- Lấy 1 giọt máu nhỏ lên một đầu của lame A. Dùng ngón cái và ngón trỏ của tay trái cầm lame A; ngón cái và ngón trỏ của tay phải cầm lame B (chọn lame B có cạnh thật nhẵn). Gạt nhẹ cạnh của lame B tiếp xúc với mặt trên của lame A ở sát phía trước giọt máu một góc 30 – 45o. Kéo lame B lui lại cho chạm giọt máu, khi máu đã tan ra trên cạnh lame B thì đẩy nhẹ và liên tục lame B trên mặt lame A cho vết phết lan đều. Vết phết kính tốt phải mỏng và đều.
- Để vết phết khô tự nhiên trong không khí và cố định vết phết bằng cồn methanol. Sau khi cồn khô nhúng vết phết vào dung dịch eosin trong vòng 10 giây rồi lấy ra để khô tự nhiên. Tiếp tục nhúng vết phết vào dung dịch xanh methylen trong vòng 1 phút, sau đó lấy ra rửa nước liền và để tiêu bản khô trong không khí.
- Sau khi tiêu bản nhuộm đã khô. Để tiêu bản lên kính hiển vi, điều chỉnh kính và ánh sáng cho vừa phải, quan sát toàn bộ tiêu bản ở vật kính 10. Nhỏ một giọt dầu cedar lên một góc của vết phết máu và xoay qua vật kính 100. Chuyển dịch tiêu bản theo hình zít zát, quan sát và đếm từng loại bạch cầu. Từđó lập công thức bạch cầu.
3.4.3.Thu nhận huyết thanh và kháng thể
Đợt 1 máu được lấy vào các ngày 1, 30 và 55 để xét nghiệm ELISA.
Đợt 2 máu được lấy vào các ngày 1, 5, 10, 15, 20 và 30 để lập công thức bạch cầu, các ngày 1, 20 và 30 lấy huyết thanh để xét nghiệm ELISA. Riêng ngày 30, lượng máu lấy nhiều nhất (40 ml) vì huyết thanh được đem đi tinh chiết kháng thể.
Cách lấy máu:
-Trước khi lấy máu tráng ống bằng nước muối sinh lí 0,9%.
- Cố định thỏ, cạo sạch lông và sát trùng vùng muốn lấy máu. Lấy máu ở động mạch giữa tai.
23
-Sau khi lấy máu xong dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống. -Cho sodium azide (NaN3) vào ống.
Vsodium azide = 0,05% Vmáu (V: thể tích) -Bảo quản 24h ở 4oC.
- Sau khi bảo quản qua đêm máu được tách thành 2 lớp, đem ly tâm với vận tốc 3000 vòng / phút. Lấy phần huyết thanh nổi phía trên và bỏ phần cặn phía dưới.
-Huyết thanh (HT) được lấy 1ml để xét nghiệm ELISA. Riêng ngày 30 của đợt 2, huyết thanh được chia thành hai phần: phần 1 (1 ml) đem đi xét nghiệm ELISA và phần 2 được sử dụng để tinh chiết kháng thể.
Sơđồ 3.1: Xử lý huyết thanh
3.4.3.1. Tách kháng thể bằng ammonium sulphate bão hòa
-Cho vào mỗi chai đựng huyết thanh một lượng PBS 1X gấp ba lần lượng huyết thanh.
-Tủa huyết thanh thỏ bằng dung dịch ammonium sulphate 100 %. Thể tích ammonium sulphate 100 % bằng tổng thể tích huyết thanh và PBS.
-Huyết thanh thỏ và PBS 1X được để trong nước đá bào trên máy khuấy từ.
-Nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 100 % vào dung dịch huyết thanh và PBS 1X, sau khi nhỏ xong để thêm khoảng 45 – 60 phút.
- Bảo quản qua đêm ở nhiệt độ 4 oC. -Li tâm tách kết tủa.
-Rửa tủa 3 lần bằng dung dịch (NH4)2SO4 45 %.
- Cho vào ống 50 ml, giữ tủa trong ammonium sulphate 45 % ở 4 oC. HT
ELISA HT kết tủa,
24
Hình 3.3: Thực hiện thẩm tích
3.4.3.2. Thu hồi kháng thể Kháng thể tủa trong ammonium sulphate 45 % được thu hồi bằng phương pháp thẩm tích.
- Chuẩn bị bao thẩm tích
Bao thẩm tích được cắt ra và rửa qua nước cất, sau đó cho vào cốc nước cất chứa 2 mM EDTA. Đun 3 giờ rồi rửa lại bằng nước cất cho sạch EDTA. Cho vào bình chứa cồn 30 oC, bảo quản ở 4 oC.
-Thực hiện thẩm tích
Cho kháng thể tủa trong ammonium sulphate 45% vào bao thẩm tích, dùng kẹp kẹp 2 đầu bao thẩm tích lại và đặt bao thẩm
tích vào dung dịch PBS 4 – 5 giờ ở 4 oC. Thực hiện 4 lần thẩm tích như trên sau đó thu kháng thểđể xác định hiệu giá. Tổng lượng dung dịch đệm là 6 lít.
3.4.3.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể
Các mẫu huyết thanh được mang đến Trung Tâm Thú Y Vùng thành phố Hồ Chí Minh để xét nghiệm ELISA.
Hiện nay, Trung Tâm Thú Y Vùng sử dụng bộ kít ELISA (Ceditest) phát hiện kháng thể kháng protein E2 do viện nghiên cứu Thú Y Hà Lan sản xuất.
Bộ kít này phát hiện kháng thể kháng protein E2 (gp55) của virus DTH theo cơ chế cạnh tranh trực tiếp với kháng thể đơn dòng thứ hai (mAb 2) có gắn men HRPO. Kháng thể đơn dòng thứ nhất (mAb 1) được phủ lên đáy giếng đóng vai trò là kháng thể bẫy kháng nguyên. Kháng nguyên dùng trong phản ứng này là protein E2 (gp55) được sản xuất theo phương pháp tái tổ hợp với Baculovirus nuôi trên môi trường tế bào côn trùng.
25
Hình 3.3: Xét nghiệm ELISA
(http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1/ch5_elisa.jpg) Lượng kháng thể kháng protein E2 được tính toán dựa vào phần trăm ức chế (PI – percent inhibition) theo công thức sau:
PI = 100 - × 100 Ý nghĩa của phần trăm ức chế
PI < 30 % không có kháng thể trong mẫu thử
PI = 31 % - 50 % không kết luận (nghi ngờ có kháng thể trong mẫu thử) PI > 50 % có kháng thể trong mẫu thử