Nghiên cứu đánh giá sự ổn định của vi khuẩn bacillus subtilis và geobacillus thermophilus sau thời gian bảo tồn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM SOMPHIK BOUDASAK NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ỔN ĐỊNH CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VÀ GEOBACILLUS THERMOPHILUS SAU THỜI GIAN BẢO TỒN Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Hồng Ngân TS Nguyễn Thi ̣Trang NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn Somphik Boudasak i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS.TS Phạm Hồng Ngân TS Nguyễn Thị Trang tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Thú y cộng đồng, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức trường Cao đẳng kỹ thuật tỉnh Oudomxai giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn Somphik Boudasak ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những góp ý mới, ý nghĩa khoa học đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Đặc điểm chung bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn b Subtilus, g Thermophilus 2.1.1 Định nghĩa bảo tồn 2.1.2 Các phương pháp bảo tồn, lưu giữ giống 2.1.3 Vai trò, ý nghĩa bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn đánh giá ổn định công tác bảo tồn, lưu giữ giống sau thời gian bảo tồn 2.2 Sơ lược vi khuẩn b Subtilus, g Thermophilus 2.2.1 Vi khuẩn b Subtilis 2.2.2 Vi khuẩn g Thermophilus 13 2.3 Tình hình nghiên cứu bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn nước 15 2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 15 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 22 3.1 Địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Vật liệu nghiên cứu 22 iii 3.3.1 Mơi trường, hóa chất 22 3.3.2 Trang thiết bị 22 3.3.3 Vi khuẩn 22 3.5 Phương pháp nghiên cứu 23 3.5.1 Phương pháp đánh giá ổn định số lượng vi khuẩn b Subtillis g Thermophilus sau 12 tháng bảo tồn 23 3.5.2 Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn b Subtillis g Thermophilus 23 3.5.3 Kiểm tra số đặc tính sinh hóa b.subtilis g Thermophilus 24 3.5.4 Phương pháp kiểm tra ô nhiễm nấm chủng vi khuẩn b Subtillis g Thermophilus sau bảo tồn phương pháp đông khô 27 3.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 27 Phần Kết thảo luận 28 4.1 Kết kiểm tra tính ổn định vi khuẩn b Subtilis, g Thermophilus 28 4.1.1 Kết kiểm tra số lượng vi khuẩn b Subtilis, g Thermophi lus sau bảo tồn đông khô môi trường cát 28 4.1.2 Kết kiểm tra ổn dịnh đặc điểm hình thái, đặc tính ni cấy đặc tính sinh hóa vi khuẩn b Subtilis, g Thermophilus sau bảo quản 29 4.1.3 Kết kiểm tra ô nhiễm nấm sau thời gian bảo tồn 35 4.1.4 Kết kiểm tra tính đối kháng b Subtilis g Thermophilus với vi khuẩn gây bệnh 35 Phần Kết luận kiến nghị 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 Tài liệu tham khảo 38 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt B subtilis Bacilus Subtilis BHI Brain Heart Infusion CFU Colony - Forming Unit Geobacilus thermophilus G thermophilus Gram (+) Gram dương Gram (-) Gram âm MR Methyl - Red NB Nutrient Broth TSA Tryptic Soya Agar TSB Tryptic Soya Broth v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc tính sinh hóa B subtilis Bảng 2.2 Sự khác bào tử tế bào sinh dưỡng B subtilis 11 Bảng 2.2 Đặc tính sinh hóa G thermophilus 14 Bảng 4.1 Số lượng vi khuẩn B subtilis, G thermophilus sau 12 tháng bảo quản đông khô 28 Bảng 4.2 Số lượng vi khuẩn B subtilis, G thermophilus sau 12 tháng bảo quản môi trường cát 28 Bảng 4.3 Kết kiểm tra số đặc tính ni cấy vi khuẩn B subtilis sau thời gian bảo tồn 30 Bảng 4.4 Kết kiểm tra số đặc tính vi khuẩn G thermophilus sau thời gian bảo tồn 31 Bảng 4.5 Kết kiểm tra số đặc tính sinh hóa vi khuẩn B subtilis sau thời gian 12 tháng bảo tồn 33 Bảng 4.6 Kết kiểm tra số đặc tính vi khuẩn G thermophilus sau thời gian bảo tồn 33 Bảng 4.7 Kết kiểm tra ô nhiễm nấm vi khuẩn B subtilis, G thermophilus sau thời gian bảo tồn 35 Bảng 4.8 Kết kiểm tra tính đối kháng B subtilis G thermophilus với vi khuẩn Enterotoxigenic (chủng PD17) Enterotoxigenic (chủng TM21) 36 vi DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Hình thái vi khuẩn G thermophilus 29 Hình 4.2 Hình thái vi khuẩn B subtilis 29 Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn B subtilis mơi trường TSA 30 Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn G thermophilus môi trường TSA 30 Hình 4.5 Vi khuẩn B subtilis thạch nghiêng TSA 31 Hình 4.6 Vi khuẩn G thermophilus thạch nghiêng TSA 31 Hình 4.7 Vi khuẩn B subtilis phát triển làm đục môi trường nước thịt 32 Hình 4.8 Vi khuẩn B subtilis môi trường thạch khoai tây 32 Hình 4.9 Phản ứng catalase vi khuẩn B subtilis, G thermophilus 34 Hình 4.10 Phản ứng Methyl Red vi khuẩn 34 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Sompik Boudasak Tên luận Văn: Nghiên cứu đánh giá ổn định B subtilis G thermophilus sau thời gian bảo tồn Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: - Kiểm tra mức độ ổn định vi khuẩn B subtilis G.thermophilus số lượng, đặc điểm nuôi cấy, đặc tính sinh hóa, tính đối kháng với chủng E coli gây bệnh Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp đếm số đánh giá ổn định số lượng vi khuẩn B subtilis G thermophilus sau thời gian bảo tồn - Phương pháp nuôi cấy - Phương pháp kháng sinh đồ Kết kết luận Từ nghiên cứu đạt đưa số kết luận sau: - Khi kiểm tra 50 ống giống B Subtilis 50 ống giống G thermophilus sau bảo quản đông khô 12 tháng tỷ lệ sống vi khuẩn B subtilis G thermophilus 87,76% 82,61% - Kiểm tra 50 ống giống B subtilis 50 ống giống G thermophilus sau 12 tháng bảo quản cát, tỷ lệ sống chủng vi khuẩn 71,19% 68% Những chúng vi khuẩn B subtilis G thermophilus bảo tồn Phịng thí nghiệm Bộ mơn Thú y cộng đồng, khoa thú y HVNNVN giữ ổn định số lượng có đầy đủ đặc điểm đặc trưng vi khuẩn B subtilis G thermophilus tài liệu kinh điển miêu tả viii THESIS ABSTRACT Master candidate: Sompik Boudasak Thesis title: Evaluation the the stability of B subtilis and G thermophilus after conservation period Major: Veterinary Code: 8640101 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives To test the stability of B subtilis and G thermophilus in terms of quantity, culture characteristics, biochemical characteristics Materials and Methods - Methods of counting the numbers of B subtilis and G thermophilus after the conservation period - Methods of culture - Methods of dick diffusion Main findings and conclusions From the above-mentioned studies, we have made some conclusions as follows: When testing 50 strain tubes of B subtilis and 50 strain tubes of G thermophilus after 12 months of lyophylization, the survival rates of B subtilis and G thermophilus were 87.76% and 82.61%, respectively When testing 50 strain tubes of B subtilis and 50 strain tubes of G thermophilus were stored in sand for 12 months and the survival rate of these two strains bacteria were 71.19% and 68%, respectively B subtilis and G thermophilus strains are currently being conserved in the Laboratory of the Department of Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine of Vietnam National University of Agriculture remain stable in number and fully characterized of B subtilis and G thermophilus as described canonical ix Phương pháp thử: Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc loại vi khuẩn cần thử di miếng giấy thấm thuốc thử, Nhỏ giọt thuốc thử giấy thấm vô trùng Sau 10 giây phản ứng dương tính lên màu tím, âm tính màu sắc không thay đổi Phản ứng Indol: Dung dịch thử Kovac: Para dimetyl amino benzaldehyt 5g Cồn butylic hay cồn isoamylic 75 g HCl đặc 25 g Cho 5g Para dimetyl amino benzadehyt trộn vào cồn butylic để vào tủ ấm 50-600C, lắc cho tan hoàn toàn đợi nguội, cho HCL đặc vào giọt một, vừa cho vừa lắc Tiến hành phản ứng: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước thịt nuôi cấy 37 c Sau 1-2 ngày lấy nhỏ vào môi trường ni cấy 3-4 giọt Kovac, lắc đều, có indol sinh bề mặt mơi trường có vịng màu đỏ, phản ứng dương tính Nếu khơng biến màu phản ứng âm tính, tức khơng có indol Phản ứng Methyl Red: Mơi trường thử phản ứng: Pepton 7g Glucoza 5g Photphat dipotaxic (K2HP4) 5g Nước cất 1000 ml Hấp cách quãng 1000C cho tan hết, điều chỉnh pH =7,0- 7.2, lọc qua giấy, chia vào ống nghiệm, ống 10 ml hay 5ml Hấp ướt 1100C 15 phút Chế dung dịch đỏ methyl: Đỏ metyl 0,1 g Cồn 950C 300 ml Nước cất 200 ml Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường pepton glucoza, nuôi cấy tủ ấm 37 C 2-4 ngày Sau lấy nhỏ 2-3 giọt dung dịch đỏ metyl 0,04% 25 cồn 950C Qua phút có màu đỏ phản ứng dương tính, màu vàng phản ứng âm tính, màu đỏ màu vàng phản ứng khả nghi Phản ứng Voges Prokauer (VP): Môi trường thử phản ứng: Pepton 5g Glucoza 5g Photphat dipotaxic (K2HP4) 5g Nước cất 1000 ml Hấp cách quãng 1000C cho tan hết, điều chỉnh pH =7,5, lọc qua giấy, chia vào ống nghiệm, ống 10 ml hay 5ml Hấp ướt 1100C 15 phút Chế dung dịch thử phản ứng V.P: Dung dịch 1: Alpha naphtol Cồn 960 Dung dịch 2: NAOH Nước cất 5g 100 ml 40g 100 ml Phương pháp tiến hành: cấy giống vi khuẩn cần chẩn đốn vào mơi trường pepton glucoza, nuôi cấy nhiệt độ 370C 2-4 ngày, sau nhỏ vào mơi trường ni cấy giọt dung dịch 2, sau phút có màu đỏ hồng dương tính, biến màu màu vàng âm tính, loại phản ứng có 4-5 sau xuất - Xác định đặc tính sinh vật hóa học vi khuẩn B subtilis G themophilus theo phương pháp mô tả phịng thí nghiệm: + Mở ống giống vi khuẩn B subtilis G thermophilus tiến hành cấy môi trường thạch nghiêng TSA + Sau kiểm tra thấy vi khuẩn B subtilis mọc môi trường thạch nghiêng TSA có khuẩn lạc màu xám nhạt, rìa nhăn gợn sóng, xù xù, bề mặt khơ Vi khuẩn G thermophilus mọc mơi trường thạch nghiêng TSA có khuẩn lạc màu xám nhạt, trơn bề mặt khơ Thì ta lấy khuẩn lạc đặc trưng cấy lên môi trường thạch khoai tây, gelatin, TSA nuôi tủ ấm 37ºC 24 + Sau 24 nuôi cấy đem quan sát tính chất mọc vi khuẩn B subtilis G thermophilus môi trường thạch khoai tây, genlatin, TSA 26 + Tiếp tục lấy khuẩn lạc đặc trưng môi trường để nhuộm Gram quan sát đặc điểm hình thái, thử phản ứng sinh hóa Lecithilase, TSI, VP, MR, Indol, catalase, manitol (bán cổ thể), khả lên men loại đường 3.5.4 Phương pháp kiểm tra ô nhiễm nấm chủng vi khuẩn B subtillis G thermophilus sau bảo tồn phương pháp đơng khơ Pha lỗng mẫu sau cấy vào môi trường Sabouraul nuôi cấy tủ ấm 37ºC ngày để đọc kết 3.5.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu nhập phần mềm Excel 2010 27 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VI KHUẨN B SUBTILIS, G THERMOPHILUS 4.1.1 Kết kiểm tra số lượng vi khuẩn B subtilis, G thermophi lus sau bảo tồn đông khô môi trường cát Sau tiến hành kiểm tra số lượng vi khuẩn B subtilis 50 ống giống vi khuẩn 50 ống giống vi khuẩn G thermophilus bảo quản phương pháp đông khô thu kết sau: Bảng 4.1 Số lượng vi khuẩn B subtilis, G thermophilus sau 12 tháng bảo quản đông khô B Subtilis 50 Số lượng vi khuẩn trước bảo quản (CFU/ml) 4,9×107 G thermophilus 50 2,3x108 Chủng vi khuẩn N Số lượng vi khuẩn sau 12 tháng bảo quản (CFU/g) 4,3×107 1,9×108 Tỷ lệ sống (%) 87,76 82,61 Bảng 4.2 Số lượng vi khuẩn B subtilis, G thermophilus sau 12 tháng bảo quản môi trường cát Chủng vi khuẩn N Số lượng vi khuẩn Số lượng vi khuẩn Tỷ lệ trước bảo quản sau 12 tháng bảo sống (CFU/ml) quản (CFU/g) (%) 4,6×107 74,19 1,7×108 68,00 B Subtilis 50 6,2×107 G thermophilus 50 2,5x108 Kết kiểm tra số lượng vi khuẩn Bảng 4.1 cho thấy: Khi kiểm tra 50 ống giống B subtilis 50 ống giống G thermophilus sau bảo quản đông khô 12 tháng tỷ lệ sống vi khuẩn B subtilis G thermophilus 87,76% 82,61% Kiểm tra 50 ống giống B subtilis 50 ống giống G thermophilus sau 12 tháng bảo quản cát, tỷ lệ sống chủng vi khuẩn 71,19% 68% Điều chứng tỏ môi trường đông khô bảo quản cát phương 28 pháp bảo quản giữ số lượng vi khuẩn B subtilis, G thermophilus Phương pháp bảo quản mơi trường đơng khơ có nhiều ưu điểm như: Bảo quản thời gian dài Ít bị tạp, hạn chế thay đổi đặc tính vi khuẩn hạn chế chủng giống gốc Phương pháp bảo quản cát có tỷ lệ sống thấp so với phương pháp đông khô, nhiên phương pháp có ưu điểm đơn giản , chi phí thấp, khơng u cầu máy móc trang thiết bị đại 4.1.2 Kết kiểm tra ổn dịnh đặc điểm hình thái, đặc tính ni cấy đặc tính sinh hóa vi khuẩn B subtilis, G thermophilus sau bảo quản a Đặc điểm hình thái Sau nhuộm vi khuẩn phương pháp nhuộm Gram, tiến hành soi kính hiển vi điện tử ta thấy: B subtilis trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu Gram (+), đứng đơn lẻ hay thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả sinh nha bào khơng làm biến đổi hình dạng vi khuẩn G Stearothermophilus trực khuẩn có dạng hình que, đứng riêng rẽ thành chuỗi Bắt màu Gram (+) nhuộm Hình 4.1 Hình thái vi khuẩn G thermophilus Hình 4.2 Hình thái vi khuẩn B subtilis b Đặc tính ni cấy Chúng tơi tiến hành lấy 50 ống giống B subtilis 50 ống giống G themophilus lưu giữ tiến hành kiểm tra đặc điểm nuôi cấy (trong ống giống kiểm tra có 25 ống giống B subtilis, 25 ống giống 29 G themophilus bảo quản môi trường cát 25 ống giống B subtilis, 25 ống giống G thermophilus bảo quản đơng khơ) Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn B subtilis môi trường TSA Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn G thermophilus mơi trường TSA Bảng 4.3 Kết kiểm tra số đặc tính ni cấy vi khuẩn B subtilis sau thời gian bảo tồn Môi trường kiểm tra Thạch đĩa TSA Số ống kiểm tra 50 Thạch nghiêng TSA 50 Thạch khoai tây 50 Môi trường TSI Nước thịt 50 50 Đặc tính ni cấy sinh học B subtilis Khuẩn lạc có dạng hình trịn, rìa cưa khơng đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu váng xám Dễ mọc, khuẩn lạc màu xám nhạt, rìa gợn sóng xù xì, bề mặt khơ Phát triển đều, màu vàng lấm hạt Cả phần đáy môi trường chuyển sang màu vàng, mặt nghiêng thạch chuyển sang màu hồng đậm, không sinh Tạo màng nhăn, lắng cặn kết vẩn mây 30 Số ống biểu đặc tính Tỷ lệ (%) 50 100 50 100 50 100 50 100 50 100 Bảng 4.4 Kết kiểm tra số đặc tính vi khuẩn G thermophilus sau thời gian bảo tồn Môi trường kiểm tra Số ống kiểm tra Thạch nghiêng TSA Thạch đĩa TSA 50 Thạch khoai tây 50 Genlatin TSI 50 50 Nước thịt 50 Từ bảng 50 Đặc tính ni cấy sinh học G Stearothermophilus Xuất hện khuẩn lạc màu xám nhạt, Xuất khuẩn lạc dạng trịn Khuẩn lạc có màu vàng, cấy theo đường ziczac khuẩn lạc mọc lan rộng cành khô Cả phần đáy môi trường chuyển sang màu vàng, mặt nghiêng thạch chuyển sang màu hồng đậm, không sinh Làm đục môi trường nươc thịt, lắng cặn ẩn mây lắc khó tan Số ống biểu đặc tính 50 Tỷ lệ (%) 100 50 100 50 100 50 50 100 100 50 100 4.3 4.4 ta thấy với 50 chủng B subtilis 50 chủng G thermophilus sau thời gian bảo quản, đặc tính ni cấy giống với khuẩn lạc đặc trưng Hình 4.5 Vi khuẩn B subtilis thạch nghiêng TSA Hình 4.6 Vi khuẩn G thermophilus thạch nghiêng TSA 31 Hình 4.7 Vi khuẩn B subtilis phát Hình 4.8 Vi khuẩn B subtilis môi triển làm đục môi trường nước thịt trường thạch khoai tây c Đặc tính sinh hóa vi khuẩn B Subtilis, G thermophilus sau thời gian bảo tồn Kết kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn sau 12 tháng bảo quản phù hợp với kết thực với đối chứng dương chủng giống chủng từ Bảo tàng chủng Việt Nam Kết phù hợp với kết tác giả khác (Holt et al., 1994; Green et al., 1999; O’Donnell et al., 1980) Trong ống giống kiểm tra có 25 ống giống B Subtilis, 25 ống giống G thermophilus bảo quản môi trường cát 25 ống giống B subtilis, 25 ống giống G thermophilus bảo quản đông khô 32 Bảng 4.5 Kết kiểm tra số đặc tính sinh hóa vi khuẩn B subtilis sau thời gian 12 tháng bảo tồn Số mẫu kiểm tra Kết Số mẫu Tỷ lệ (%) Sinh Indole 50 - 50 100 MR 50 + 50 100 VP 50 + 50 100 Catalase 50 + 50 100 Di động 50 + 50 100 Tan chảy Genlatin 50 + 50 100 Lên men glucose 50 + 50 100 Lên men lactose 50 - 50 100 Lên men saccharose 50 + 50 100 Đặc tính sinh hóa Bảng 4.6 Kết kiểm tra số đặc tính vi khuẩn G thermophilus sau thời gian bảo tồn Đặc tính sinh hóa Số mẫu kiểm tra Kết Số mẫu Tỷ lệ (%) Sinh Indole 50 - 50 100 MR 50 + 50 100 VP 50 + 50 100 Catalase 50 + 50 100 Di động 50 + 50 100 Tan chảy Genlatin 50 + 50 100 Lên men glucose 50 + 50 100 Lên men lactose 50 - 50 100 Lên men saccharose 50 + 50 100 Từ bảng 4.5 4.6 ta thấy: Hầu hết chủng B subtilis G thermophilus dương tính với MR, khử nitrate, âm tính với phản ứng Idol Các chủng B Subtilis G themophilus đề có khả di động Kết kiểm tra phù hợp với kết thự với đối chứng dương chủng gống chủng từ bảo tàng giống Việt Nam 33 Hình 4.9 Phản ứng catalase vi khuẩn B subtilis, G thermophilus Hình 4.10 Phản ứng Methyl Red vi khuẩn 34 4.1.3 Kết kiểm tra ô nhiễm nấm sau thời gian bảo tồn Tiến hành nuôi cấy 50 ống giống B subtilis, 50 ống giống G ther mophilus bảo quản môi trường cát 50 ống giống B subtilis, 50 ống giống G thermophilus bảo quản đông khô môi trường Sabouraul nhiệt dộ 37°C sau 24h, 48h, 72h mang quan sát Kết thu sau: Kết ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm ống giống bảo quản môi trường đông khô cát không nhiễm, điều cho thấy thêm ưu điểm việc bảo quản ống giống phịng thí nghiệm phương pháp đơng khơ cát Bảng 4.7 Kết kiểm tra ô nhiễm nấm vi khuẩn B subtilis, G thermo philus sau thời gian bảo tồn Vi khuẩn B subtilis Vi khuẩn G thermophilus Môi trường Số mẫu bảo quản kiểm tra Số mẫu (+) Tỉ lệ (%) Số mẫu (+) Tỉ lệ (%) Đông khô 50 0% 0% Trong cát 50 0% 0% Kết ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm ống giống bảo quản môi trường đông khô không nhiễm, điều cho thấy thêm ưu điểm việc bảo quản ống giống phịng thí nghiệm phương pháp đơng khơ cát 4.1.4 Kết kiểm tra tính đối kháng B subtilis G thermophilus với vi khuẩn gây bệnh Chúng tơi tiến hành kiểm tra tính đối kháng B subtilis G thermophilus với chủng vi khuẩn E.coli gây tiêu chảy Enterotoxigenic E.coli (chủng PD17) Enterotoxigenic E.coli (chủng TM21) phương pháp đục lỗ thạch Môi trường TSA tiến hành đục lỗ nút cao su đường kính 10mm, sau tiến hành láng vi khuẩn E.coli lên bề mặt thạch, hút 50 μl dung dịch chứa vi khuẩn bacillus bơm vào lỗ đĩa thạch Ủ đĩa thạch tủ ấm quan sát vịng vơ khuẩn sau 24 Kích thước vịng đối kháng = đường kính vịng kháng khuẩn - đường kính lỗ chứa dịch chiết vi khuẩn đối kháng 35 Bảng 4.8 Kết kiểm tra tính đối kháng B subtilis G thermophilus với vi khuẩn Enterotoxigenic (chủng PD17) Enterotoxigenic (chủng TM21) Enterotoxigenic E.coli Enterotoxigenic E.coli (chủng PD17) (chủng TM21) B subtilis Vòng đối kháng 25mm Vòng đối kháng 28mm G themophilus Vòng đối kháng 30mm Vòng đối kháng 26mm Chủng vi khuẩn Kết kiểm tra cho thấy B subtilis G thermophilus có tính đối kháng mạnh với Enterotoxigenic (chủng PD17) Enterotoxigenic (chủng TM21) Vậy, đối kháng vi khuẩn B subtilis G thermophilus với chủng E Coli gây bệnh chủng PD17 chủng TM21 > 20 mm Điều chứng tỏ B subtilis G thermophilus bảo tồn có khả ức chế phát triển vi khuẩn 36 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết đánh giá ổn định B subtilis G thermophilus sau thời gian bảo tồn, rút số kết luận sau: Môi trường bảo quản đông khô bảo quản cát giữ số lượng, tỷ lệ sống vi khuẩn B subtilis, G thermophilus Cụ thể, tỷ lệ sống vi khuẩn B subtilis G thermophilus sau bảo quản 12 tháng môi trường đôg khô 87,76% 82,61%; bảo quản cát 71,19% 68% Môi trường bảo quản đông khô bảo quản cát giữ ổn định đặc điểm hình thái, đặc tính ni cấy đặc tính sinh hóa vi khuẩn B subtilis, G thermophilus sau thời gian bảo quản 12 tháng Sau thời gian bảo quản 12 tháng môi trường đông khô bảo quản cát, vi khuẩn B Subtilis, G Thermophilus không bị nhiễm nấm B subtilis G thermophilus có khả ức chế Enterotoxigenic (chủng PD17) Enterotoxigenic (chủng TM21) 5.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục bảo quản, lưu giữ vi khuẩn B subtilis G themophilus theo phương pháp bảo quản cát, đơng khơ Đây phương pháp thích hợp, dễ thực đặc biệt phù hợp với phịng thí nghiệm môn Thú y cộng đồng Tiếp tục thu thập thêm chủng vi khuẩn để bảo tồn phục vụ công tác nghiên cứu giảng dậy Cần có thêm thời gian để đánh giá thêm tiêu chủng bảo quản để thực kiểm tra chất lượng chủng sau bảo quản tốt điều kiện phịng thí nghiệm môn 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp Nguyễn Thị Kim Chi (2004) Nghiên cứu số đặc tính sinh hóa chủng Bacillus subtilis dùng sản xuất sinh phẩm Tạp chí Y học thực hành (478) Lương Đức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh vật NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lý Kim Hữu (2005) Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm propiotic LVTN Khoa chăn nuôi - thú y, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Duy Khánh (2006) Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis LVTN Khoa công nghệ sinh học, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty (1998) Vi sinh vật học NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Như Thanh (1990) Vi sinh vật đại cương NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Viết Không, Phạm Sơn Hổ, Phạm Thị Nga, Lê Văn Hùng, Hồ Văn Hiệp Đỗ Văn Tấn (2013) Bảo tồn lưu giữ nguồn gen vi sinh vật thú y Báo cáo nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen, Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn Nguyễn Thị Trang Phạm Hồng Ngân (2017) Lưu giữ bảo quản nguồn gen nông nghiệp nhập nội phục vụ công tác nghiên cứu, đào tạo đa dạng sinh học Báo cáo nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen, Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn Tô Minh Châu, Vương Thị Việt Nga, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp Nguyễn Thúy Hương (2000) Vi sinh vật học đại cương NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 10 Vũ Thị Thứ (1996) Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học Viện sinh học nhiệt đới II Tài liệu tiếng Anh: Alexander M (1977) Introduction to Soil Microbiology John Wiley and Són, Inc., New York 38 Hetzer A (2006) Cadmium Ion Biosorption by the Thermophilic Bacteria Geobacillus thermophilus and G Thermocatenulatus Applied and environmental Microbio logy pp 4020-4027 Holt J G., N R Krieg, P.H.A Sneath, J T Staley and S.T William (1994) Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Baltimore: William & Wilkins Microbial Biorealm (2011) Bacillus thermophilus O’Donnell A.G., J.R Norris, R.C.W Berkeley, D Claus, T Kanero, N.A Logan and R Nozaki (1980) Characterization of Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, and chromatography, Bacillus amyloliquefac deoxyribonucleic ciens by acid-deoxyribonucleic pyrolisis acid gas-liquid hybridization, biochemical test, and API systems Internat J.Syst Bacteriol 30 pp 448-459 39 ... nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu đánh giá ổn định vi khuẩn B subtilis G thermophilus sau thời gian bảo tồn? ?? 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Đánh giá ổn định vi khuẩn B Subtilis, G Thermophilus số lượng,... đặt ra, sau thời gian bảo tồn liệu giống bảo tồn có giữ trạng thái sống khiết ổn định ko? Chính vi? ??c đánh giá ổn định giống sau thời gian bảo tồn vi? ??c làm cần thiết 2.2 SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN B... phát bảo tồn mà cần phải định kì đánh giá điều kiện bảo tồn có phù hợp với chủng vi sinh vật chúng trì thời gian dài đánh giá lại khả sống hoạt động chủng vi sinh vật bảo tồn Sau thời gian bảo tồn,