Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata lour) và bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÀNH TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HUẾ 2017 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÀNH TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã số: 60540101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS VÕ VĂN QUỐC BẢO HUẾ 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nghiên cứu nêu Luận văn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố tài liệu khác Tác giả luận văn Nguyễn Thành Trung ii LỜI CẢM ƠN Để thực hoàn thành Luận văn với cố gắng nỗ lực thân, nhận nhiều giúp đỡ cá nhân tập thể Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học Thầy giáo TS Võ Văn Quốc Bảo tận tình hướng dẫn, dạy bảo tạo điều kiện thuận lợi tơi hồn thành tốt Luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến Q Thầy, Cơ giáo Khoa Cơ khí - Cơng nghệ, Phòng Đào tạo Sau đại học Quý Thầy, Cô Trường Đại học Nông Lâm, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế truyền đạt kiến thức lý luận thực tiễn thời gian qua Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ ủng hộ khuyến khích suốt thời gian học tập thực đề tài luận văn tốt nghiệp Trong trình thực Luận văn có sai sót mong Q Thầy, Cơ bạn đóng góp ý kiến để Luận văn hoàn thiện Huế, ngày… tháng… năm 2017 Học viên cao học Nguyễn Thành Trung iii TÓM TẮT Protease chiết xuất từ nhựa vả, chứa chủ yếu enzyme ficin; loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) Trong cơng trình này, chúng tơi nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa vả khảo sát số tính chất đặc trưng chế phẩm enzyme ficin, nhằm nâng cao giá trị sử dụng vả Thừa Thiên Huế để từ nghiên cứu bước đầu khả làm mềm thịt chế phẩm ficin Để tách enzyme có kết tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn thơng số kỹ thuật thích hợp Kết cho thấy, vả đạt độ chín thu hoạch cho hàm lượng protein hoạt độ protease cao nhất, tương ứng 2,212 (mg/ml) 1,015 (Hp/ml) tỷ lệ dịch nhựa vả/ethanol 96% 1/4 nhiệt độ chiết 3°C Thời gian thu nhận enzyme thích hợp 60 phút Chế phẩm protease hoạt động thích hợp nhiệt độ 45ºC, pH = 6, bền nhiệt từ 35ºC đến 50ºC Ngoài ra, nghiên cứu khả làm mềm thịt chế phẩm khảo sát độ dai thịt bò sau 20 phút 50,60 N tỷ lệ nước giảm 17,33% so với mẫu đối chứng 25,13% iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích luận văn Ý nghĩa khoa học thực tiển luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 1.2 TỔNG QUAN PROTEASE .5 1.2.1 Giới thiệu protease 1.2.2 Phân loại protease 1.2.3 Nguồn thu nhận protease .7 1.2.4 Sản xuất protease từ nguồn thực vật khác 1.3 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 13 1.3.1 Giới thiệu chung vả 13 1.3.2 Đặc điểm hình thái .14 1.3.3 Đặc điểm sinh học .15 1.3.4 Thành phần hóa học nhựa vả 15 1.3.5 Enzyme ficin 15 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 20 1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 20 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 21 v CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .23 2.1.1 Phạm vi nghiên cứu .23 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.3 Hóa chất .24 2.1.4 Một số thiết bị 24 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa vả 24 2.2.3 Bước đầu khảo sát khả làm mềm thịt bò 25 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Phương pháp tách chế phẩm ficin từ nhựa vả .25 2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein 27 2.3.3 Phương pháp xác định hoạt độ protease 28 2.3.4 Phương pháp vật lý 28 2.3.5 Phương pháp học 28 2.3.6 Phương pháp xác định độ mềm thịt bò 28 2.3.7 Phương pháp toán học 29 2.3.8 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT ĐỘ PROTEASE Ở BA GIAI ĐOẠN THU HOẠCH KHÁC NHAU CỦA QUẢ VẢ 32 3.2 KHẢO SÁT DUNG MÔI KẾT TỦA .33 3.3 KHẢO SÁT TỶ LỆ DỊCH NHỰA/ETHANOL 34 3.4 KHẢO SÁT THỜI GIAN KẾT TỦA PROTEASE .35 3.5 KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ KẾT TỦA PROTEASE 35 3.6 KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ 38 3.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chế phẩm ficin 38 3.6.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ chế phẩm ficin 39 3.6.3 Khảo sát độ bền nhiệt chế phẩm ficin 39 vi 3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ 40 3.7.1 Khảo sát độ dai thịt .40 3.7.2 Khảo sát tỷ lệ nước thịt 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 KẾT LUẬN 42 4.2 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBB Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue Cys – EP Cystein – proteinase N Newton ĐC Đối chứng FC Thuốc thử folin – clocalteau TCA Acid trichloroacetic Ser-EP Serin – proteinase OD Mật độ quang kD Khối lượng phân tử kilo Dalton CT1 Công thức CT2 Công thức viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hàm lượng protein hoạt độ protease theo loại dung môi .33 Bảng 3.2 Ảnh hưởng chế phẩm ficin đến độ dai thịt bò 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chế phẩm ficin đến tỷ lệ nước thịt bò 41 53 định thời gian kết tủa 60 phút, nhiệt độ kết tủa 5ºC để khảo sát tỷ lệ dịch nhựa/dung mơi Sau đó, ly tâm thu tủa, xác định hàm lượng protein hoạt độ protease Dịch nhựa Hòa nước cất (tỷ lệ 1/2, khuấy từ 100 vòng/phút, 2-3 phút) Ly tâm (4000 vòng/phút, 4oC, 10 phút) Tạp chất Kết tủa bằng(5oC, 60 phút) 1/1 1/2 1/3 1/4 Ly tâm thu tủa(10000 vòng/phút, 4oC, 10 phút) Chế phẩm protease Hình Quy trình tiến hành thí nghiệm 1/5 Dung mơi 54 1.3.4 Thí nghiệm Khảo sát thời gian kết tủa ảnh hưởng đến hàm lượng protein hoạt tính protease Với phương pháp này, tiến hành khảo sát mức thời gian 30 phút, 60 phút 90 phút Sau đó, xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn thời gian kết tủa protease từ dịch nhựa vả Dịch nhựa Hòa nước cất (tỷ lệ 1/2, khuấy từ 100 vòng/phút, 2-3 phút) Tạp chất Ly tâm (4000 vòng/phút, 4oC, 10 phút) Kết tủa dung môi (5oC, tỷ lệ 1/4) 30 phút 60 phút 90 phút Ly tâm thu tủa (10000 vòng/phút, 4oC, 10 phút) Dung mơi Chế phẩm protease Hình Quy trình tiến hành thí nghiệm Các bước tiến hành tương tự thí nghiệm thí nghiệm thực khảo sát thời gian kết tủa protein, điều kiện 5ºC, tỷ lệ dịch nhựa/dung mơi chọn thí nghiệm Sau đó, ly tâm thu tủa, xác định hàm lượng protein hoạt độ protease 55 1.3.5 Thí nghiệm Khảo sát nhiệt độ kết tủa ảnh hưởng đến hàm lượng protein hoạt độ protease Với phương pháp này, chúng tối tiến hành khảo sát mức nhiệt độ 1ºC, 3ºC 5ºC Sau đó, xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn nhiệt độ kết tủa protease từ dịch nhựa vả Dịch nhựa Hòa nước cất (tỷ lệ 1/2, khuấy từ 100 vòng/phút, 2-3 phút) Ly tâm (4000 vòng/phút, 4oC, 10 phút) Tạp chất Kết tủa dung môi (tỷ lệ 1/4, thời gian 60 phút)) 1oC 3oC 5oC Ly tâm thu tủa(10000 vòng/phút, 4oC, 10 phút) Dung mơi Chế phẩm protease Hình Quy trình tiến hành thí nghiệm Các bước tiến hành tương tự thí nghiệm 2, 4, thí nghiệm thực khảo sát nhiệt độ kết tủa protein, điều kiện thời gian tỷ lệ dịch nhựa/dung mơi chọn thí nghiệm 2, Sau đó, ly tâm thu kết tủa, xác định hàm lượng protein hoạt độ protease 56 1.3.6 Thí nghiệm Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính protease [21, [23] Chúng tiến hành khảo sát mức nhiệt độ: 35ºC, 40ºC, 45ºC, 50ºC, Chế phẩm Protein Ủ với chất casein pH = (30 phút) 35oC 40oC 45oC 50oC 55oC 60oC Ly tâm (10000 vòng/phút, 10 phút) Xác định hoạt độ Hình Quy trình tiến hành thí nghiệm * Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị ống thí nghiệm đặc nồi cách thủy cài sẵn mức nhiệt độ Ở mức nhiệt độ, chuẩn bị ống nghiệm có ống thí nghiệm ống kiểm tra, cho vào ống 0,2 ml enzyme thô Ủ mẫu nồi cách thủy mức nhiệt độ khác nhau, thời gian ủ mức nhiệt độ 30 phút để enzyme đạt mức nhiệt độ theo yêu cầu Chuẩn bị ống nghiệm khác, cho vào ống 0,2 ml chất.Sau thời gian ủ enzyme, tiến hành cho enzyme vừa ủ vào ống nghiệm chứa chất Phản ứng tiến hành nhiệt độ 30ºC thời gian 30 phút kết thúc phản ứng acid trichloroacetic (CCl3COOH) Để ổn định 25 phút, tiến hành ly tâm lấy dịch trong, làm phản ứng màu, xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano 57 1.3.7 Thí nghiệm Phương pháp tiến hành khảo sát pH thích hợp cho hoạt độ protease [21], [23] Chế phẩm protein pH dung dịch đệm Bổ sung chất Casein Bổ sung Trichloroacetic Ly tâm (1000 vòng/phút, 4oC, 10 phút) Xác định hoạt độ Hình Quy trình tiến hành thí nghiệm7 * Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị dung dịch đệm với pH khác mức giá trị pH = 5, 6, 7, Sau đó, hịa tan tủa thu dung dịch đệm có pH khác theo tỷ lệ 1/1 Chuẩn bị ống nghiệm sạch, cho vào ống nghiệm 0,2 ml enzyme với mức pH khác Thêm 0,2 ml chất (ở sử dụng chất casein), phản ứng tiến hành nhiệt độ 30ºC khoảng thời gian 30 phút Kết thúc phản ứng acid tricloacetic, phản ứng thời gian 30 phút Ly tâm lấy dịch trong, làm phản ứng màu xác định hoạt độ theo phương pháp Amano 58 1.3.8 Thí nghiệm Phương pháp tiến hành khảo sát độ bền nhiệt độ enzyme protease [11] Với phương pháp này, tiến hành ủ mức nhiệt độ từ 35ºC đến 60oC giờ, đo hoạt độ enzyme mốc nhiệt độ Chế phẩm protease thô Ủ 35oC 40oC 50oC 60oC 55oC Bổ sung chất Casein Bổ sung Trichloroacetic (TCA) Ly tâm (1000 vịng/phút, 4oC, 10 phút) Xác định hoạt độ Hình Quy trình tiến hành thí nghiệm * Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị ống nghiệm chứa 0,2 ml enzyme thô, ủ mốc nhiệt độ từ 30ºC đến 55ºC thời gian Sau đó, bổ sung 0,2 ml chất casein vào tiến hành phản ứng thủy phân nhiệt độ khoảng thời gian 30 phút Phản ứng protease chất kết thúc dung dịch acid trichloroacetic Xác định hoạt độ enzyme khoảng nhiệt độ để xác định độ bền nhiệt enzyme protease 59 1.3.9 Thí nghiệm Khảo sát khả làm mềm thịt bò chế phẩm enzyme theo khoảng thời gian ướp khác Chế phẩm enzyme Thịt bò phút 10 phút phút 15 phút Đo màu sắc thịt 20 phút Đo độ dai Chần nước nóng 90ºC, phút Đo màu sắc thịt Đo độ dai Hình Quy trình tiến hành thí nghiệm Thuyết minh quy trình Thịt từ lị mổ lấy ba miếng thịt ba bò khác Vị trí lấy thịt: lấy từ xương thứ 13 trở sau cắt vng góc phần sống lưng trở xuống, mục đích để lấy phần thịt thăn (hay gọi phần lết phần thịt phô bị) chiều dài khoảng 7-8 cm Đưa để ngồi khoảng 2-3 cho nguội thịt sau ta cắt 2x5x1(cm) (rộng, dài, dày) bỏ vào tủ lạnh khoảng 15 phút (phơi khơng khí tủ lạnh đậy 60 lớp nilong thịt không để thịt tiếp xúc trực tiếp với khơng khí tủ làm lượng nước có thịt) để thịt đồng màu sắc thịt có hai chất protein hemoglobin protein myoglobin ảnh hưởng đến màu sắc thịt để ngồi lâu hai chất dễ bị oxy hóa làm thay đổi màu sắc thịt Sau cân miếng thịt đo màu sắc L*a*b trước chế biến sau ướp enzym q trình ướp lật miếng thịt để thịt thấm hơn, bỏ vào tủ lạnh phút lấy ra, tiến hành đo màu sắc thịt, cắt máy cắt WBS-1(đơn vị N) với tốc độ lưỡi dao 300mm (đo độ dai), sau bỏ vào túi nilong chịu nhiệt đưa vào máy wattbat (máy luộc) 95 oC ± 0,1oC vòng phút → đưa làm mát từ từ vòi nước chảy phút (mục đích làm nguội thịt)→ cân → bỏ vào hộp cất tủ lạnh (phần cắt nhỏ ta loại bỏ phần chưa cắt ta cho vào hộp) → đo độ dai Tiếp tục ta làm tương tự 10 phút, 15 phút, 20 phút Còn mẫu đối chứng ta cân mẫu đo màu sắc mẫu, đo độ dai sau bảo quản tủ lạnh đưa đo độ dai 61 PHỤ LỤC 2.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ALBUMIN VÀ TYROSIN Trong nghiên cứu này, để xác định hàm lượng protein hoạt độ protease, tiến hành xác định đường chuẩn albumin tyrosin 2.1.1 Đường chuẩn albumin Quá trình tiến hành chuẩn bị nồng độ albumin tiến hành theo phương pháp Bradfor Kết OD nồng độ albumin khác thể hình 10 0,60 y = 0,5594x + 0,1144 R² = 0,997 0,50 0,40 OD 0,30 0,20 0,10 0,00 0,2 0,4 0,6 0,8 mg/ml(mg/ml) Nồng độ Albumin Hình 10 Đồ thị đường chuẩn albumin Phương trình đường chuẩn: y = 0,5594x + 0,1144, với hệ số R2 = 0,992 Trong đó: y : mật độ quang (OD) x : nồng độ albumin (mg/ml) 2.1.2 Đường chuẩn tyrosin Quá trình tiến hành chuẩn bị nồng độ tyrosin tiến hành theo phương pháp Amano Kết OD nồng độ tyrosin khác thể hình 11 62 1,20 y = 0,0144x- 0,025 R² = 0,9901 1,00 0,80 OD 0,60 0,40 0,20 0,00 10 20 30 40 50 60 70 Nồng độ tyrosin (µg/ml) Hình 11 Đồ thị đường chuẩn tyrosin Phương trình đường chuẩn: y = 0,0144x – 0,025; với hệ số R2 = 0,9901 Trong y : mật độ quang (OD) x : nồng độ tyrosin (µg/ml) 80 63 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH TRONG Q TRÌNH NGHIÊN CỨU Hình 12 Trái vả non Hình 13 Trái vả thu hoạch Hình 15 Nhựa vả Hình 14 Trái vả già Hình 16 Khuấy bắng máy khuấy từ 64 Hình 17 Dịch nhựa trước ly tâm Hình 19 Ly tâm làm dịch nhựa Hình 18 Dịch nhựa sau ly tâm Hình 20 Dịch nhựa sau kết tủa 65 Hình 21 Kết tủa ethanol Hình 22 Kết tủa aceton Hình 23 Khảo sát kết tủa protein trái non Hình 24 Khảo sát kết tủa protein trái thu hoạch Hình 25 Khảo sát protein trái già Hình 26 Khảo sát thời gian kết tủa 66 Hình 27 Điều chỉnh pH cho dung dịch đệm Hình 28 Khảo sát hoạt động theo thời gian Hình 30 Khảo sát nhiệt độ thích hợp Hình 29 Khảo sát hàm lượng protein theo thời gian Hình 31 Khảo sát độ bền nhiệt protease 67 Hình 32 Lấy mẫu Hình 33 Ướp enzyme ficin Hình 34 Làm khơ thịt Hình 35 Cân thịt ... THÀNH TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên... nhiên Từ ý nghĩa thực tiễn trên, chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa vả (ficus auriculata Lour) bước đầu khảo sát khả làm mềm thịt bò" để thực nhằm tạo sở cho nghiên cứu sau... 24 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa vả 24 2.2.3 Bước đầu khảo sát khả làm mềm thịt bò 25 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25