Tóm tắt: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương

Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Lê Minh Châu NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM PHYTOESTROGEN TỪ PHƠI ĐẬU TƯƠNG Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023 Cơng trình hoàn thành tại: Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên PGS.TS Hồ Phú Hà Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Đại học Bách Khoa Hà Nội họp Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Phytoestrogen có nhiều lợi ích với sức khỏe người, đặc biệt phụ nữ phụ nữ mãn kinh: phòng chống ung thư, làm giảm cholesterol bệnh tim mạch, phòng chống triệu chứng bất lợi tuổi mãn kinh, tăng cường khả nhận thức Các phytoestrogen có mặt phận khác đậu tương hạt, mầm, thân, rễ Theo nghiên cứu gần công bố, so sánh thành phần cấu tạo hạt đậu tương gồm vỏ hạt, phôi hạt phần nội nhũ phơi hạt có hàm lượng phytoestrogen cao Các nghiên cứu nhóm hợp chất phytoestrogen phôi đậu tương công bố giới chủ yếu tập trung vào hợp chất gồm nhóm aglycone β-glucoside tài liệu công bố đủ 12 thành phần phytoestrogen phôi hạt chưa nhiều Kết khảo sát 12 thành phần phytoestrogen phận hạt đậu tương giống đậu tương Hàn Quốc, Pháp cho thấy phôi hạt đậu tương có hàm lượng phytoestrogen cao nhất, gấp 5-6 lần so với toàn hạt cao nhiều lần so với vỏ hạt mầm Tại Việt Nam chưa có báo cáo 12 thành phần phytoestrogen phơi hạt, chưa có nhìn tổng qt nhóm hợp chất Do đó, chúng tơi tiến hành với đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương” Đề tài định hướng nghiên cứu, phân tích đầy đủ thành phần hoạt chất dẫn chất dạng glucoside từ định lượng xác hàm lượng phytoestrogen tổng số, xây dựng phương án chiết xuất tối ưu, nâng cao hiệu suất thu nhận phytoestrogen dạng aglycone, thử nghiệm số hoạt tính sinh học phytoestrogen chiết xuất từ phôi đậu tương Mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng chế độ chiết xuất phyoestrogen từ bột phôi đậu tương làm giàu phytoestrogen dạng aglycone Chứng minh thực nghiệm hoạt tính chống oxy hóa phytoestrogen Thử nghiệm hoạt tính phytoestrogen in vivo 2.2 Nội dung nghiên cứu Đánh giá xử lý nguyên liệu: Đánh giá hàm lượng tạp phôi đậu tương ban đầu, xác định đặc tính bột phơi đậu tương bột phôi đậu tương loại lipid - Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất phytoestrogen tổng; Tối ưu hóa chế độ chiết xuất phytoestrogen tổng - Thu nhận phytoestrogen aglycone: Khảo sát chế độ thủy phân phytoestrogen glucoside thành aglycone enzyme βglucosidase, cellulase; Tinh phytoestrogen aglycone - Đánh giá khả chống oxy hóa cao chiết phytoestrogen gồm cao phytoestrogen tổng, cao phytoestrogen aglycone thô cao phytoestrogen aglycone tinh - Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo cao phytoestrogen tổng cao phytoestrogen aglycone thô Ý nghĩa khoa học đề tài - 3.1 Ý nghĩa khoa học Luận án số cơng trình cơng bố đầy đủ 12 thành phần phytoestrogen phôi hạt – phụ phẩm trình sản xuất bột đậu tương phận có hàm lượng phytoestrogen cao so với phận khác hạt đậu Kết nghiên cứu luận án đóng góp vào sở liệu khoa học phytoestrogen từ nguồn nguyên liệu Khẳng định thực nghiệm dạng phytoestrogen gồm βglucoside, acetyl-glucoside, malonyl-glucoside bị thủy phân enzyme β-glucosidase enzyme cellulase – sở cho việc nghiên cứu làm giàu phytoestrogen dạng aglycone thông qua việc nâng cao hiệu suất thủy phân dạng acetyl-glucoside malonylglucoside Các nghiên cứu công bố cho thấy dạng acetylglucoside, malonyl-glucoside khó bị thủy phân hệ tiêu hóa người hướng đề xuất nâng cao hàm lượng phytoestrogen aglycone đường thủy phân dạng glucoside enzyme β-glucosidase enzyme cellulase bên thể đường hướng khả thi, hiệu Đề xuất nâng cao hàm lượng phytoestrogen aglycone enzyme cellulase – enzyme chưa phổ biến thủy phân phytoestrogen glucoside, đặc biệt thủy phân cao chiết phytoestrogen từ phôi đậu tương 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Dựa vào kết đánh giá hàm lượng phytoestrogen bột phôi đậu tương, khẳng định tiềm sử dụng phôi đậu tương – phụ phẩm trình sản xuất đậu tương mảnh, chủ yếu làm thức ăn gia súc chưa phát huy hết hoạt tính sinh học q Kết đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hoạt tính sinh học dịch chiết phytoestrogen cho thấy phytoestrogen có khả chống oxy hóa có hiệu tương tự estradiol có giá trị việc ứng dụng sản xuất chế phẩm bổ sung dinh dưỡng hay thực phẩm thuốc, mỹ phẩm để chăm sóc sức khỏe người, đặc biệt phụ nữ tiền mãn kinh mãn kinh Tính đề tài Luận án cơng trình nghiên cứu có hệ thống Việt Nam nghiên cứu, khảo sát đầy đủ phytoestrogen dạng dẫn xuất chúng từ phôi đậu tương giống Đ8 Việt Nam, nguồn phụ phẩm giàu phytoestrogen, chưa sử dụng rộng rãi cho người mà chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi Luận án đánh giá khả chống oxy hóa, độc tính hoạt tính estrogen in vivo của cao chiết giàu phytoestrogen từ phôi hạt Đề xuất chế độ làm giàu phytoestrogen aglycone từ phôi đậu tương sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân enzyme cellulase từ Trichoderma reesei Kết cho thấy sử dụng enzyme cellulase để thủy phân hiệu so với việc sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân, sở khoa học cho việc nghiên cứu phát triển sản phẩm có chứa phytoestrogen aglycone nâng cao giá trị hợp chất này, làm phong phú thêm tính ứng dụng chúng lĩnh vực công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm dược phẩm Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Cây đậu tương phơi đậu tương 1.1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ đậu tương Việt Nam 1.1.2 Thành phần hóa học phơi đậu tương 1.1.3 Thành phần chất có hoạt tính sinh học phơi đậu tương 1.2 Phytoestrogen 1.2.1 Tổng quan phytoestrogen 1.2.2 Phytoestrogen phôi đậu tương 1.2.3 Khả dụng sinh học phytoestrogen đậu tương 1.2.4 Lợi ích phytoestrogen aglycone đậu tương chất chuyển hóa chúng với sức khỏe người 1.2.5 Tính an tồn phytoestrogen đậu tương 1.3 Các phương pháp chiết xuất phytoestrogen 1.3.1 Các phương pháp truyền thống 1.3.2 Các phương pháp đại 1.3.3 Phương pháp chiết xuất phytoestrogen phôi đậu tương 1.4 Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside đậu tương thành aglycone 1.4.1 Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside enzyme 1.4.2 Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside vi sinh vật 1.5 Phương pháp tinh phytoestrogen aglycone 1.6 Các sản phẩm có chứa phytoestrogen từ đậu tương Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Phôi đậu tương 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Động vật thực nghiệm 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 2.2 Bố trí thí nghiệm phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp đánh giá xử lý nguyên liệu 2.2.2 Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen 2.2.3 Phương pháp thu nhận phytoestrogen aglycone 2.2.4 Đánh giá khả chống oxy hóa cao chiết phytoestrogen 2.2.5 Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo Bột phôi đậu tương Đánh giá xử lý nguyên liệu Loại lipid n-hexane Thu hồi n-hexane Bột phôi đậu tương loại lipid Chiết xuất Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen Dịch chiết phytoestrogen tổng Thu hồi ethanol Cô quay chân không Cao phytoestrogen tổng Loại protein, saccharide Cao phytoestrogen trước thủy phân Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo Thủy phân enzyme Thu nhận phytoestrogen aglycone Đánh giá khả chống oxy hóa Cao phytoestrogen aglycone thô Tinh dung môi Cao phytoestrogen aglycone tinh Hình 2.1 Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm 2.3 Xử lý số liệu Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đánh giá xử lý nguyên liệu 3.1.1 Đánh giá hàm lượng tạp chất phôi đậu tương A B Hình 3.1 Phơi đậu tương chưa loại tạp (A) phôi đậu tương loại tạp (B) Bảng 3.1 Kết đánh giá lượng tạp phôi đậu tương Kết (%) Hàm lượng tạp chất lt 18,96 ± 0,61 3.1.2 Đặc tính bột phơi đậu tương Bảng 3.2 Đặc tính bột phơi đậu tương Độ ẩm W1 (%) Hàm lượng lipid L1 (%) 5,86 ± 0,07 10,56 ± 0,09 Bảng 3.3 Hàm lượng phytoestrogen bột phôi đậu tương STT Thành phần Hàm lượng Hàm lượng (mg/100g) (µmol/g) Daidzein 40,89 ± 0,62 1,61 ± 0,02 Glycitein 62,38 ± 0,20 2,19 ± 0,01 Genistein 41,60 ± 0,47 1,54 ± 0,00 Daidzin 257,75 ± 0,74 6,19 ± 0,02 Glycitin 152,73 ± 0,85 3,42 ± 0,02 Genistin 159,63 ± 1,08 3,69 ± 0,03 Acetyldaidzin 349,28 ± 0,89 8,12 ± 0,02 Acetylglycitin 23,79 ± 0,15 0,49 ± 0,00 Acetylgenistin 239,20 ± 1,45 5,04 ± 0,03 Malonyldaidzin 75,61 ± 0,44 1,51 ± 0,01 10 Malonylglycitin 64,13± 0,31 1,20 ± 0,01 11 Malonylgenistin 304,58 ± 1,06 5,88 ± 0,02 12 Phytoestrogen tổng số 1771,58 ± 3,10 40,88 ± 0,06 Hàm lượng phytoestrogen tổng số bột phôi đậu tương ban đầu 1771,58 ± 3,10 mg/100g CK, tương đồng với kết hàm lượng phytoestrogen tổng số thành phần phôi đậu tương giống Pháp, Hàn Quốc, Thái Lan, Australia công bố Bột phôi đậu tương nghiên cứu có hàm lượng aglycone cao vượt trội 8%, hàm lượng β-glucoside cao, 30% thuận lợi 3.1.3 Đặc tính bột phơi đậu tương loại lipid Hình 3.2 Bột phơi đậu tương (A) bột phôi đậu tương loại lipid (B) Bảng 3.5 Đặc tính bột phơi đậu tương loại lipid Độ ẩm W2 (%) Hàm lượng lipid L2 (%) 5,79 ± 0,09 0,43 ± 0,06 ‒ Hiệu suất loại lipid bột phôi đậu tương 95,92% ‒ Hiệu suất thu hồi bột phôi loại lipid 97,21% ‒ Hiệu suất thu hồi dung môi n-hexane 66,67% Bảng 3.6 Hàm lượng phytoestrogen bột phôi đậu tương loại lipid STT Thành phần 10 11 12 Daidzein Glycitein Genistein Daidzin Glycitin Genistin Acetyldaidzin Acetylglycitin Acetylgenistin Malonyldaidzin Malonylglycitin Malonylgenistin Phytoestrogen tổng Hàm lượng (mg/100g) 45,57 ± 0,65 68,99 ± 0,22 40,94 ± 0,08 298,88 ± 1,10 172,42 ± 1,13 170,68 ± 0,75 333,22 ± 0,30 14,23 ± 0,28 224,22 ± 0,98 47,77 ± 0,27 30,09 ± 0,09 301,01 ± 4,95 1748,01 ± 8,25 Hàm lượng (µmol/g) 1,79 ± 0,03 2,43 ± 0,01 1,52 ± 0,00 7,18 ± 0,03 3,86 ± 0,03 3,95 ± 0,02 7,74 ± 0,01 0,29 ± 0,01 4,73 ± 0,02 0,95 ± 0,01 0,57 ± 0,00 5,81 ± 0,10 40,80 ± 0,17 250 240 b b b b a 230 220 210 200 25 30 35 40 250 Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (mg/g CK) Khối lượng dịch chiết phytoestrogentổng (mg/gCK) 3.2 Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen 3.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất phytoestrogen 45 240 1/8 Hình 3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng c ab 240,00 230,00 220,00 210,00 200,00 tb 10 11 239,39 243,35 250,01 245,43 240,11 pH Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (mg/g CK) b b a a 250,00 240,00 230,00 220,00 210,00 200,00 tb 50% 60% 70% 80% 90% 250,01 254,29 255,18 250,11 248,02 b b b b 90 120 150 180 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng a 60 a Nồng độ ethanol (%) Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng 270,00 260,00 250,00 240,00 230,00 220,00 210,00 200,00 1/20 tb 233,57 239,39 240,26 241,71 243,49 Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (mg/g CK) Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (mg/g CK) a 1/15 200 260,00 d 1/12 210 Tỉ lệ ngun liệu /dung mơi Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng bc 1/10 220 Nhiệt độ (độ C) 250,00 b 230 tb 229,06 233,57 235,36 236,78 236,87 260,00 b b b a tb 254,29 264,23 266,87 267,13 268,04 Thời gian (phút) Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (B) (A) Hình 3.8 Biểu đồ so sánh giá trị thực nghiệm – dự đoán (A) Phân bố ngẫu nhiên 29 thí nghiệm (B) Phương trình hồi quy lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) có dạng mơ hình bậc biểu diễn theo biến coded Y = 264,13 + 2,66X1 + 16,6X2 – 0,58X3 – 1,66X4 + 3,91X1X2 – 1,97X1X – 3,50X1 X – 3,56X2X + 2,64X2X4 + 3,87X3X – 4,21X12 – 3,08X22 – 3,08X32 – 4,17X42 Phương trình hồi quy hàm lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) có dạng mơ hình bậc biểu diễn theo biến thực sau: Y = - 255,97728 + 1,57066X1 + 25,94183X2 + 55,35413X3 + 1,08964X4 + 0,065233X1 X – 0,065650X1 X – 0,011682X1 X – 1,77938X2 X + 0,13184X2 X4 + 0,38715X3X4 – 4,67993E-0,03X12 – 0,77051X22 – 3,08093X32 – 0,041721X42 Do giá trị a3 >0,05 nên phương trình hồi quy khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (Y) theo biến thực suy biến sau Y = - 255,97728 + 1,57066X1 + 25,94183X2 + 1,08964X4 + 0,065233X1 X – 0,065650X1 X – 0,011682X1 X – 1,77938X2 X + 0,13184X2 X4 + 0,38715X3X4 – 4,67993E-0,03X12 – 0,77051X22 – 3,08093X32 – 0,041721X42 (A) Ảnh hưởng thời gian chiết xuất nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng 11 (B) Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi: nguyên liệu nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (C )Ảnh hưởng pH nồng độ ethanol đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (E) Ảnh hưởng thời gian chiết xuất tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (D) Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi: nguyên liệu pH đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng (F) Ảnh hưởng thời gian chiết xuất pH đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng Hình 3.10 Biểu diễn 3D ảnh hưởng yếu tố thực nghiệm đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng Như điều kiện chiết xuất lựa chọn sau tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt là: Thời gian chiết xuất 90 phút Tỉ lệ dung môi / nguyên liệu 1/12 pH chiết xuất 9; Nồng độ ethanol 65% Bảng 3.3 Hàm lượng phytoestrogen dịch chiết phytoestrogen tổng Tối ưu phương pháp đáp Thành phần ứng bề mặt (µmol/g CK) Daidzein 1,66 ± 0,01 Glycitein 2,34 ± 0,01 12 10 11 12 1,39 ± 0,01 6,77 ± 0,03 3,75 ± 0,02 3,91 ± 0,02 7,61 ± 0,03 0,18 ± 0,00 4,63 ± 0,02 0,76 ± 0,00 0,33 ± 0,00 5,70 ± 0,02 39,02 ± 0,16 Genistein Daidzin Glycitin Genistin Acetyldaidzin Acetylglycitin Acetylgenistin Malonyldaidzin Malonylglycitin Malonylgenistin Phytoestrogen tổng So sánh hiệu trình chiết xuất phytoestrogen phương pháp khảo sát đơn yếu tố phương pháp đáp ứng bề mặt hiệu chiết xuất phytoestrogen tổng số tăng từ 81,14 tăng lên 95,62% Trong lượng phytoestrogen thu theo phương pháp khảo sát đơn yếu tố 32,19 ± 0,21 (µmol/g CK) tương đương 1418,27 ±10,23 (mg/100 g CK) tăng lên chiết xuất theo phương pháp đáp ứng bề mặt 39,02 ± 0,16 (µmol/g CK) tương đương 1671,54 ± 6,86 (mg/100g CK) 3.3 Thu nhận phytoestrogen aglycone 3.3.1 Thu nhận cao phytoestrogen tổng Từ bột phôi đậu tương loại lipid tiến hành chiết xuất, cô quay thu cao phytoestrogen tổng Hiệu suất thu hồi dung môi ethanol 70,21% Cao phytoestrogen tổng điều chỉnh pH xác định hàm lượng phytoestrogen thành phần HPLC Kết cao chiết trước thủy phân trình bày bảng sau Bảng 3.13 Hàm lượng phytoestrogen cao chiết trước thủy phân STT Thành phần cao chiết Hàm lượng (µmol/g CK) Daidzein 1,92 ± 0,06 Glycitein 2,72 ± 0,10 Genistein 1,74 ± 0,02 13 Daidzin 9,57 ± 0,13 Glycitin 5,14 ± 0,14 Genistin 5,63 ± 0,09 Acetyldaidzin 7,77 ± 0,05 Acetylglycitin 0,39 ± 0,01 Acetylgenistin 4,77 ± 0,08 10 Malonyldaidzin 1,32 ± 0,06 11 Malonylglycitin 1,16 ± 0,02 12 Malonylgenistin 5,77 ± 0,04 Phytoestrogen tổng 47,90 ± 0,14 3.3.2 Chuyển hóa phytoestrogen glucoside thành aglycone enzyme β-glucosidase Sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân để chuyển hóa phytoestrogen glucoside pH 5, nhiệt độ 37 oC Kết khảo sát nồng độ enzyme thời gian thủy phân trình bày hình sau Hình 3.12 Hiệu suất thủy phân Hình 3.14 Hiệu suất thủy phân dạng glucoside theo nồng dạng glucoside enzyme độ enzyme β-glucosidase β-glucosidase theo thời gian 14 Hàm lượng aglycone (µmol/g CK) 35,00 c c bc b b 30,00 25,00 20,00 d d cd bc b 15,00 10,00 5,00 0,00 a b b b b b b b b b b a a a 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 Daidzein 1,92 14,88 14,89 14,94 14,97 14,98 Glycitein 2,72 7,58 7,57 7,58 7,58 7,59 Genistein 1,74 8,75 8,75 8,77 8,81 8,82 Aglycone tổng 6,38 31,21 31,22 31,29 31,36 31,39 Thời gian (h) Daidzein Glycitein Genistein Aglycone tổng Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian thủy phân enzyme βglucosidase đến hàm lượng aglycone Vậy sử dụng enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân 49290 (Sigma-Aldrich) hoạt lực U/mg để làm giàu aglycone cao chiết phytoestrogen tổng số Điều kiện thủy phân phytoestrogen glucoside enzyme là: ‒ pH ‒ Nhiệt độ 37 oC ‒ Nồng độ enzyme: U/g bột đậu tương khử lipid ‒ Thời gian 5,5 3.3.3 Chuyển hóa phytoestrogen glucoside thành aglycone enzyme cellulase Enzyme cellulase từ Trichoderma reesei C2730 (Sigma) hoạt lực β-glucosidase 28 U/ml Điều kiện phản ứng thủy phân sở xác định theo khuyến cáo Sigma Wang [78]: pH = 4,8; Nhiệt độ 40 o C; Nồng độ enzyme 0,5 U/g; Thời gian: 4,0 15 Hình 3.16 Hiệu suất thủy phân dạng glucoside enzyme cellulase theo nhiệt độ Bảng 3.18 Hiệu suất thủy phân dạng glucoside enzyme cellulase theo pH Hình 3.20 Hiệu suất thủy phân Hình 3.22 Hiệu suất thủy phân dạng glucoside theo nồng độ dạng glucoside enzyme enzyme cellulase cellulase theo thời gian 16 Hàm lượng aglycone (µmol/g) e d b 40,00 c c 35,00 30,00 25,00 b 20,00 10,00 5,00 0,00 aaa a c b 15,00 c cd c c d d c c d b c b 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 Daidzein 1,92 16,15 16,49 16,67 16,49 16,48 Glycitein 2,72 5,66 5,69 5,70 5,60 5,60 Genistein 1,74 13,12 13,27 13,54 13,27 13,27 Aglycone tổng 6,38 34,94 35,45 35,91 35,36 35,35 Thời gian (h) Daidzein Glycitein Genistein Aglycone tổng Hình 3.23 Ảnh hưởng thời gian thủy phân enzyme cellulase đến hàm lượng aglycone Vậy sử dụng enzyme Cellulase từ Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich) để làm giàu aglycone cao chiết phytoestrogen tổng Điều kiện thủy phân enzyme là: ‒ pH ‒ Nhiệt độ 50 oC ‒ Nồng độ enzyme: 1,5 U/g bột đậu tương khử lipid ‒ Thời gian 5,0 3.3.4 So sánh hiệu trình thủy phân glucoside enzyme β-glucosidase cellulase Dựa vào kết làm giàu aglycone hai enzyme β-glucosidase hạnh nhân cellulase Trichoderma reesei cho thấy sử dụng với nồng độ enzyme thấp hơn, cellulase Trichoderma reesei cho hiệu suất thủy phân dạng β-glucoside tương đương với việc sử dụng βglucosidase hạnh nhân, ngồi cịn hiệu việc thủy phân dạng acetyl-glucoside làm tổng hiệu suất thủy phân dạng glucoside nâng lên 10% dẫn đến hàm lượng aglycone tổng số thu cao 3.3.5 Tinh phytoestrogen 17 Bảng 3.17 Độ tinh cao chiết phytoestrogen theo giai đoạn thu nhận Khối lượng cao chiết (mg) Hàm lượng phytoestrogen tổng (mg/100g CK) Hàm lượng aglycone (mg/100g CK) Hàm lượng aglycone so với phytoestrogen tổng (%) Độ tinh aglycone so với khối lượng cao chiết (%) Cao phytoestrogen tổng Cao phytoestrogen aglycone thô Cao phytoestrogen aglycone tinh 28,08 ± 0,03 4,35 ± 0,01 1,41 ± 0,00 2072,42 ± 4,85 1201,35 ± 1,20 1333,68 ± 3,63 174,12 ± 3,85 951,75 ± 0,80 1161,64 ± 4,20 8,40 79,22 87,10 6,20 21,87 82,39 3.4 Đánh giá khả chống oxy hóa cao chiết phytoestrogen Mẫu 1: cao phytoestrogen tổng (mẫu CE) Mẫu 2: cao phytoestrogen alycone thô (mẫu TPCa) Mẫu 3: cao phytoestrogen aglycone tinh (mẫu TSC) 3.4.1 Đánh giá khả quét gốc tự DPPH Khả quét gốc tự DPPH cao chiết phytoestrogen trình bày hình sau 93,95 100 67,18 80 Phần trăm quét gốc tự (%) Phần trăm quét gốc tự (%) 75,25 80 60 57,49 60 31,11 40 16,74 10 20 Nồng độ acid ascorbic (µg/ml) 16,59 20 20 40,85 40 30 Hình 3.25 Khả quét gốc tự acid ascorbic 23,06 10,50 8,71 0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 Nồng độ cao phytoestrogen tổng (mg/ml) Hình 3.16 Khả quét gốc tự cao phytoestrogen tổng Quadratic Y = 6,431 + 7,815*X – 0,118*X2 Linear Y = -4,656 + 3,791*X IC50 = 6,142 ± 0,050 (mg/ml) IC50 =0,0137 (mg/ml) 18 80 79,51 Phần trăm quét gốc tự (%) Phần trăm quét gốc tự (%) 100 80 52,60 60 33,52 23,64 40 20,80 20 17,69 0,000 40 39,62 26,37 20 18,50 0 500 1000 1500 2000 2500 Nồng độ cao phytoestrogen aglycone tinh (µg/ml) 2,000 4,000 6,000 8,000 Nồng độ cao phytoestrogen aglycone thơ (mg/ml) Hình 3.27 Khả qt gốc tự cao phytoestrogen algycone thơ 68,42 54,06 60 Hình 3.28 Khả quét gốc tự cao phytoestrogen aglycone tinh Quadratic Y = 14,749431 + Quadratic Y = 12,609 + 11,438*X – 0,343*X2 0,049*X – 1,082E-5*X2 IC50 =3,345 ± 0,076 (mg/ml) IC50 = 0,763 ± 0,016 (mg/ml) So sánh giá trị IC50 cao chiết khả quét gốc tự DPPH cao phytoestrogen aglycone tinh > cao phytoestrogen aglycone thô > cao phytoestrogen tổng 3.4.2 Đánh giá lực khử Năng lực khử cao chiết trình bày hình sau 0,946 0,888 1,0 0,730 0,8 0,513 0,6 Năng lực khử sắt Năng lực khử 1,0 0,268 0,4 0,2 0,0 20 40 60 80 100 0,8 0,51 0,6 0,271 0,4 0,162 0,2 0,0 Nồng độ acid ascorbic (µg/ml) 10 15 20 Nồng độ cao phytoestrogen tổng (mg/ml) Hình 3.29 Năng lực khử sắt acid ascorbic Hình 3.30 Năng lực khử sắt cao phytoestrogen tổng Linear Y = 0,052 + 0,011*X Linear Y = 0,069 + 0,046*X IC50 = 9,385 ± 0,272 (mg/ml) IC50 = 0,039 (mg/ml) 0,8 0,8 0,681 0,689 0,733 0,628 0,4 0,2 0,486 0,400 0,6 Năng lực khử Năng lực khử 0,6 0,552 0,532 0,346 0,278 0,250 0,232 0,184 0,0 0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 Nồng đô cao phytoestrogen aglycone thô (mg/ml) Hình 3.31 Năng lực khử sắt cao phytoestrogen aglycone thô 0,4 0,413 0,230 0,2 0,164 0,0 0,116 0,029 cao phytoestrogen aglycone tinh Nồng độ 2000 4000 6000 8000 10000 (µg/ml) Hình 3.32 Năng lực khử sắt cao phytoestrogen aglycone tinh 19 Logarithmic Y = 0,385 + Logarithmic Y = - 0,492 + 0,084*ln(X) 0,139*ln(X) IC50 = 3,961± 0,172 (mg/ml) IC50 = 1,248 ± 0,024 (mg/ml) So sánh giá trị IC50 cao chiết lực khử cao phytoestrogen aglycone tinh > cao phytoestrogen aglycone thô > cao phytoestrogen tổng 3.5 Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo 3.5.1 Thử nghiệm liều phytoestrogen an tồn chuột BALB/c Thí nghiệm xác định liều an tồn tiến hành với nhóm 10 chuột nhắt trắng BALB/c chủng cái, trưởng thành có khối lượng thể khoảng 30 ± (g) với liều phytoestrogen 250 mg/kg/ngày thời gian ngày Kết khơng có chuột bị chết sau thí nghiệm khẳng định liều an toàn LDo = 250 mg/kg/ngày phù hợp với đối tượng thí nghiệm 3.5.2 Ảnh hưởng dịch chiết phytoestrogen đến trọng lượng chuột thí nghiệm Chuột thí nghiệm phân làm nhóm gồm nhóm kí hiệu nhóm đối chứng sinh lý, VCD, VCD + E2, VCD + CE, VCD + TPCa ‒ Nhóm đối chứng sinh lý nhóm chuột bình thường, uống nước ‒ Nhóm đối chứng bệnh lý (VCD) nhóm bị ức chế chức buồng trứng với liều VCD 160 mg/kg/ngày 15 ngày ‒ E2+VCD nhóm xử lý VCD sau điều trị 17β-estradiol 0,1mg/kg/ngày ‒ CE+VCD nhóm xử lý VCD sau điều trị cao phytoestrogen tổng (CE) với liều lượng 50 mg isoflavone /kg/ngày ‒ TPCa+VCD nhóm xử lý VCD sau điều trị cao phytoestrogen aglycone thô với liều lượng 50 mg isoflavone /1kg/ngày Bảng 3.23 Trọng lượng trung bình thể chuột trước sau điều trị Trọng lượng trung bình thể chuột (gram/con) Thời Đối chứng VCD+ điểm VCD VCD + E2 VCD + CE sinh lí TPCa Trước 33,40 ± 30,43 ± 30,90 ± 31,70 ± 30,80 ± điều trị 2,36 2,20 2,44 2,01 2,51 20 Khối lượng tử cung /thể trọng (g/10g) Sau 36,28 ± 32,87 ± 30,26 ± 31,75 ± 30,56 ± điều trị 0,67 2,56 2,86 1,25 1,66 P < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 3.5.3 Ảnh hưởng cao chiết phytoestrogen đến khối lượng tử cung 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 *** ### *** ĐCSL VCD *** ### *** ## VCD + VCD + VCD E2 CE +TPCa So với ĐCSL: p < 0,05 * p < 0,01 ** p < 0,001 *** So với VCD: p < 0,05 # p < 0,01 ## p< 0,001 ### Hình 3.32 Khối lượng trung bình tử cung chuột lơ thí nghiệm Đối chứng sinh lý VCD VCD+CE VCD+TPCa VCD+E2 Hình 3.33 Hình ảnh buồng trứng tử cung chuột lơ thí nghiệm 3.5.4 Ảnh hưởng cao chiết phytoestrogen đến số lượng noãn trứng So với ĐCSL: p < 0,05 * p < 0,01 ** p < 0,001 *** So với VCD: p < 0,05 # p < 0,01 ## p< 0,001 ### Hình 3.24 So sánh tỉ lệ nang sơ cấp nhóm nghiên cứu 21 Đối chứng sinh lý VCD VCD + CE VCD + TPCa VCD +E2 Hình 3.25 Hình ảnh tiêu buồng trứng chuột thí nghiệm (độ phóng đại 100X) 3.5.5 Ảnh hưởng cao chiết phytoestrogen đến hàm lượng estradiol 120 Hàm lượng estradiol (%) 100,00 100 *** ### 70,25 80 *** ### 59,89 *** 48,30 60 *** ### 62,36 So với ĐCSL: p < 0,05 * p < 0,01 ** p < 0,001 *** So với VCD: p < 0,05 # p < 0,01 ## p< 0,001 ### 40 20 ĐCSL VCD VCD+E2 VCD+CE VCD+TPC Hình 3.26 Hàm lượng estradiol máu nhóm nghiên cứu Mẫu cao phytoestrogen tổng cao phytoestrogen aglycone thơ có khả cải thiện đặc tính sinh lý nữ theo hướng tích cực gồm tăng nhẹ khối lượng tử cung, tăng số lượng nang sơ cấp, tăng hàm lượng estradiol huyết mô hình chuột bị gây teo buồng trứng hóa chất VCD KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã sử dụng phương pháp phân tích HPLC 12 chất chuẩn phytoestrogen để phân tích phytoestrogen nguyên liệu ban đầu cao chiết trình nghiên cứu Hàm lượng phytoestrogen tổng bột phôi đậu tương giống Đ8 Việt Nam đạt 22 1771,48 ± 3,16 mg/100g CK hàm lượng acetyl-glucoside (34,56%) > β-glucoside (32,18%) > malonyl-glucoside (25,08%) > aglycone (8,18%) Đã tối ưu hóa chế độ chiết xuất phytoestrogen phương pháp đáp ứng bề mặt: thời gian chiết 90 phút, tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1/12, pH 9, nhiệt độ 30 °C, nồng độ ethanol 65% Tại chế độ chiết xuất tối ưu hàm lượng phytoestrogen tổng đạt 1671,54 ± 6,86 mg/100g CK đạt hiệu suất 95,62% Đã thu nhận cao chiết phytoestrogen aglycone tinh 3.1 Khẳng định thực nghiệm tất dạng liên hợp phytoestrogen glucoside bị thủy phân tác dụng enzyme β-glucosidase, enzyme cellulase 3.2 Chế độ thủy phân phytoestrogen glucoside tối ưu enzyme β-glucosidase từ hạnh nhân pH 5, nhiệt độ 37 oC, nồng độ enzyme: U/g bột đậu tương loại lipid, thời gian 5,5 Tại hiệu suất thủy phân dạng dạng β-glucoside, malonyl-glucoside, acetylglucoside đạt 93,42%; 63,43%; 63,35% 3.3 Chế độ thủy phân phytoestrogen glucoside tối ưu enzyme cellulase từ Trichoderma reesei C2730 (Sigma) pH 5, nhiệt độ 50 o C, nồng độ enzyme: 1,5 U/g bột đậu tương loại lipid, thời gian 5,0 Tại hiệu suất thủy phân dạng β-glucoside, malonylglucoside, acetyl-glucoside đạt 95,84%; 64,82%; 89,11% 3.4 Làm giàu aglycone enzyme cellulase từ Trichoderma reesei C2730, sản phẩm phytoestrogen aglycone tinh có hàm lượng phytoestrogen tổng 1333,68 ± 3,63 µg/100g CK với 87,1% aglycone, độ tinh 82,39% Hàm lượng aglycone tổng cao phytoestrogen aglycone tinh tăng so với hàm lượng aglycone tổng cao phytoestrogen tổng 6,67 lần, tăng so với hàm lượng aglycone tổng bột phôi đậu tương lần Hiệu suất thu hồi phytoestrogen đạt 75,3% Đã đánh giá khả chống oxy hóa cao phytoestrogen aglycone tinh > cao phytoestrogen aglycone thô > cao phytoestrogen tổng Kết xác định thông qua IC50 (theo phương pháp quét gốc tự DPPH) cao phytoestrogen aglycone, cao phytoestrogen aglycone thô, cao phytoestrogen tổng 0,763 ± 0,016 (mg/ml); 3,345 ± 0,076 (mg/ml); 6,142 ± 0,050 (mg/ml) IC50 (theo lực khử sắt) cao phytoestrogen 23 aglycone, cao phytoestrogen aglycone thô, cao phytoestrogen tổng 1,248 ± 0,024 (mg/ml); 3,961 ± 0,172 (mg/ml); 9,385 ± 0,272 (mg/ml) Đã đánh giá hoạt tính phytoestrogen cao phytoestrogen tổng cao phytoestrogen aglycone thô chuột BALB/c Kết luận mẫu cao phytoestrogen tổng cao phytoestrogen aglycone thơ với liều lượng 50 mg phytoestrogen/kg/ngày có khả cải thiện đặc tính sinh lý nữ mơ hình chuột bị gây teo buồng trứng hóa chất VCD Mẫu cao phytoestrogen tổng làm tăng nhẹ khối lượng tử cung (p < 0,001), tăng số lượng nang sơ cấp (p < 0,001), tăng hàm lượng estradiol huyết (p < 0,001) mơ hình chuột bị gây teo buồng trứng hóa chất VCD Mẫu cao phytoestrogen aglycone thô làm tăng nhẹ khối lượng tử cung (p < 0,05), tăng số lượng nang sơ cấp (p < 0,001), tăng hàm lượng estradiol huyết (p < 0,001) mơ hình chuột bị gây teo buồng trứng hóa chất VCD Kiến nghị Nghiên cứu định lượng hormone liên quan đến trình mãn kinh để làm rõ tác dụng cao chiết phytoestrogen aglycone so với dạng liên hợp, hiệu phục hồi estrogen thể mãn kinh liên quan đến rối loạn chuyển hóa, xương, bệnh tim mạch Ứng dụng cao chiết phytoestrogen aglycone tinh sản xuất sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm Cô lập aglycone để nghiên cứu sâu hoạt tính sinh học nhóm chất 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Le Minh Chau Do Thi Hoa Vien Ho Phu Ha (2020), “Study on antioxidant activity of phytoestrogen extracts from soy germ”, Vietnam Journal of Science and Technology, Vol 58, No.6A, pp 270-279 Le Minh Chau Do Thi Hoa Vien Ho Phu Ha (2021), “Optimization of phytoestrogen extraction from soy germ using respone surface methodology”, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Công nghệ Quân sự, tr 70-78 Le Minh Chau Do Thi Hoa Vien Ho Phu Ha (2022), “Hydrolysis glycoside phytoestrogens of the extract from soy germ: a comprehensive study”, Báo cáo Hội thảo khoa học Quản lý chất lượng an toàn thực phẩm QMFS 2021+1, tr 14 Vietnam Journal of Science and Technology, chấp nhận đăng Lê Minh Châu Đỗ Thi Hoa Viên Hồ Phú Hà (2022), “Nghiên cứu hoạt tính estrogen isoflavone chiết xuất từ phôi hạt đậu tương”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, tr 169178