thử nghiệm chiết xuất kháng thể sau khi tiêm vaccin dịch tả heo cho thỏ

iii TÓM TẮT Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2008 đến tháng 8/2008 Địa điểm nghiên cứu:  Viện Pasteur Tp. HCM  Trung Tâm Thú Y Vùng Tp. HCM  Phòng thí nghiệm Sinh Lý trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM  Khu trại bò trường Đai học Nông Lâm Tp.HCM Với mục tiêu là tìm hiểu phương pháp chiết xuất kháng thể bằng ammonium sulphate, đồng thời xem xét khả năng đáp ứng của thỏ sau khi tiêm vaccine dich tả, đề tài được tiến hành 2 đợt. Đợt 1 thử liều tiêm vaccine và xét nghiệm huyết thanh bằng phương pháp ELISA, tất cả các mẫu sau khi xét nghiệm đều cho kết quả âm tính. Đợt 2 xem xét khả năng đáp ứng của 2 nhóm thỏ với vaccine, nhóm 2 được tiêm liều gấp đôi nhóm 1, bằng cách lập công thức bạch cầu và xét nghiệm ELISA. Đồng thời tiến hành thu nhận huyết thanh, tủa trong ammonium sulphate bão hòa, và thu hồi bằng phương pháp thẩm tích để tinh chiết kháng thể (chỉ tiến hành tinh chiết kháng thể đối với huyết thanh thu nhận vào ngày thứ 30). Kết quả tóm tắt của đợt 2 như sau: - Tỷ lệ các loại bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và lâm ba cầu ở 2 nhóm có điểm chung là giai đoạn đầu tỷ lệ bạch cầu trung tính tăng, giai đoạn tiếp theo tỷ lệ bạch cầu đơn nhân tăng và giai đoạn cuối tỷ lệ lâm ba cầu tăng. - Tiến hành xét nghiệm ELISA cho 2 nhóm vào ngày 1, ngày 20 (sau mũi nhắc lại lần 3) và ngày 30 (sau mũi nhắc lại lần 4) kết quả là: Ở nhóm 1, thỏ 1 và thỏ 3 cho kết quả dương tính còn thỏ 2 cho kết quả âm tính vào ngày 20 và 30 (thỏ 3 vào ngày 20 nghi ngờ có kháng thể trong huyết thanh). Ở nhóm 2, thỏ 2 và thỏ 3 cho kết quả dương tính còn thỏ 1 cho kết quả âm tính vào ngày 20 và 30. - Qua phần trăm ức chế (PI), nhận thấy rằng hàm lượng kháng thể trong huyết thanh sau khi tinh chiết cao hơn hàm lượng kháng thể trước khi tinh chiết. iv MỤC LỤC Chương 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1 1.2.1. Mục tiêu 1 1.2.2. Yêu cầu 1 Chương 2. TỔNG QUAN 2 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 2 2.1.1. Kháng nguyên 2 2.1.2. Kháng thể 3 2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật 4 2.1.4. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch 8 2.2. KHÁI QUÁT VỀ CÔNG THỨC BẠCH CẦU 9 2.3. VIRUS DỊCH TẢ HEO 10 2.3.1. Đặc điểm hình thái 10 2.3.2. Độc lực 10 2.3.3. Đặc điểm nuôi cấy phân lập 11 2.4. VACCINE DỊCH TẢ HEO 11 2.3.1. Vaccine thế hệ mới 11 2.3.2. Vaccine chết 11 2.3.3. Vaccine nhược độc 11 2.5. CHIẾT XUẤT KHÁNG THỂ 13 2.5.1. Tủa bằng ammonium sulphate 13 2.5.2. Phương pháp tinh chiết bằng hệ thống gel lọc 15 2.5.3. Phương pháp tinh chiết bằng sắc ký ái lực 16 2.6. LƯỢC DUYỆT MỘT VÀI NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 17 v Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 18 3.1.1. Thời gian 18 3.1.2. Địa điểm 18 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 18 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 19 3.4.2. Lập công thức bạch cầu 22 3.4.3. Thu nhận huyết thanh và kháng thể 22 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI 25 3.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU 25 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1. ĐÁP ỨNG CỦA THỎ KHI TIÊM VACCINE 26 4.1.1. Đợt 1 26 4.1.2. Đợt 2 26 4.2. PHẦN TRĂM ỨC CHẾ (PI) CỦA HUYẾT THANH NGUYÊN VÀ SAU KHI THẨM TÍCH 31 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1. KẾT LUẬN 35 5.2. ĐỀ NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHẦN PHỤ LỤC 38 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên ELISA Enzyme – linked immuno sorbent assay Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzyme FDC Follicular dendritic cell Tế bào tua ở nang Ig Immunoglobulin Globulin miễn dịch MHC II Major histocompatibility complex class II antigens Các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II SIg Surface immunoglobulin Globulin miễn dịch màng tế bào T H Helper T cells Tế bào lympho T hỗ trợ T I Inducer T cells Tế bào lympho T cảm ứng T DTH Delayed type hypersensitivity T cells Tế bào lympho T gây quá mẫn muộn vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Kháng nguyên 2 Hình 2.2 Cấu trúc phân tử kháng thể 3 HÌnh 2.3 Phương pháp thẩm tích 14 Hình 2.4 Sắc ký gel lọc 15 Hình 2.5 Sắc ký ái lực 16 Hình 3.1 Chuồng nuôi thỏ 18 Hình 3.2 Lấy máu động mạch giữa tai 22 Hình 3.3 Thực hiện thẩm tích 24 Hình 3.4 Xét nghiệm ELISA 25 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Bảng công thức bạch cầu của một số gia súc nhỏ 9 Bảng 2.2 Một số loại vaccine DTH sử dụng tại Việt Nam hiện nay 12 Bảng 3.1 Thời điểm lấy máu và tiêm vaccine đợt ở 1 20 Bảng 3.2 Thời điểm lấy máu, tiêm vaccine, xét nghiệm và lập công thức bạch cầu ở đợt 2 21 Bảng 4.1 Kết quả ELISA đợt 1 26 Bảng 4.2 Tỷ lệ bạch cầu trung tính, đơn nhân và lâm ba cầu của thỏ đối chứng 27 Bảng 4.3 Tỷ lệ bạch cầu trung tính, đơn nhân và lâm ba cầu của mỗi thỏ nhóm 1 28 Bảng 4.4 Tỷ lệ bạch cầu trung tính, đơn nhân và lâm ba cầu của mỗi thỏ nhóm 2 29 Bảng 4.5 Kết quả ELISA đợt 2 31 Bảng 4.6 Kết quả PI của huyết thanh nguyên khi ELISA 32 Bảng 4.7 PI của thỏ I1 và thỏ I3 nhóm 1 32 Bảng 4.8 PI của thỏ II2 và thỏ II3 nhóm 2 32 Bảng 4.9 So sánh PI trong huyết thanh và PI sau khi thẩm tích 33 ix DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ của ba loại bạch cầu ở thỏ đối chứng qua các ngày 27 Biểu đồ 4.2 Trung bình của ba loại bạch cầu ở thỏ nhóm 1 qua các ngày 28 Biểu đồ 4.3 Trung bình của ba loại bạch cầu ở thỏ nhóm 2 qua các ngày 29 Biểu đồ 4.4 PI trung bình của thỏ nhóm 1và nhóm 2 vào ngày 20 và 30 33 Biểu đồ 4.5 PI của huyết thanh nguyên và PI của dịch thẩm tích 34 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc sản xuất nhiều loại kháng thể phục vụ cho công tác chẩn đoán hoặc dùng trong đo lường hàm lượng chất nội tiết đang trở nên cấp thiết. Kháng thể sau khi tinh sạch có thể được sử dụng làm bộ kít, chẳng hạn bộ kít trong phương pháp ELISA, đây là một trong những phương pháp xét nghiệm cho kết quả khá nhanh và chính xác. Hiện tại có nhiều phương pháp để chiết xuất kháng thể, hai phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sắc kí và phương pháp sử dụng chất ổn định như ammonium sulphate. Phương pháp sắc kí cho hàm lượng kháng thể cao tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi phải có trang thiết bị, nguyên liệu đắt tiền và kĩ thuật thực hiện phức tạp. Riêng với phương pháp sử dụng ammonium sulphate, ngoài việc cho ra hàm lượng kháng thể tương đối tốt, phương pháp này đơn giản và dễ thực hiện. Với mục đích tìm hiểu về kỹ thuật cũng như hiệu quả của phương pháp sử dụng chất ổn định ammonium sulphate trong chiết xuất kháng thể, được sự cho phép của Khoa Chăn nuôi – Thú y cùng với sự hướng dẫn của BSTY. Nguyễn Kiên Cường và PGS.TS. Trần Thị Dân chúng tôi đã thực hiện đề tài “Thử nghiệm chiết xuất kháng thể sau khi tiêm vaccine dịch tả heo cho thỏ”. 1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1. Mục tiêu Áp dụng kỹ thuật tách chiết kháng thể từ thú thí nghiệm. 1.2.2. Yêu cầu Tiêm các liều vaccine dịch tả heo cho thỏ thí nghiệm. Thu nhận huyết thanh từ thỏ thí nghiệm. Li trích kháng thể bằng ammonium sulphate và bao thẩm tích. 2 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 2.1.1. Kháng nguyên 2.1.1.1. Định nghĩa Có thể tạm hiểu kháng nguyên là những chất có đặc tính như sau: - Tính sinh miễn dịch: khả năng kích thích cơ thể có một đáp ứng miễn dịch. - Tính đặc hiệu: khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể trong miễn dịch dịch thể. Riêng trong miễn dịch trung gian qua tế bào, kháng nguyên có khả năng kết hợp đặc hiệu với các thụ thể trên bề mặt lympho T mẫn cảm. 2.1.1.2. Khái niệm epitop Epitop là những cấu trúc trên bề mặt của phân tử kháng nguyên, và có khả năng kích thích tạo kháng thể chuyên biệt. Epitop có 2 đặc tính:  Tính kháng nguyên: là đặc tính của một epitop có cấu trúc ba chiều liên kết bổ sung với phần cấu trúc ba chiều của phân tử kháng thể. Phần cấu trúc này của phân tử kháng thể hoặc của thụ thể được gọi là paratop.  Tính miễn dịch: epitop gây ra một đáp ứng miễn dịch trong một cơ thể. Hình 2.1: Kháng nguyên (http://usandthings.blogspot.com/2007_06_01_a rchive.html) 3 Nếu kháng nguyên là protein thì kích thước của một epitop kháng nguyên vào khoảng 5 – 10 acid amin. Một phân tử kháng nguyên có thể có một hoặc nhiều epitop. Số lượng epitop phụ thuộc vào kích thước của phân tử kháng nguyên và thường có khoảng 1 epitop cho mỗi 5 kDa. 2.1.2. Kháng thể 2.1.2.1. Định nghĩa Kháng thể được gọi là globulin miễn dịch (Ig = immunoglobulin). Ở người có 5 lớp Ig gồm IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Ở động vật tùy từng loài: cá chép chỉ có IgG; ở loài nhai lại có IgA, IgM và IgG; ở gà ngoài IgA, IgM và IgG còn có IgY; IgY không tương ứng với loại nào trên người (dẫn liệu Lê Văn Hùng, 2002). Nhìn chung các Ig đều có chung đặc điểm: các Ig đều là protein hình cầu. 2.1.2.2. Cấu trúc của một phân tử immoglobulin Mỗi phân tử Ig đều có hai chuỗi polypeptide nặng kí hiệu là chuỗi H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ ký hiệu L (light chain). Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp Ig là ở chuỗi nặng. Các chuỗi H hoặc L trên cùng một phân tử kháng thể bao giờ cũng giống nhau hoàn toàn từng đôi một. Các chuỗi được nối với nhau bằng những cầu nối disulfua (-S-S-).  Chuỗi nhẹ Chuỗi nhẹ có trọng lượng khoảng 22.000 Da, có thể phân biệt hai týp chuỗi nhẹ khác nhau đó là týp kappa (κ) và týp lamda (λ). Hai chuỗi này có Hình 2.2: Cấu trúc phân tử kháng thể (http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Chor ismate5.html) [...]... 3.4.1.1 Tiêm vaccine cho th Vaccine d ch t heo c a NAVETCO m i l tiêm 10 li u S d ng 2ml dung d ch pha vaccine, như v y m t li u có dung tích là 0,2ml (li u tiêm cho heo) Sau khi l y vaccine vào xi lanh, sát trùng v trí tiêm và th c hi n ư ng tiêm dư i da cho th 3.4.1.2 B trí thí nghi m t 1: Th li u tiêm vaccine và l y huy t thanh xét nghi m ELISA Trong t 1 này s d ng 3 th , ti n hành tiêm vaccine... hoàn heo Virus không gây b nh tích t bào trên t bào nuôi c y 2.4 VACCINE D CH T HEO 2.3.1 Vaccine th h m i Bao g m vaccine tái t h p E2 (gp55) và vaccine DNA mã hóa E2… Các vaccine này ngoài vi c b o h heo ch ng b nh DTH, còn phân bi t ư c heo có kháng th do nhi m b nh hay do tiêm vaccine d a trên s phát hi n kháng th kháng protein Erns hay NS3 (vaccine ti u ph n) hay E2 (vaccine tái t h p) Các kháng. .. tiêm li u lư ng gi ng nhau Mũi m n c m có li u g p ôi li u tiêm cho heo và mũi nh c l i tiêm li u g p 4 Th i gian theo dõi là 55 ngày 19 B ng 3.1: Th i i m l y máu và tiêm vaccine t1 Ngày kh o sát L y máu Tiêm vaccine (ml) 1 X 0,4 30 X 0,8 55 X _ X: L y máu trư c khi tiêm vaccine t 2: Xem xét kh năng áp ng mi n d ch, ki m tra hàm lư ng kháng th và ng th i ti n hành tinh chi t kháng th Th i gian theo... c u M i l n l y máu cách nhau 5 ngày Sau khi l y máu ti n hành tiêm vaccine Th không ư c tiêm vaccine tiêm cho heo) , l n hai m i th nhóm th 1, l n u m i th i ch ng ư c tiêm 0,4 ml (g p ôi li u ư c tiêm 0,8 ml (li u g p b n l n) và ba l n sau m i th ư c tiêm 1,6 ml (li u g p tám l n) nhóm 2, cách b trí tiêm vaccine và l y máu cũng tương t nhóm 1 nhưng li u lư ng vaccine thì g p ôi nhóm 1 L n l y máu... nh e Hi u ng c ng l c kháng nguyên N u cùng m t lúc gây m n c m nhi u lo i kháng nguyên cho con thú, kháng th c hi u ư c sinh ra tương ng v i m i lo i kháng nguyên; tuy nhiên, lư ng kháng th ít nh t ngang b ng ho c nhi u hơn so v i khi kháng nguyên ó tác d ng m t mình Hi n tư ng này là s c ng l c kháng nguyên hay c ng kích thích kháng nguyên ây là cơ s khoa h c cho các nhà ch t o vaccine a giá Tuy nhiên,... Nguyên Vân Anh (2005) th nghi m s n xu t kháng huy t thanh kháng vi khu n E coli M t vài k t qu ghi nh n c a tác gi là: phát hi n ư c kháng th trong kháng huy t thanh sau khi tiêm mũi m n c m 14 ngày b ng ph n ng ngưng k t nhanh trên phi n kính; hi u giá kháng th c a huy t thanh sau khi t a và th m tích gi m áng k so v i ban u Nguy n Th Kim Hi n (2006) tinh ch kháng nguyên b m t virus viêm gan B b ng... phát hi n kháng th kháng protein E2 do vi n nghiên c u Thú Y Hà Lan s n xu t B kít này phát hi n kháng th kháng protein E2 (gp55) c a virus DTH theo cơ ch c nh tranh tr c ti p v i kháng th th ơn dòng th hai (mAb 2) có g n men HRPO Kháng ơn dòng th nh t (mAb 1) ư c ph lên áy gi ng óng vai trò là kháng th b y kháng nguyên Kháng nguyên dùng trong ph n ng này là protein E2 (gp55) ư c s n xu t theo phương... NG C A TH KHI TIÊM VACCINE t1 t này, m c tiêu là xem xét kh năng áp ng c a th khi tiêm vaccine v i kho ng cách dài ngày, và l y huy t thanh ki m tra hàm lư ng kháng th b ng xét nghi m ELISA T ng s m u huy t thanh xét nghi m là 8 m u, sau khi ki m tra t t c 8 m u u âm tính B ng 4.1: K t qu ELISA Th Ngày Th 1 Th 2 Th 3 - - Ch t 1 30 55 -: âm tính Trong t1 t 1, kho ng cách gi a hai l n tiêm vaccine là... kháng th này ư c g i là kháng th ánh d u (marker antibodies) (Koenen và ctv,1999) 2.3.2 Vaccine ch t Ưu i m c a vaccine này là m c d ch ch m, kém và th i gian b o h ch an toàn nhưng có như c i m là áp ng mi n ư c vài tháng ngay c sau khi tiêm nh c l i nhi u l n 2.3.3 Vaccine như c c Vaccine này t o ư c mi n d ch cao, mi n d ch này thư ng phát tri n trong vòng 4 – 7 ngày sau tiêm phòng và kéo dài vài... v di truy n là v n xu t vaccine (d n li u Nguy n Ti n Dũng, 2002) 11 như c c chưa t c n ư c chú tr ng trong s n Hi n nay, nư c ta ang s d ng m t vài lo i vaccine DTH như sau: B ng 2.2: M t s lo i vaccine DTH s d ng t i Vi t Nam hi n nay Tên thương m i c a vaccine DTH dùng s n xu t (Nư c s n xu t) Th i i m tiêm l n Ch ng virus vaccine Cách s n xu t u (heo con t nái vaccine ã tiêm phòng, vùng e d a) . xuất kháng thể sau khi tiêm vaccine dịch tả heo cho thỏ . 1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1. Mục tiêu Áp dụng kỹ thuật tách chiết kháng thể từ thú thí nghiệm. 1.2.2. Yêu cầu Tiêm các liều vaccine. của thỏ sau khi tiêm vaccine dich tả, đề tài được tiến hành 2 đợt. Đợt 1 thử liều tiêm vaccine và xét nghiệm huyết thanh bằng phương pháp ELISA, tất cả các mẫu sau khi xét nghiệm đều cho kết. nhóm 1, thỏ 1 và thỏ 3 cho kết quả dương tính còn thỏ 2 cho kết quả âm tính vào ngày 20 và 30 (thỏ 3 vào ngày 20 nghi ngờ có kháng thể trong huyết thanh). Ở nhóm 2, thỏ 2 và thỏ 3 cho kết quả