ttên giá trị trung tâm, hiệu suất cố định tế bào đạt cao 73,62% thí nghiệm 11, ngược lại giảm nồng độ alginate (X1) mức giá trị trung tâm, giảm lượng giống bổ sung vào (X5) mức trung tâm hiệu suất cố định tế bào thấp 27,48% thí nghiệm 10 Sự tăng giảm yếu tố so với mức giá trị trung tâm làm hiệu suất cố định tế bào dao động 27,48% đến 73,62% Kết có giá trị R - sq = 95,10%, chứng tỏ mơ hình bố trí phù hợp với thực nghiệm khoảng 95,10% Kết thức thí nghiệm sàng lọc, chúng tơi tìm yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định tế bào nồng độ alginate (X1) giống bổ sung (Xs) 3.2.2 Tối ưu hóa trình cé định chủng giống Bacillus subtilis natto phức chất mang alginate - chitosan Kết thức trình sàng lọc Plackett Burman, chúng tơi tìm yếu tố ảnh 46 hưởng đến hiệu suất cố định tế bào nồng độ alginate (X1) lượng giống bổ sung vào (Xs) Với hai yếu tố này, chứng tơi tiến hành tối ưu hóa q trình cổ định với thí nghiệm khởi đầu thí nghiệm gốc thí nghiệm trung tâm Bảng 3.4: Hiệu suất cố định thí nghiệm khởi đầu Chứ thích: TN: Thí nghiệm; XỈ: nồng độ alginate (%); X2: nồng độ chitosan (%); X3: pH chitosan; X4: nồng độ CaCl2 (%); Xs: giống bổ sung (triệu tế bào/ml); XÓ: thời gian lắc(phứt) Trong thí nghiệm khảo sát, hiệu suất cố định tế bào dao động khoảng 30,23% đến 80,27% Khi ta thay đổi giá trị yếu tố mức (-1,1), hiệu suất cố định cao 80,27% (thí nghiệm 4) thấp 30,23% (thí nghiệm 3) Thơng qua mức hai biến ữong thí nghiệm ảnh hưởng chứng lên hiệu suất cố định tế bào (bảng 3.5), chứng tơi có nhận xét sau: Bảng 3.5: Các mức ảnh hưởng hai yếu tố khảo sát 47 R-sq = 98,63%; p < 0,05 chấp nhận Chúng tơi nhận thấy, nồng độ alginate có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất cố định tế bào, sau giống bổ sung vào Cụ thể: X2 - nồng độ alginate (%) có hệ số ảnh hưởng 165,02; p= 0,000; X5 - giống bổ sung vào (triệu tế bào/ml) có hệ số ảnh hưởng 31,65; p=0,002 Bảng 3.6: Kết phân tích phương sai hai yếu tố khảo sát bổ sung (triệu tế bào/ml); Curvature: dạng đường cong; lack of fit: mức độ phù hợp mơ hình với liệu Ket phân tích (bảng 3.6), chúng tơi thấy khả mơ hình xuất dạng đường cong lớn (giá trị p nhỏ 0,001, tức xác suất 99,9% khả mơ hình biểu diễn dạng đường cong) Thơng qua hệ số định r2 (ký hiệu R-sq =98,63%) có nghĩa số liệu thực nghiệm tương thích với mơ hình dự đốn dạng đường cong 98,63% Do đó, chúng tơi tiến hành thiết thí nghiệm bề mặt đáp ứng có cấu trúc tâm xoay (RSM - CCD: Response Surface Methods - Central Composite Designs) Thí nghiệm bố trí khảo sát mức (-tr; -1; 0; 1; +CL) với 13 thí nghiệm Trong có 48 thí nghiệm trung tâm, thí nghiệm gốc thí nghiệm dọc trục Hiệu suất cố định tế bào cao thí nghiệm (X1=O; Xs= -d) 90,73% hiệu suất cố định tế bào thấp thí nghiệm (X1= -1; Xs= 1) là: 30,23% trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7: Hiệu suất cố định chủng Bacillus subtilis natto frên phức chất mang alginatechitosan ma trận thực nghiệm RSM-CCD Thí nghiệm Giá trị mã hỏa Xi x5 Giả trị thực X1 Xs (%) (triệu Hiệu suit cố định Y(%) TB/ml) 0 2,5 55 75,67 -1 -1 1,5 10 39,76 -1 -MI M 100 5,858 30,23 -1,41 2,5 55 74,01 1,085 55 32,41 1,41 3,914 55 45,56 90,73 0 2,5 55 76,58 1 3,5 100 59,32 10 -1 3,5 80,27 11 2,5 12 13 0 + 1,41 10 55 2,5 104,142 42,71 0 2,5 55 76,36 75,85 Điều chứng tỏ, nồng độ alginate mật độ tế bào giảm xuống mức gỉá trị trung tâm hiệu suất cổ định tế bào đạt cao thí nghiệm khác Ngược lạỉ, giảm nồng độ alginate xuống mức -1 tăng mật độ tế bào lên ưên mức trung tâm hiệu suất cố định giảm so với thí nghiệm khác Do đố, giảm nồng độ alginate xuống mức -1 tăng mật độ giống bổ sung vào hiệu suất cố định tế bào giảm 49 Phân tích ANOVA thí nghiệm đáp ứng bề mặt cấu trúc tâm xoay, mối quan hệ hiệu suất cố định tế bào với biến ảnh hưởng, hàm mục tiêu xác định: Y(%)= -67,86 + 106,86X1 + l,35Xs - 18,47X12 - 2,27Xs2 - 6,34X1X5 R- sq = 90,15% chứng tỏ mơ hình tìm tương thích với thực nghiệm 90,15% Trong đó, Y(%): hiệu suất cố định tế bào, Xi: nồng độ alginate, X5: mật độ giống ban đầu (triệu tế bào/ml) Phân tích hồi quy cho thấy nồng độ alginate tỷ lệ thuận với hiệu suất cố định tế bào theo hàm bậc với hệ số ảnh hưởng dương tỷ lệ nghịch với hiệu suất cố định tế bào dạng hàm bậc hai với hệ số ảnh hưởng âm Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc 106,86 theo hàm bậc -18,47 Giống bổ sung vào tỷ lệ thuận với hiệu suất cố định tế bào theo dạng hàm bậc theo hệ số ảnh hưởng dương tỷ lệ nghịch với hàm bậc hai với hệ số ảnh hưởng âm Mức độ ảnh hưởng theo hàm bậc 1,35 theo hàm bậc hai -2,27 Khi bổ sung giống vào mức giá trị trung tâm hiệu suất cố định tế bào giảm Điều cho thấy, bổ sung giống vào mức cao dẫn đến tượng cạnh tranh chất dinh dưỡng tế bào hạt gel Bên cạnh đó, gia tăng nồng độ sản phẩm trình trao đổi chất dẫn đến ức chế tế bào Do đó, tế bào bước vào pha suy vong nên mật độ tế bào hạt gel giảm dần Khi tăng nồng độ alginate lên mức giá trị trung tâm hiệu suất cố định tế bào tăng, nhiên nồng độ alginate đạt đến giá trị +1 dù có tăng nồng độ alginate hiệu suất cố định tế bào khơng tăng Nguyên nhân nồng độ alginate cao độ nhớt cao, khả khuếch tán tế bào vào dịch alginate nên hiệu suất cố định tế bào giảm Ngược lại, giảm nồng độ alginate xuống mức trung tâm hiệu suất cố định tế bào giảm nồng độ alginate thấp hạt gel khơng bền khơng có hình dạng cố định Kích thước lỗ gel to nên tế bào dễ bị thất ngồi hạt gel 50 Cặp yếu tố nồng độ alginate (X1) giống bổ sung (X5) tỷ lệ nghịch với hiệu suất cố định tế bào theo hệ số ảnh hưởng âm, mức độ ảnh hưởng -6,34 Contour Plot of V-CCD V5 hljt [lo tebao, Alginate » IW1 20 - - c* ■ ■ iữ - BO BO Surface Plotof Y CCOvs Matdo te bao, Alginate ĐỒ thị 3.2: Đồ thị biểu diễn tương tác nồng độ alginate giống bổ sung đến hiệu suất cố định tế bào Từ đồ thị biểu diễn tương tác nồng độ alginate giống bổ sung đến hiệu suất cố định tế bào chứng tơi có nhận xét sau: Khi nồng độ alginate nhỏ 1,5% giống bả sung vào lớn giá trị trung tâm (55 triệu tế bào/ml) hiệu suất cổ định tế bào đạt từ 20% - 40% Khi mật độ giống bổ sung vào lớn 100 triệu tế bào/ml hiệu suất cố định đạt 40% - 60% Khỉ nồng độ alginate đạt mức giá trị trung tâm (2,5%) giống bổ sung đạt mức trung tâm (55 triệu tế bào/ml) hiệu suất tế bào đạt 60 - 80% Khi nồng độ alginate khoảng từ 2% đến 3,5% mật độ tế bào 51 khoảng nhỏ 5,58 triệu tế bào/ml hiệu suất cố định lớn 80% Bằng phương pháp thiết kế thí nghiệm sàng lọc dựa ma trận Plackett - Burman, xác định yếu tổ ảnh hưởng đến hiệu suất cố định tế bào nồng độ alginate mật độ giống bổ sung Thông sổ tối ưu hai yểu tổ nồng độ alginate 2,5 % nồng giống bổ sung vào đạt 5,858 triệu tế bào/ml hiệu suất cố định đạt 90,73% Từ thơng sổ q trình tối ưu, chúng tơi tiến hành lên men chế phẩm cổ định để thu enzyme nattokinase khảo sát trình lên men sinh tổng hợp enzyme nattokinase theo thời gian Qua khảo sát sổ lần tái sử dụng chế phẩm cổ định đảnh giá hiệu phức chất mang alginate - chitosan việc ứng dụng cố định tế bào Bacillus subtilis natto 3.3 ứng dụng chế phẩm Bacillus subtilis natto cố định phức chất mang alginate chitosan để lên men nattokinase 3.3.1 Biến động trình lên men sinh tong hợp nattokinase theo thời gian Sau tạo chế phẩm chứa tế bào cố định, sử dụng chế phẩm để lên men enzyme nattokinase Thí nghiệm thực điều kiện lên men: mơi trường lên men, tốc độ lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ lên men 37°c Thời điểm bắt đầu lấy mẫu để khảo sát hoạt độ enzyme bắt đầu sau lên men đến 28 lên men, kết chúng tơi trình bày đồ thị 3.3 52 Đồ thị 3.3: Anh hưởng thời gian lên men đến trình sinh tỏng hợp nattokìnase Nhìn vào đồ thị 3.3 thấy, hoạt độ enzyme thu tăng theo thời gian khảo sát từ đến 28 gỉờ lên men Ở thời điểm sau lên men, hoạt độ enzyme nattokinase đạt 31,46 FU/ml Do giai đoạn này, tế bào pha log nên tế bào tập trung sử dụng chất dinh dưỡng để tăng sinh Dựa vào kết khảo sát biến động sinh trưởng chủng giống ta tháy, mật độ tế bào tăng dần theo pha log frong thời gian từ đến 24 hoạt độ enzyme nattokỉnase thu tăng dần khoảng thời gian khảo sát Tại thời điểm sau 20 lên men, hoạt độ enzyme tăng gấp 2,02 lần so với thời điểm lên men Tại thời điểm 24 đến 28 lên men, tức tế bào vi khuẩn bước vào pha cân tin hoạt độ enzyme tăng nhẹ khoảng 0,16 FU/ml Điều cho thấy, sụ tăng mật độ tế bào môi trường lên men tỷ lệ thuận vối hoạt độ enzyme thư Kết tương ứng với nghiên cứu trước đỏ chứng minh mối quan hệ sinh khối tế bào Bacillus subtìlis natto hoạt độ enzyme nattokỉnase thu được, sinh khối tế bào đạt cực đại hoạt độ enzyme thu đạt cực đại [43,50,51,52] Dựa vào kết khảo sát khả sinh enzyme nattokỉnase theo thời gian tế bào cố định, thấy hoạt độ enzyme đạt mức cao 71,96 FƯ/ml sau 28 lên men Tuy nhiên, theo kết khảo sát biến động sinh trưởng chủng giống thấy, thời điểm 28 lên men tế bào bắt đầu bước vào pha suy vong Do việc sử dụng tế bào cố định để lên men nhằm hai mục đích thu enzyme nattokinase có hoạt độ cao nhất, đồng thời tế bào hạt gel cố định phải giai đoạn có mật độ cao Việc kéo dài thời gian lên men thêm hoạt độ enzyme nattokinase thu tăng 0,16 FU/ml kéo dài thời gian lên men thực khơng cần thiết Trong q trình lên men, giảm thời gian lên men yếu tố cần thiết để giảm chi phí tăng hiệu q trình lên men Do đó, lựa chọn thời điểm kết thúc lên men để thu enzyme tiếp tục tái sử dụng tế bào cố định để lên men lần lựa chọn thời điểm sau 24 lên men, sau 24 lên men trình lên men tế bào cố định dừng lại, thu dịch lên men để khảo sát hoạt độ enzyme thu Hạt gel chứa tế bào cố định chuyển sang bình lên men có mơi trường, thể tích điều kiện lên men giống lần lên men 53 trước để khảo sát số lần tái sử dụng hạt gel chứa tế bào cố định 3.3.2 So sánh trình lên men nattokinase tế bào tự tế bào cố định Từ kết khảo trình lên men nattokinase tế bào cố định, tiến hành lên men nattokinase tế bào tự tế bào cố định với điều kiện để so sánh hoạt độ enzyme nattokinase thu Hoạt độ enzyme nattokinase hai trình lên men thể đồ thị 3.4 Đồ thị 3.4: So sánh hoạt độ enzyme lên men tế tự tế bào cổ định Dựa vào kết hoạt độ enzyme thu sau lên men tế bào tự tế bào cố định môi trường đỉều kiện lên men, chúng tơi có số nhận xét sau: Đối với tế bào tự do, hoạt độ enzyme nattokỉnase thu đạt cực đại sau 20 lên men Trong khỉ đó, tế bào cố định phức chất mang alginate - chitosan hoạt độ enzyme thu đạt cục đại sau 28 lên men Nguyên nhân cố sụ khác cố thể tế bào cố định nhiều thời gian để thích nghỉ vối mơỉ trường lên men tế bào tự Khi tế bào tự bổ sung vào mơi trường lên men tiếp xúc trực tiếp với chất Còn tế bào cố định, tế bào nhốt sau lớp màng chắn hạt gel sử dụng chất sau khỉ chất khuếch tán qua màng Mặt khác, khuếch tán có số hạn chế chịu ảnh hưởng bời nồng độ kích thước phần tử chất Chính điều làm 54 cho thời gian thích nghỉ tế bào cố định chậm tế bào tự Tuy nhiên tế bào tự do, thời gian lên men tăng từ 20 đến 28 hoạt độ enzyme nattokỉnase thu được khơng tăng, đỏ hoạt độ enzyme nattokinase thu lên men tế bào cố định tăng 4,75 FU/ml Từ kết khảo sát ta thấy, thời điểm sau 28 lên men hoạt độ enzyme nattokinase tế bào cố định cao tế bào tự 2,66 FU/ml Điều cho thấy, việc cố định tế bào chất mang không làm ảnh hưởng tới phát triển tế bào khả lên men sinh enzyme nattokinase chủng giống Bacillus subtilis natto Các kết thể hiệu phức chất mang alginate - chitosan trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto Phức chất mang bảo vệ tế bào tránh tác động học trình lên men tác động từ chất môi trường lên men đồng thời tế bào không bị ức chế sản phẩm trao đổi chất khác tế bào sinh trình lên men [9], Mặt khác, theo nghiên cứu phát triển tế bào hạt gel mật độ tế bào tập trung chủ yếu diện tích khoảng 300pm bề mặt hạt gel [20], hiệu lên men tế bào cố định cao so với tế bào tự 3.3.3 Khảo sát sổ lần tái sử dụng chế phẩm tế bào cổ định Sau khảo sát trình lên men nattokinase tế bào cố định, thấy Tại thời điểm 28 lên men, hoạt độ enzyme nattokinase thu cao Tuy nhiên tăng thời gian lên men từ 24 lên 28 tức kéo dài thời gian thêm hoạt độ enzyme nattkinase thu tăng 0,16 FU/ml Điều cho thấy việc kéo dài thêm lên men không mang lại hiệu kinh tế Do chúng tơi tiến hành khảo sát tái sử dụng chế phẩm cố định cách sau chu kỳ 24 chúng tơi tiến hành dừng q trình lền men, thu enzyme nattokinase chuyển chế phẩm cố định sang bình lên men với môi trường điều kiện lên men ban đầu Kết khảo sát tái sử dụng chế phẩm cố định trình bày đồ thị 3.5 Nhìn vào kết đồ thị 3.5 thấy, hoạt độ enzyme nattokinase lần tái sử dụng thứ thứ cao hoạt độ enzyme lần lên men chế phẩm ban đầu Cụ thể lần tái sử dụng thứ nhất, hoạt độ enzyme nattokinase cao lần lên men chế phẩm ban đầu 55 1,33 FU/ml lần tái sử dụng thứ hoạt độ enzyme thu cao so với lần lên men chế phẩm ban đầu 0,61 FU/ml Điều giải thích dừng ... trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto > Tối ưu hóa q trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto phức chất mang alginate - chitosan > So sánh trình lên men nattokinase tế bào cố định tế bào. .. Cố định tể bào Bacillus subtilis natto phức chất mang alginate - chitosan để lên men nattokinase ” NHỆM VỤ VÀ NỘI DƯNG: - Tối ưu hóa q trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto phức chất mang. .. trình cố định chủng giống Bacillus subtilis natto phức chất mang alginate - chitosan 48 3.3 ứng dụng chế phẩm Bacillus subtilis natto cố định phức chất mang alginate chitosan để lên men