Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm mốc trichoderma longibrachiatum h18 và bước đầu khảo sát khả năng bóc vỏ tiêu

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hiền Trang Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Oanh Kiều ii LỜI CÁM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hiền Trang định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn, biên tập báo tạo điều kiện hóa chất, thiết bị kinh phí để tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn Phòng Sau Đào tạo, Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Huế tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành thủ tục cần thiết q trình làm nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ nhiệm Khoa, thầy cô giáo, sinh viên nghiên cứu khoa học khoa Cơ khí - Cơng nghệ, trường Đại học Nông Lâm Huế quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực đề tài luận văn Cuối xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện động viên suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Nguyễn Thị Oanh Kiều iii TÓM TẮT Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm nấm mốc Trichoderma longibrachiatum H18 môi trường bán rắn cám - trấu, sở ứng dụng chế phẩm xử lý vỏ tiêu đen tiêu chín đánh giá chất lượng sản phẩm tiêu sọ sau trình chế biến Kết cho thấy điều kiện thích hợp để chủng T longibrachiatum H18 sinh tổng hợp cellulase sinh khối cao môi trường lỏng nồng độ chất CMC: 1% nồng độ NaNO3: 0,4% nhiệt độ 28oC, pH ban đầu 5,5 sau 144 nuôi cấy Bổ sung 0,3% tỷ lệ sinh khối vào môi trường bán rắn cám - trấu với tỷ lệ cám : trấu : 3, nuôi cấy với điều kiện độ ẩm môi trường cám trấu 55% ngày tạo chế phẩm T longibrachiatum H18 với hoạt độ cellulase cao 5909,7 IU/g Kết phân tích chất lượng chế phẩm T longibrachiatum H18 khơng có độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2 cho thấy chế phẩm an toàn ứng dụng vào sản xuất tiêu sọ Chế phẩm T longibrachiatum H18 ủ với tiêu đen tiêu chín ngun liệu có tác dụng đáng kể đến khả bóc vỏ q trình sản xuất tiêu sọ so với phương pháp truyền thống (ngâm nước) Hiệu suất bóc vỏ tiêu đen chế phẩm T longibrachiatum H18 cao đạt gần 99% sau ngày xử lý, với độ ẩm nguyên liệu tiêu đen ban đầu 45%, nhiệt độ ủ 28oC hàm lượng chế phẩm bổ sung 2% So với quy trình bóc vỏ tiêu theo phương pháp truyền thống, sử dụng chế phẩm T longibrachiatum H18 hàm lượng 2% rút ngắn thời gian ủ từ ngày xuống ngày Hiệu suất bóc vỏ tiêu chín gần 100% sau 36 xử lý với tỷ lệ chế phẩm thêm vào 2% Sản phẩm tiêu sọ từ tiêu đen tiêu chín xử lý chế phẩm T longibrachiatum H18 đạt chất lượng theo quy định TCVN 7037:2002 với giá trị hàm lượng tro tương ứng: 2,55% 2,65%; hàm lượng piperin: 8,50% 8,70%; hàm lượng tinh dầu: 1,86% 1,92%, ngồi khơng thấy diện tổng số vi khuẩn hiếu khí (TSVKHK), E coli, Coliforms Samonella sản phẩm tiêu sọ iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CÁM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC Trichoderma longibrachiatum 1.1.1 Tổng quan Trichoderma 1.1.2 Tổng quan Trichoderma longibrachiatum .7 1.2 TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Nguồn gốc 1.2.3 Cơ chế tác động 10 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase 10 1.2.5 Ứng dụng cellulase .13 1.3 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BỀ MẶT VỚI MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN 15 1.3.1 Khái niệm, ưu nhược điểm phương pháp nuôi cấy bề mặt 15 1.3.2 Nguyên liệu sử dụng 15 1.3.3 Kỹ thuật nuôi cấy .17 1.4 TỔNG QUAN VỀ TIÊU 17 1.4.1 Giới thiệu hồ tiêu 17 1.4.2 Tổng quan hạt tiêu 18 v 1.4.3 Tình hình sản xuất hồ tiêu nước giới .19 1.4.4 Các sản phẩm tiêu thị trường .21 1.4.5 Quá trình sản xuất tiêu sọ Việt Nam 23 1.4.6 Chỉ tiêu chất lượng tiêu sọ 24 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .25 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 25 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam .27 Chương ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU .29 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu .29 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 29 2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát khả bóc vỏ hạt tiêu đen tiêu chín chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 31 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.3.1 Phương pháp vi sinh 32 2.3.2 Phương pháp vật lý 35 2.3.3 Phương pháp hóa lý .35 2.3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 38 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 45 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM Trichoderma longibrachiatum H18 46 3.1.1 Kết khảo sát điều kiện thích hợp đến khả sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp cellulase Trichoderma longibrachiatum H18 môi trường lỏng .46 3.1.2 Kết khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma longibrachiatum H18 môi trường bán rắn (cám - trấu) 55 vi 3.1.3 Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 phân tích chất lượng chế phẩm trình bảo quản 62 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BĨC VỎ TIÊU ĐEN VÀ TIÊU CHÍN CỦA CHẾ PHẨM Trichoderma longibrachiatum H18 68 3.2.1 Kết khảo sát khả bóc vỏ tiêu đen chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 68 3.2.2 Kết khảo sát khả bóc vỏ tiêu chín chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 .78 3.2.3 Phân tích số tiêu chất lượng sản phẩm tiêu sọ 82 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 85 4.1 KẾT LUẬN 85 4.2 ĐỀ NGHỊ 86 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA A niger A oryzae A flavus A fumigatus A tereus B subtilis CFU CMC CMCase Cs DNS G HđCellulase H avenae IPC IU Ml µl Nm Mg MPN OD P brasilianum P palmivora PGA PDA T hamatum T harzianum T koningii T longibrachiatum T virens T reesei T viridae UV Analysis of Variance Aspergillus niger Aspergillus oryzae Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus tereus Bacillus subtilis Colony-forming unit Carboxylmethyl cellulose Carboxylmethyl cellulase cộng acid dinitro salixylic gam Hoạt độ cellulase Heterodera avenae International Pepper Community International Unit mililit microlit nanomet miligam Most Probable Number Optical Density Penicillium brasilianum Penicillium palmivora Potato Glucose Agar Potato Dextrose Agar Trichoderma hamatum Trichoderma harzianum Trichoderma koningii Trichoderma longibrachiatum Trichoderma virens Trichoderma reesei Trichoderma viridae Ultra Violet viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học trung bình cám 16 Bảng 1.2 Các tiêu vật lý hạt tiêu sọ 24 Bảng 1.3 Các tiêu hóa học hạt tiêu sọ 24 Bảng 2.1 Tỷ lệ (% tổng khối lượng) kí hiệu thành phần cám - trấu mơi trường nuôi cấy 34 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến chất lượng chế phẩm T longibrachiatum H18 61 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian sấy đến chất lượng chế phẩm T longibrachiatum H18 61 Bảng 3.3 Kết kiểm tra độc tố aflatoxin mẫu chế phẩm sau bảo quản 67 Bảng 3.4 Hoạt độ cellulase chế phẩm T longibrachiatum H18 sau thời gian bảo quản 68 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến hàm lượng piperin độ ẩm tiêu sọ 75 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian sấy đến hàm lượng piperin độ ẩm tiêu sọ 76 Bảng 3.7 Chất lượng sản phẩm tiêu sọ 83 ix DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các chủng nấm nhánh Longibrachiatum thuộc chi Trichoderma phát triển môi trường PDA .4 Hình 1.2 Vai trị Trichoderma Hình 1.3 Khuẩn ty nấm T longibrachiatum sau ngày nuôi cấy (a) sau ngày nuôi cấy (b) Error! Bookmark not defined Hình 1.4 Mơ hình cellulase Hình 1.5 Cơ chế tác động cellulase .10 Hình 1.6 Cám (a) trấu (b) 17 Hình 1.7 Cây hồ tiêu chùm tiêu 18 Hình 1.8 Tiêu chín, tiêu xanh, tiêu trắng, tiêu đen (từ trái sang phải) 19 Hình 1.9 Khối lượng giá trị xuất tiêu trắng tháng đầu năm 2014 - 2016 20 Hình 1.10 Các nước nhập tiêu trắng Việt Nam lớn tháng 2/2016 .20 Hình 1.11 Dầu tiêu .21 Hình 1.12 Oleoresin tiêu .21 Hình 1.13 Tiêu bột 21 Hình 1.14 Tiêu xanh ngâm nước muối 22 Hình 1.15 Tiêu xanh đông khô .22 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng điều kiện thích hợp đến khả sinh tổng hợp cellulase sinh trưởng, phát triển T longibrachiatum H18 39 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đên khả sinh tổng hợp cellulase chế phẩm T longibrachiatum H18 môi trường bán rắn (cám - trấu) 40 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả bóc vỏ tiêu đen chế phẩm T longibrachiatum H18 42 Hình 2.4 Tiêu đen nguyên liệu (a), tiêu đen bổ sung chế phẩm (b), ủ lên men bóc vỏ tiêu (c) 43 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả bóc vỏ tiêu chín chế phẩm T longibrachiatum H18 44 x Hình 2.6 Tiêu chín ngun liệu (a), tiêu chín trước bổ sung chế phẩm (b), tiêu chín bổ sung chế phẩm (c) .45 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp cellulase sinh trưởng, phát triển T longibrachiatum H18 .47 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ NaNO3 đến khả sinh tổng hợp cellulase sinh trưởng phát triển T longibrachiatum H18 48 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase sinh trưởng, phát triển T longibrachiatum H18 .50 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase sinh trưởng, phát triển T longibrachiatum H18 .52 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase sinh trưởng, phát triển T longibrachiatum H18 54 Hình 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn nguyên liệu (cám - trấu) đến khả sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 56 Hình 3.7 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu chất đến khả sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 57 Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ nấm mốc đến khả sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 58 Hình 3.9 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 60 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm T longibrachiatum H18 sinh cellulase cao môi trường bán rắn (cám - trấu) 63 Hình 3.11 Chế phẩm T longibrachiatum H18 sau ngày (a), ngày (b) sau sấy nghiền (c) 64 Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 65 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm ban đầu chưa bảo quản 66 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm sau bảo quản tháng 4oC 66 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm bảo quản sau tháng 4oC 67 Hình 3.16 Độ ẩm hạt tiêu tương thích với thời gian ngâm 69 Hình 3.17 Ảnh hưởng độ ẩm nguyên liệu đến tỷ lệ bóc vỏ tiêu đen chế phẩm T longibrachiatum H18 70 Hình 3.18 Ảnh hưởng tỷ lệ chế phẩm T longibrachiatum H18 đến tỷ lệ bóc vỏ tiêu đen 71 104 One-way ANOVA: hđ cellulase versus tg sấy Source DF SS MS F P tg sấy 264055 88018 15.09 0.001 Error 46673 5834 Total 11 310728 Level N Mean StDev + -+ -+ -+ 5147.0 66.7 ( * -) 5036.2 113.2 ( * -) 4921.7 57.6 ( * -) 4746.0 52.4 Grouping Information Using Tukey Method tg sấy N Mean Grouping 5147.02 A 5036.19 A B 4921.67 B C 4746.00 C One-way ANOVA: mđ tế bào versus tg sấy Source tg sấy Error Total Level DF SS MS F P 0.17582 0.05861 11.78 0.003 0.03980 0.00498 11 0.21562 N Mean StDev + -+ -+ -+ 4.3900 0.0529 ( * -) 4.2933 0.0493 ( -* -) 4.1433 0.0902 ( -* -) 4.0833 0.0808 ( -* -) Grouping Information Using Tukey Method tg sấy N 3 3 Mean 4.39000 4.29333 4.14333 4.08333 Grouping A A B B C C One-way ANOVA: độ ẩm versus tg sấy Source tg sấy Error Total Level DF SS MS F P 56.217 18.739 53.67 0.000 2.793 0.349 11 59.010 N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -3 14.000 0.424 ( -* -) 11.700 0.319 ( -* ) 9.067 0.404 ( -* -) 8.633 0.416 ( -* -) Grouping Information Using Tukey Method tg 105 sấy N 3 Mean Grouping 14.0000 A 11.7000 B 9.0667 C 8.6333 C Phần xử lý số liệu phân tích phương sai khảo sát khả bóc vỏ tiêu đen chế phẩm T longibrachiatum H18 One-way ANOVA: độ ẩm tiêu versus tg ngâm Source DF SS MS F P tg ngâm 12 8171.59 680.97 556.18 0.000 Error 26 31.83 1.22 Total 38 8203.42 Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -0 11.500 0.500 (*) 39.000 1.000 (*) 42.000 1.000 (*) 3 45.333 1.528 (*) 49.667 1.528 (*) 52.000 1.000 (*) 55.333 0.577 (*) 58.000 1.000 (*) 61.667 1.528 (*) 64.333 0.577 (*) 10 64.333 1.528 (*) 11 64.667 0.577 (*) 12 64.667 1.155 tg ngâm N Mean Grouping 12 64.667 A 11 64.667 A 10 64.333 A 64.333 A 61.667 A 58.000 B 55.333 B 52.000 C 49.667 C 3 45.333 D 42.000 E 39.000 E One-way ANOVA: tỷ lệ bóc versus độ ẩm tiêu Source DF SS MS F P độ ẩm tiêu 454.6541 113.6635 12825.50 0.000 Error 10 0.0886 0.0089 Total 14 454.7427 Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -35 82.6658 0.0860 *) 40 92.2624 0.1525 (* 45 98.7925 0.0412 (* 50 90.5167 0.0304 * 55 86.1151 0.1050 * 106 -+ -+ -+ -+ -Grouping Information Using Tukey Method độ ẩm tiêu N Mean Grouping 45 98.7925 A 40 92.2624 B 50 90.5167 C 55 86.1151 D 35 82.6658 E One-way ANOVA: tỷ lệ bóc versus tỷ lệ cp Source DF SS MS F P tỷ lệ cp 5094.100 1698.033 2485.21 0.000 Error 5.466 0.683 Total 11 5099.567 Level N Mean StDev + -+ -+ -+ 90.162 0.319 (*) 98.699 0.037 (*) 3 91.552 0.153 (*) dc 46.481 1.615 Grouping Information Using Tukey Method tỷ lệ cp N Mean Grouping 98.699 A 3 91.552 B 90.162 B dc 46.481 C One-way ANOVA: tỷ lệ bóc versus nhiệt độ Source DF SS MS F P nhiệt độ 1973.000 328.833 589.29 0.000 Error 14 7.812 0.558 Total 20 1980.812 Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -24 77.414 0.118 (*) 26 89.642 0.583 (*) 28 98.555 0.104 (*) 30 95.209 0.340 (*) 32 92.200 0.366 (*) 34 83.133 0.283 (*) 36 69.173 1.792 nhiệt độ N Mean Grouping 28 98.555 A 30 95.209 B 32 92.200 C 26 89.642 D 34 83.133 E 24 77.414 F 36 69.173 G One-way ANOVA: tỷ lệ bóc versus tgian ủ Source tgian ủ DF SS 10555.86 MS 2638.97 F 3291.33 P 0.000 107 Error 10 8.02 0.80 Total 14 10563.88 Level N Mean StDev + -+ -+ -+ 33.997 0.624 (*) 46.334 1.092 *) 3 65.057 1.554 (* 98.636 0.059 *) 98.780 0.105 *) Grouping Information Using Tukey Method tgian ủ N Mean Grouping 98.780 A 98.636 A 3 65.057 B 46.334 C 33.997 D One-way ANOVA: Tỷ lệ bóc versus tgian ủ tt Source DF SS MS F P tgian ủ tt 19813.36 2830.48 13549.30 0.000 Error 16 3.34 0.21 Total 23 19816.71 Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ 23.290 0.354 (* 32.501 0.324 *) 3 35.072 0.562 (* 36.371 0.347 * 50.237 0.726 * 83.283 0.644 (* 97.107 0.200 (* 97.207 0.145 Grouping Information Using Tukey Method tgian ủ tt N 3 3 3 3 Mean 97.207 97.107 83.283 50.237 36.371 35.072 32.501 23.290 Grouping A A B C D E F G One-way ANOVA: HL PP versus nhiệt độ Source DF SS MS F P nhiệt độ 0.7756 0.3878 38.78 0.000 Error 0.0600 0.0100 Total 0.8356 Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+-50 8.6333 0.0577 ( * -) 55 8.5333 0.0577 ( * -) 60 7.9667 0.1528 Grouping Information Using Tukey Method 108 nhiệt độ N Mean Grouping 50 8.6333 A 55 8.5333 A 60 7.9667 B One-way ANOVA: độ ẩm versus thời gian sấy tiêu Source DF SS MS F P thời gian sấy tiêu 30.000 10.000 30.00 0.000 Error 2.667 0.333 Total 11 32.667 Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -16 13.667 0.377 ( * ) 17 12.667 0.377 ( * -) 18 10.667 0.377 ( * ) 19 9.667 0.377 thời gian sấy tiêu N Mean Grouping 16 13.6667 A 17 12.6667 A 18 10.6667 B 19 9.6667 B One-way ANOVA: HL ppin versus thời gian sấy tiêu Source thời gian Error Total Level N 16 17 18 19 DF SS MS F P 0.16667 0.05556 11.11 0.003 0.04000 0.00500 11 0.20667 Mean StDev + -+ -+ -+ 8.4667 0.0377 ( -* ) 8.4333 0.0577 ( -* -) 8.4000 0.1000 ( -* -) 8.1667 0.0577 ( -* ) + -+ -+ -+ Grouping Information Using Tukey Method thời gian sấy tiêu 16 17 18 19 sấy tiêu N 3 Mean Grouping 8.46667 A 8.43333 A 8.40000 A 8.16667 B Phần xử lý số liệu phân tích phương sai khảo sát khả bóc vỏ tiêu chín chế phẩm T longibrachiatum H18 One-way ANOVA: tL bóc versus thời gian Source thời gian Error Total DF 11 SS 150.250 4.667 154.917 MS 50.083 0.583 F 85.86 P 0.000 109 Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -12 90.667 0.577 ( * -) 24 96.333 1.155 ( * -) 36 99.333 0.577 ( * -) 48 99.333 0.577 ( * -) Grouping Information Using Tukey Method thời gian N Mean Grouping 48 99.333 A 36 99.333 A 24 96.333 B 12 90.667 C One-way ANOVA: tỷ lệ bóc dc versus thời gian Source DF SS MS F P thời gian 505.67 168.56 29.75 0.000 Error 45.33 5.67 Total 11 551.00 Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+-12 77.000 2.000 ( * -) 24 84.333 4.041 ( -* ) 36 90.667 1.155 ( * ) 48 94.000 1.000 ( -* ) Grouping Information Using Tukey Method thời gian N Mean Grouping 48 94.000 A 36 90.667 A 24 84.333 B 12 77.000 C One-way ANOVA: tl bóc tiêu chín versus tỷ lệ cp Source tỷ lệ cp Error Total DF 11 SS 154.917 6.000 160.917 MS 51.639 0.750 F 68.85 P 0.000 Level N Mean StDev + -+ -+ -+ 95.000 1.000 ( -* -) 99.333 0.577 ( -* -) 3 99.333 0.577 ( -* -) dc 90.667 1.155 Grouping Information Using Tukey Method tỷ lệ cp dc N 3 3 Mean 99.333 99.333 95.000 90.667 Grouping A A B C 110 Phụ lục 2: Quy trình phân tích tiêu vi sinh vật tiêu sọ thành phẩm Quy trình 1: Xác định vi khuẩn hiếu khí Mẫu – pha lỗng mẫu có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3… Chọn nồng độ thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa peptri vơ trùng Đổ 10 – 15ml môi trường PCA vào đĩa petri cấy mẫu Nuôi nhiệt độ 37oC, 72h Đếm tính kết (CFU/g CFU/ml) 111 Quy trình 2: Xác định Coliforms Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3 Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 37oC, 48 Ghi nhận ống LSB (+) (sinh hơi) nồng độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL, ủ 37oC, 48 Số ống (+) (sinh hơi) độ pha loãng Coliforms tổng số Cấy vào ống canh EC, ủ 44,5oC ± 0,2oC 24 Số ống (+) độ pha loãng Coliforms chịu nhiệt 112 Quy trình 3: Xác định vi khuẩn E.coli Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha loãng 101 , 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3…vào ống 10ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 370C, 48 Ghi nhận ống LSB (+) (sinh hơi) nồng độ pha loãng Cấy vào ống canh EC, ủ 44,50C ± 0,2oC 24 Cấy ria lên thạch EMB, ủ 37oC 24 Chọn khuẩn lạc (trịn, dẹt hình đĩa có ánh kim xanh) Thử nghiệm IMViC E.coli (tính kết cách tra bảng MPN) 113 Quy trình 4: Xác định tiêu Samonella Đồng 25ml tiêu mẫu 225 ml canh lactose broth ủ 37oC 48-92 h Môi trường có mùi váng bề mặt Chuyển ml môi trường vào hỗn hợp 10 ml Selenite Cystine Broth Tetrathionat Broth ủ 37oC 24 h Cấy ria vào môi trường thạch Bismuth Sulfite Agar Brillant Green Agar ủ 37oC 24 h Chọn khuẩn lạc màu trắng không màu Chọn khuẩn lạc màu đen xám Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường thạch nghiêng TSI, ủ 37oC 24 h Mơi trường TSI có phần nghiêng màu đỏ, phần đứng màu vàng, có màu đen bề mặt 114 Phụ lục 3: Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm T longibrachiatum H18 ❖ Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng điều kiện thích hợp đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 môi trường lỏng - Ảnh hưởng nồng độ chất CMC Chủng T longibrachiatum H18 nuôi cấy môi trường Czapek - dox Thành phần CMC môi trường nuôi cấy thay đổi theo nồng độ 0,5%; 1%; 1,5%; 2% 2,5% Tại nồng độ, tiến hành nuôi cấy, lọc thu dịch enzyme thô xác định hoạt tính enzyme phương pháp so màu với thuốc thử DNS, đồng thời đem cân để xác định khối lượng sinh khối nấm mốc tạo thành - Ảnh hưởng nồng độ chất NaNO3 Chủng T longibrachiatum H18 nuôi cấy môi trường Czapek – dox với thành phần CMC tối ưu xác định thí nghiệm Thay đổi thành phần NaNO3 môi trường nuôi cấy theo tỷ lệ 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% 0,5% Tại nồng độ NaNO3 tiến hành nuôi cấy, lọc thu dịch enzyme thô xác định hoạt tính cellulase, đồng thời đem cân xác định khối lượng sinh khối nấm mốc tạo thành - Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Tiến hành khảo sát biến thiên khả sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 theo thời gian khoảng thời gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ,… 168 (cách 12 giờ); môi trường pH = 5,5; nhiệt độ 28 ± 1oC môi trường Czapek – dox tối ưu nghiên cứu Thu dịch enzyme thô xác định hoạt độ cellulase, đồng thời cân để xác định khối lượng sinh khối nấm mốc tạo thành khoảng thời gian khảo sát - Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Chuẩn bị môi trường sinh tổng hợp cellulase với thành phần CMC, NaNO3 tối ưu nghiên cứu để nuôi cấy chủng vi nấm Tiến hành nuôi cấy pH = 5,5 nhiệt độ 24oC, 26oC, 28oC, 30oC, 32oC, 34oC 36oC Thời gian nuôi cấy thời gian tối ưu xác định Tại nhiệt độ tiến hành lọc thu dịch enzyme thơ xác định hoạt tính enzyme phương pháp so màu với thuốc thử DNS, đồng thời đem cân để xác định khối lượng sinh khối nấm mốc tạo thành - Khảo sát ảnh hưởng pH nuôi cấy Chủng T longibrachiatum H18 nuôi cấy mơi trường có pH thay đổi tương ứng 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6,5 Tiến hành nuôi cấy nhiệt độ tối ưu thời gian ni cấy thích hợp xác định Tại giá trị pH, tiến hành lọc thu dịch enzyme 115 thơ xác định hoạt tính enzyme phương pháp so màu với thuốc thử DNS, đồng thời đem cân để xác định khối lượng sinh khối nấm mốc tạo thành ❖ Bố trí thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng thông số kỹ thuật đến khả sinh tổng hợp cellulase chế phẩm T longibrachiatum H18 môi trường bán rắn (cám - trấu) - Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm chất ban đầu đến trình sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 Tạo môi trường bán rắn gồm cám - trấu theo tỉ lệ thích hợp Tiệt trùng môi trường điều chỉnh độ ẩm với giá trị: 40, 45, 50, 55 60% Bổ sung 0,2% khối lượng nấm mốc T longibrachiatum H18 so với khối lượng môi trường nuôi cấy khay nhiệt độ phòng vòng ngày Thu mẫu sấy 40oC 5h, làm nguội bình hút ẩm, bao gói bảo quản lạnh đến xác định hoạt độ cellulase chế phẩm theo phương pháp Jeffries (1996) để chọn độ ẩm thích hợp (Miller, 1959; Nguyễn Hiền Trang cs, 2013) - Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nấm mốc đến trình sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 Tạo môi trường bán rắn với tỉ lệ chất độ ẩm chọn Bổ sung sinh khối T longibrachiatum H18 với tỉ lệ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 0,5 % khối lượng nuôi cấy khay nhiệt độ phòng vòng ngày Thu mẫu sấy 40oC 5h, làm nguội bình hút ẩm, bao gói bảo quản lạnh đến xác định hoạt độ cellulase chế phẩm theo phương pháp Jeffries (1996) để chọn tỉ lệ giống cấy thích hợp (Miller, 1959; Nguyễn Hiền Trang cs, 2013) - Khảo sát ảnh hưởng thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp cellulase T longibrachiatum H18 Tạo môi trường bán rắn với thông số tỉ lệ chất, độ ẩm chọn Cấy nấm mốc T longibrachiatum H18 với tỉ lệ thích hợp chọn nuôi cấy khay nhiệt độ phòng Tiến hành lấy mẫu sau ngày, ngày, ngày, ngày ngày, sấy 40oC 5h, làm nguội bình hút ẩm, bao gói bảo quản lạnh đến xác định hoạt độ cellulase chế phẩm theo phương pháp Jeffries (1996) để chọn thời gian ni cấy thích hợp (Miller, 1959; Nguyễn Hiền Trang cs, 2013) - Khảo sát chế độ sấy ảnh hưởng đến chất lượng chế phẩm T longibrachiatum H18 Chế phẩm sau thu tiến hành nghiền nhỏ, tiến hành lấy mẫu để xác định độ ẩm, hoạt độ cellulase mật độ tế bào ban đầu trước đem sấy mức nhiệt độ 35oC, 40oC, 45oC 50oC để đạt độ ẩm yêu cầu (