nghiên cứu sản xuất chế phẩm kháng nấm corynespora cassiicola từ vi khuẩn bacillus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM KHÁNG NẤM Corynespora cassiicola TỪ VI KHUẨN Bacillus Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thành Trung Đỗ Thị Thu Hà Lại Thị Tâm Phan Thị Hoài Thương Lê Sanh Nhiều Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Văn Minh Ngành học: Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, 2014 Trang i ĐẶT VẤN ĐỀ HƢƠNG 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ CÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS MUELL ARG 1.1.1 Phân loại học 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Đặc điểm thực vật học 1.1.4 Vai trị tình hình sản xuất 1.1.5 Tình hình bệnh hại cao su 1.1.6 Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học cho cao su 1.2 BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA TRÊN CÂY CAO SU 1.2.1 Phân bố 1.2.2 Triệu chứng bệnh cao su 1.2.3 Tác hại bệnh rụng Corynespora cao su 10 1.2.4 Cách phòng trị 12 1.3 NẤM Corynespora cassiicola 13 1.3.1 Lịch sử phát nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) wei 13 1.3.2 Phân loại học 13 1.3.3 Đặc điểm hình thái 13 1.3.4 Đặc điểm sinh lý 14 1.3.5 Khả tồn 15 1.3.6 Khả phát tán 15 1.3.7 Con đƣờng xâm nhập khả gây bệnh nấm Corynespora cassiicola 16 1.4 TỔNG QUAN VỀ Bacillus 16 1.4.1 Phân loại 16 Trang ii 1.4.2 Hình dạng, kích thƣớc 18 1.4.3 Dinh dƣỡng tăng trƣởng 19 1.4.4 Ứng dụng Bacillus 21 1.4.5 Chất chuyển hóa kháng nấm Bacillus 22 1.5 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 24 1.5.1 Định nghĩa quy hoạch thực nghiệm 24 1.5.2 Ƣu điểm quy hoạch thực nghiệm 24 1.5.3 Đối tƣợng quy hoạch thực nghiệm 25 1.5.4 Thí nghiệm sàng lọc 27 1.5.5 Tối ƣu hóa 29 1.5.6 Phần mềm quy hoạch thực nghiệm Minitab 16 35 HƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 37 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 38 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 38 2.2.2 Cây cao su dùng để thử nghiệm 38 2.2.3 Chủng nấm Corynespora cassiicola thử nghiệm 38 2.2.4 Môi trƣờng - hóa chất 38 2.2.5 Thiết bị - dụng cụ 39 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.3.1 Tái phân lập Bacillus 39 2.3.2 Xác định hoạt tính chất kháng nấm chủng Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch 41 2.3.3 Xây dựng đƣờng tƣơng quan giá trị OD610 mật độ tế bào 42 2.3.4 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 44 Trang iii 2.3.5 Chọn lựa yếu tố ảnh hƣởng tới hoạt tính chất kháng nấm chủng Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 46 2.3.6 Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hƣởng đến q trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett – Burman 48 2.3.7 Thí nghiệm khởi đầu 49 2.3.8 Tìm khoảng tối ƣu cho trình lên men phƣơng pháp leo dốc 50 2.3.9 Thí nghiệm bề mặt tiêu xác định giá trị tối ƣu yếu tố 52 HƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP 55 3.2 KẾT QUẢ THỬ KHẢ NĂNG KHÁNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH 56 3.3 KẾT QUẢ TỐI ƢU HÓA MÔI TRƢỜNG CHO Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 58 3.3.1 Kết xây dựng đƣờng tƣơng quan giá trị OD610 mật độ tế bào 58 3.3.2 Kết xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng đƣờng kính vịng kháng nấm vi khuẩn Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 60 3.3.4 Kết xác định yếu tố ảnh hƣởng theo ma trận Plackett – Burman 74 3.3.5 Kết thí nghiệm khởi đầu 83 3.3.6 Kết thí nghiệm tìm khoảng tối ƣu phƣơng pháp leo dốc 89 3.3.7 Kết thí nghiệm đáp ứng bề mặt theo thiết kế thí nghiệm Box Behnken 92 3.4 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHẤT KHÁNG NẤM THEO THỜI GIAN TRÊN MÔI TRƢỜNG TỐI ƢU 108 HƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 Trang iv 4.1 KẾT LUẬN 111 4.2 ĐỀ NGHỊ 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO 113 PH L C 122 Trang v DANH M C CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One-way analysis of variance C.cassiicola Corynespora cassiicola CFU Colony forming unit CNSH Công nghệ sinh học Cs Cộng NA Nutrent Agar NB Nutrient Broth nm nanomet OD Optical Density PTN Phịng thí nghiệm PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth P–B Plackett - Burman VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization Trang vi DANH M C CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng kết hợp dấu ma trận 28 Bảng 1.2 Bảng ma trận quy hoạch với N = 12, K = 11 29 Bảng 2.1 Các nguồn nitơ khảo sát 46 Bảng 3.1 Kết phân lập 55 Bảng 3.2 Kết thử khả kháng giếng khuếch tán 57 Bảng 3.3 Kết tƣơng quan giá trị OD610 mật độ tế bào (Log (N/mL)) 58 Bảng 3.4 Giá trị OD610 mật độ tế bào (Log (N/mL)) 59 Bảng 3.5 Mật độ tế bào Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 thời điểm nuôi cấy (Log (N/mL)) 60 Bảng 3.6 Đƣờng kính vịng kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 62 Bảng 3.7 Bảng kết nguồn nitơ khảo sát 64 Bảng 3.8 Bảng kết nguồn cacbon khảo sát 66 Bảng 3.9 Bảng kết nguồn khoáng khảo sát 68 Bảng 3.10 Bảng kết dãy pH khảo sát 70 Bảng 3.11 Bảng kết dãy nhiệt độ khảo sát 72 Bảng 3.12 Bảng kết thí nghiệm yếu tố chọn lọc 73 Bảng 3.13 Giá trị biến số thí nghiệm Plackett-Burman tìm yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng nấm Bacillus sp S29 74 Bảng 3.14 Thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman kết thí nghiệm với mức độ yếu tố 75 Bảng 3.15 Bảng giá trị biến số thí nghiệm Plackett-Burman tìm yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng nấm Bacillus sp T3 79 Bảng 3.16 Thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman kết thí nghiệm với mức độ yếu tố 79 Bảng 3.17 Bảng bố trí thí nghiệm khởi đầu cho yếu tố ảnh hƣởng 84 Trang vii Bảng 3.18 Bảng bố trí thí nghiệm khởi đầu cho yếu tố ảnh hƣởng 86 Bảng 3.19 Bảng tính bƣớc chuyển động phƣơng pháp leo dốc chủng Bacillus sp S29 89 Bảng 3.20 Kết đƣờng kính vịng kháng nấm thu đƣợc sau thí nghiệm leo dốc chủng Bacillus sp S29 90 Bảng 3.21 Bảng tính bƣớc chuyển động phƣơng pháp leo dốc chủng Bacillus sp T3 91 Bảng 3.22 Kết đƣờng kính vịng kháng nấm thu đƣợc sau thí nghiệm leo dốc chủng Bacillus sp T3 91 Bảng 3.23 Giá trị mức độ thiết kế thí nghiệm Box-Behnken 93 Bảng 3.24 Bố trí kết thí nghiệm Box-Behnken chủng Bacillus sp S29 93 Bảng 3.25 Giá trị mức độ thiết kế thí nghiệm Box-Behnken 100 Bảng 3.26 Bố trí kết thí nghiệm Box-Behnken chủng Bacillus sp T3 101 Bảng 3.27 Đƣờng kính vịng kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 108 Trang viii NH CÁC IỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Đƣờng tƣơng quan tuyến tínhgiữa giá trị OD610 mật độ tế bào Bacillus sp S29 58 Biểu đồ 3.2 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giá trị OD610 mật độ tế bào Bacillus sp T3 59 Biểu đồ 3.3 Đƣờng cong tăng trƣởng Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 theo thời gian 61 Biểu đồ 3.4 Đƣờng kính vịng kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 63 Biểu đồ 3.5 Kết nguồn nitơ khác 65 Biểu đồ 3.6 Kết nguồn cacbon khác 67 Biểu đồ 3.7 Kết nguồn khoáng vô khác 69 Biểu đồ 3.8 Bảng kết dãy pH khảo sát 71 Biểu đồ 3.9 Bảng kết dãy nhiệt độ khảo sát 73 Biểu đồ 3.10 Đƣờng kính vịng kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 109 NH ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Đồ thị ảnh hƣởng (Main Effects Plot) 77 Đồ thị 3.2 Đồ thị ảnh hƣởng (Main Effects Plot) 82 Đồ thị 3.3 Đồ thị đƣờng mức biểu thị giá trị tối ƣu yếu tố 98 Đồ thị 3.4 Đồ thị bề mặt biểu thị giá trị tối ƣu yếu tố 98 Đồ thị 3.5 Đồ thị đƣờng mức biểu thị giá trị tối ƣu yếu tố 105 Đồ thị 3.6 Đồ thị bề mặt biểu thị giá trị tối ƣu yếu tố 106 Trang ix NH CÁC H NH Hình 1.1 Hai dạng đốm xƣơng cá Hình 1.2 Đốm, đốm có lỗ viền vàng Hình 1.3 Héo bạc đầu Hình 1.4 Dạng xƣơng cá cháy phiến Hình 1.5 Triệu chứng thân Hình 1.6 Tán bị rụng corynespora Hình 1.7 Khuẩn lạc nấm Corynespora cassiicola mơi trƣờng PDA 14 Hình 1.8 Bào tử nấm Corynespora cassiicola nhuộm dung dịch lactophenol 14 Hình 1.9 Sơ đồ đối tƣợng nghiên cứu 26 Hình 1.10 Thiết kế CCD với điểm góc (cube poit), điểm dọc trục lần lặp lại điểm thí nghiệm trung tâm (0,0) 33 Hình 1.11 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box-Behnken 34 Hình 1.12 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 36 Hình 2.1 Kết kháng nấm vi khuẩn 42 Hình 2.2 Đƣờng cong sinh trƣởng hệ thống lên men kín 44 Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 môi trƣờng NA sau 24 nuôi cấy 56 Hình 3.2 Nhuộn gram Bacillus sp S29 Bacillus sp T3 56 Hình 3.3 Kết thử khả kháng giếng khuếch tán 57 Hình 3.4 Kết giá trị tối ƣu yếu tố ảnh hƣởng 99 Hình 3.5 Kết giá trị tối ƣu yếu tố ảnh hƣởng 107 Trang 122 PH L C Thuốc nhuộm Crystal violet: a) Crystal violet 0,4 g Cồn 96o 10 mL b) Phenol 1g Nƣớc cất 100 mL Lưu ý: trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Bảo quản chai màu tránh ánh sáng Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nƣớc cất 300 mL Lưu ý: hòa tan 2g KI vào mL nƣớc cất, sau them 1g Iod Chờ cho Iod tan hết them nƣớc vừa đủ 300 mL Safranin O Safranin O (dung dịch 2% cồn 96o) 25 mL Nƣớc cất 75 mL ƣu ý: Bảo quản chai màu Môi trƣờng Thành phần môi trường NA: NB 8g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 mL Hấp khử trùng 1210C/15 – 20 phút Thành phần môi trường NB: Cao thịt 5g Trang 123 Pepton bột 10g NaCl 5g Nƣớc cất 1000 mL pH : 7,4 – 7,6 Hấp khử trùng 1210C/15 – 20 phút Thành phần môi trường PDA: Dịch chiết khoai tây 20% Peptone 10 g D-Glucose 20 g Agar 20 g Nƣớc cất 1000ml Môi trường cho Bacillus sp S29 Bacillus sp T3  Theo Cao cs., 2010 Dịch chiết khoai tây 20% Glucose 20 g Chiết thịt bò 5g (NH4)2SO4 1g MgSO4 1g KH2PO4 0,6 g  Theo Ghribi cs., 2011 Dịch chiết khoai tây 20% Chiết thịt bò 5g Glucose 20 g Bổ sung muối: KH2PO4 0,5 g K2HPO4 1g NaCl 0,5 g MgSO4 1g Trang 124 PH L C 2.1 Kết sử lý thống kê ANOVA yếu tố thí nghiệm thử đối kháng phƣơng pháp khuếch tán phần mềm Statgraphics Plus 3.0 2.2 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định mật độ tế bào theo thời gian chủng Bacillus sp S29 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Trang 125 2.3 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định mật độ tế bào theo thời gian chủng Bacillus sp T3 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 2.4 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định hoạt tính chất kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp S29 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Trang 126 2.5 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định hoạt tính chất kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp T3 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 2.6 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc nguồn nitơ chủng Bacillus sp S29 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Trang 127 2.7 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc nguồn nitơ chủng Bacillus sp T3 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 2.8 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc nguồn cacbon chủng Bacillus sp S29 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Trang 128 2.9 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc nguồn cacbon chủng Bacillus sp T3 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 2.10 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc nguồn khoáng chủng Bacillus sp S29 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Trang 129 2.11 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc nguồn khống chủng Bacillus sp T3 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 2.12 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc dãy pH chủng Bacillus sp S29 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Trang 130 2.13 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc dãy pH chủng Bacillus sp T3 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 2.14 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc dãy nhiệt độ chủng Bacillus sp S29 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Trang 131 2.15 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm sàng lọc dãy nhiệt độ chủng Bacillus sp T3 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 2.16 Kết xử lý số liệu thí nghiệm Plackett-Burman chủng Bacillus sp S29 phần mềm Minitab 16.2.0 Trang 132 2.17 Kết xử lý số liệu thí nghiệm Plackett-Burman chủng Bacillus sp T3 phần mềm Minitab 16.2.0 2.18 Kết phân tích hồi quy cho thí nghiệm khởi đầu chủng Bacillus sp S29 phần mềm Minitab 16.2.0 Trang 133 2.19 Kết phân tích hồi quy cho thí nghiệm khởi đầu chủng Bacillus sp T3 phần mềm Minitab 16.2.0 2.20 Kết phân tích hồi quy cho thí nghiệm đáp ứng bề mặt chủng Bacillus sp S29 phần mềm Minitab 16.2.0 Trang 134 2.21 Kết phân tích phƣơng sai cho thí nghiệm đáp ứng bề mặt chủng Bacillus sp S29 phần mềm Minitab 16.2.0 2.22 Kết phân tích hồi quy cho thí nghiệm đáp ứng bề mặt chủng Bacillus sp T3 phần mềm Minitab 16.2.0 Trang 135 2.23 Kết phân tích phƣơng sai cho thí nghiệm đáp ứng bề mặt chủng Bacillus sp T3 phần mềm Minitab 16.2.0 2.24 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định hoạt tính chất kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp S29 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 Trang 136 2.24 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định hoạt tính chất kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp T3 phần mềm Statgraphics Plus 3.0 ... tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu sản xuất chế phẩm kháng nấm Corynespora cassiicola từ vi khuẩn Bacillus? ?? Mục tiêu đề tài:  Đánh giá in vitro khả kháng nấm Corynespora cassiicola  Tối ƣu hóa... nghiên cứu chủ yếu nghiên cứu sáng tạo nghiên cứu thực nghiệm Nghiên cứu sáng tạo nghiên cứu nhằm phát triển lý thuyết mới, trình hay thiết kế sản phẩm Bao gồm nghiên cứu sáng tạo lý thuyết nghiên. .. nam 2013 Trong nghiên cứu này, chúng tơi tập trung vào nghiên cứu sâu khả kiểm soát sinh học sản xuất chế phẩm kháng nấm để thử nghiệm quy mơ thực nghiệm Từ định hƣớng nghiên cứu đó, tiến hành