TỔNG QUAN
Tổng quan loài Ngọc cẩu
Loài Ngọc cẩu hay còn được gọi là nấm tỏa dương, cây cu chó, cây dó đất, hoa tuyết sơn, pì lìn có phân loại khoa học như sau:
Danh pháp hai phần: Balanophora laxiflora Hemsley.
Ngọc cẩu là loại cây cỏ trông như một cây nấm, màu đỏ nâu sẫm, sống một năm hay nhiều năm, ký sinh trên rễ cây khác, thường là cây gỗ lớn trong rừng sâu[1,2] Cấu tạo bởi một cán hoa lớn, trên mang hoa dày đặc, có mo bao bọc, màu tím, mùi hôi Cán hoa nạc và mềm, dạng thay đổi, sần sùi, không có lá Hoa đơn tính khác gốc, họp thành cụm hoa dạng bông nạc Cụm hoa đực hình trụ, dài 10-15cm, ở gốc có một vài lá bắc, bao hoa xẻ nhiều thùy (4-7), nhị có bao phấn hình móng ngựa Hoa cái hình bầu dục thuôn, dài 2-3cm, không có bao hoa, trên cụm hoa có nhiều phần phụ hình chùy không sinh sản [1,2] Mùa ra hoa tháng 11-12(và chỉ khi có hoa mới dễ phát hiện), sinh sản vô tính (bằng cách đẻ nhánh).
Hình 1.1 Cây Ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsley.) (Ảnh chụp tại Tuyên
Ngọc cẩu phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và Australia
[2] Ngọc cẩu sinh trưởng và phát triển tốt ở trong các khu rừng ẩm, nằm trên độ cao 1500m so với mực nước biển và thường ký sinh trên rễ của các cây lá rộng thường xanh thuộc các họ Leguminosae, Araliaceae và Fagaceae Ở tỉnh Vân Nam, Trung Quốc, Ngọc cẩu thường được tìm thấy trên rễ của cây Sophora davidii (Cha) Komarov ex Pavol [3]. ỞViệt Nam, nấm được tìm thấy nhiều nhất tại các tỉnh miền núi phía Bắc như Tam Đảo, Tuyên Quang, Yên Bái, Lào Cai, Cao Bằng, Hòa Bình, Sơn La, Sapa, trên đỉnh dãy Hoàng Liên Sơn Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam
(1996) với cấp đánh giá "sẽ nguy cấp" (V), không xâm hại, khai thác các cây còn sót lại ở các nơi phân bố [1].
1.1.2 Ứng dụng trong y học cổ truyền
Trong y học dân gian, Ngọc cẩu được sử dụng để tăng cường sinh lý, bổ thận tráng dương, ích tinh huyết, mạnh tình dục, bổ tỳ vị, nhuận tràng, thông tiểu, chủ trị yếu sinh lý, liệt dương, lãnh cảm, đau lưng, mỏi gối, biếng ăn [1,2,4].
Từ xưa tới nay, nấm Ngọc cẩu đã được người dân tộc Dao đỏ (Hà Giang,Yên Bái) sử dụng như một vị thần dược trong điều trị các bệnh lý liên quan tới xương khớp như đau lưng, tê tay chân, mỏi gối và những chứng bệnh liên tới tới sinh lý khác Ở Malaysia toàn cây Ngọc cẩu được dùng làm thuốc kích dục [2].
Ngọc cẩu thường được dùng dưới dạng thuốc rượu: vị tỏa dương thái mỏng ngâm rượu với1 phần tỏa dương, 5 phần rượu 35-40 o , ngâm trên một tháng mới sử dụng Rượu có màu đỏ sẫm, vị hơi đắng, chát Có thể thêm đường hay mật ong cho dễ uống Ngày uống 2 lần vào trước bữa ăn, mỗi lần một chén con chừng 30ml [1].
Thành phần hóa học có trong cây Ngọc cẩu rất đa dạng, chủ yếu là các hợp chất tannin, terpenoid, flavonoid, phenylpropanoid, phenolic và các dẫn xuất glycosid của chúng Hợp chất phenolic như dẫn xuất acid cinnamic là một trong các thành phần đặc trưng của loài B.laxiflora [3, 5].
- Các hợp chất thuộc nhóm (C6 - C3)n (phenylpropanoid)
Hình 1.2 Cấu trúc các hợp chất hóa học phenylpropanoid được tách ra từ loài
Ngọc cẩu Bảng 1.1 Các hợp chất hóa học phenylpropanoid được tách ra từ loài Ngọc cẩu
STT Tên chất Tài liệu tham khảo
8 Coniferin (= 4-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-2- [3] [6] methoxyphenyl-β-D-glucopyranoside)
- Các hợp chất terpenoid: Các hợp chất triterpenoid năm vòng thuộc các khung lupan, oleanan và ursan.
Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất terpenoid được tách ra từ loài Ngọc cẩu Bảng 1.2 Các hợp chất terpenoid được tách ra từ loài Ngọc cẩu
STT Tên chất Tài liệu tham khảo
- Tannin: các dẫn xuất acid cinnamic là thành phần đặc trưng của loài B.laxiflora.
Hình 1.4 Cấu trúc các hợp chất tannin được tách ra từ loài Ngọc cẩu Bảng 1.3 Các hợp chất tannin được tách ra từ loài Ngọc cẩu
STT Tên chất Tài liệu tham khảo
- Một số hợp chất khác
Hình 1.5 Cấu trúc một số hợp chất khác được tách ra từ loài Ngọc cẩu Bảng 1.4 Một số hợp chất khác được tách ra từ loài Ngọc cẩu
STT Tên chất Tài liệu tham khảo
Nhiều nghiên cứu về khả năng chống oxi hóa của các cao chiết, các hợp chất phân lập từ Ngọc cẩu đã được thực hiện cho kết quả đáng mong đợi.
Năm 2008, Kai-Chung Cheng cùng cộng sự đã nghiên cứu về khả năng chống oxi hóa của các cao chiết Ngọc cẩu (cao tổng, cao EtOAc, cao n-BuOH, cao nước) thông qua khả năng tiêu diệt gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy cao chiết EtOAc và n-BuOH có khả năng diệt gốc tự do DPPH mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 5,6 và 5,7 (μg/ml), tốt hơn chất so sánh là (+)-catechin với giá trị IC50 là 11,7 (μg/ml) [20].
Một nghiên cứu khác của She và cộng sự về khả năng chống oxi hóa của các hợp chất phân lập được từ loài Ngọc cẩu thông qua nghiên cứu về khả năng tiêu diệt gốc tự do DPPH với hợp chất đối chứng là acid ascorbic cho thấy các tannin có thể thủy phân từ 36-42 và 45, 46 có hoạt tính tốt hơn hẳn các hợp chất phenolic khác Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng những hợp chất có nhiều nhóm OH phenol liền kề (nhóm galloyl, pyrogallol hoặc catechol) cho khả năng tiêu diệt gốc tự do cao hơn [3] (bảng 1.5).
Bảng 1.5 Hoạt tính thu gom gốc tự do DPPH của một số hợp chất được tách ra từ loài Ngọc cẩu
Nhúm chất Hợp SC 50 (àM) Nhúm chất Hợp SC 50 (àM) chất chất
Phenolic 3 15,7 ± 0,3 46 10,4 ± 0.2 acid 47 10,7 ± 0,5 Đối chứng Acid 10,5 ± 0,2 ascorbicNăm 2010, Shang-Tse Ho và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống oxi hóa từ hoa đực và hoa cái của loài Ngọc cẩu Chiết xuất từ hoa đực cho thấy hiệu quả tiêu diệt gốc tự do DPPH và gốc superoxide cao hơn so với chiết xuất từ hoa cái [5] (bảng 1.6).
Bảng 1.6 Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết methanol từ hoa đực và hoa cái của loài Ngọc cẩu
Khi nghiên cứu thêm về khả năng chống oxi hóa từ hoa đực, khả năng loại bỏ gốc tự do được thực hiện với cao tổng, cao EtOAc, cao n-BuOH và cao nước. Kết quả cho thấy cao chiết EtOAc của loài Ngọc cẩu có khả năng diệt gốc tự do DPPH tương đương với chất so sánh là (+)-catechin với giá trị IC 50 lần lượt là 3,0 (μg/ml) và 2,7 (μg/ml); khả năng diệt gốc superoxide cao hơn so với (+)-catechin với giá trị IC 50 lần lượt là 4,1 (μg/ml) và 9,0 (μg/ml) Khả năng chống oxi hóa tốt của cao chiết EtOAc được cho là phụ thuộc vào tổng hàm lượng hợp chất phenolic có trong đó Thực nghiệm xác định tổng hàm lượng phenolic trong từng cao chiết đã chứng minh rõ điều đó với tổng hàm lượng phenol giảm theo thứ tự sau: cao EtOAc (460,0mg GAE/g)> cao tổng (363,6mg GAE/g)> cao n-BuOH (310,2mg GAE/g)> cao nước (165,6mg GAE/g) [5].
Chiết xuất từ hoa Matricaria chamomilla và Jasminum sambac đã được khẳng định có hoạt tính chống oxy hóa tốt, là hai loài hoa phổ biến được sử dụng làm trà thảo mộc trên thị trường [21, 22] Theo kết quả được báo cáo bởi Huang và cộng sự, các chiết xuất từ hoa của M chamomilla và J sambac được phát hiện có khả năng loại bỏ gốc DPPH đáng kể với giá trị IC50 tương ứng là 62,8 và > 100μg/ml [21] Khi so sánh với hai chiết xuất hoa này, khả năng tiêu diệt gốc DPPH của chiết xuất thô từ hoa đực của B laxiflora mạnh hơn của M. chamomillam và J sambac Những kết quả này ngụ ý rằng có nhiều chất chống oxy hóa có trong hoa đực của B laxiflora, đặc biệt là trong phần cao chiết EtOAc, hoạt tính chống oxy hóa của B laxiflora có thể so sánh với hoạt tính chống oxy hóa của các loài hoa có sẵn trên thị trường với khả năng trung hòa các gốc tự do cao.
Khi nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của một số hợp chất phân lập từ Ngọc cẩu, các, hợp chất 37 và 43 (cả hai đều thuộc về tannin có thể thủy phân) là hai chất chống oxy hóa tốt nhất Khả năng diệt gốc tự do DPPH và gốc superoxide của hai chất này hoàn toàn cao hơn so với (+) - catechin Kết quả này cũng ngụ ý rằng gốc hexahydroxydiphenoyl (HHDP) đóng một vai trò quan trọng để tăng cường các hoạt động chống oxy hóa [5] (bảng 1.7).
Bảng 1.7 Hoạt tính chống oxi hóa của một số hợp chất phân lập từ loài Ngọc cẩu
Hàm lượng (mg/g của IC50 (àM) Hợp chất dịch chiết methanol) DPPH Superoxide
Năm 2016, Trần Thị Hằng và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính của các cao chiết cây Ngọc cẩu và cũng nhận thấy các cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao tương đương với acid ascorbic và quercetin, cao ethyl acetate có hoạt tính mạnh nhất [23].
Năm 2011, Wen Fei Chiou cùng cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu về khả năng chống viêm của các chất tách ra từ loài Ngọc cẩu thông qua khả năng ức chế quá trình sản sinh NO gây viêm Trong đó chất isolariciresinol (14) và ethyl caffeate (5) có khả năng ức chế rất mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 0,81 và 7,29 (μg/ml) và có khả năng kháng viêm mạnh hơn chất so sánh AMG (IC50
Tổng quan về các hợp chất phenolic
1.2.1 Về hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất phenolic
Phenolic là một nhóm lớn với hơn 8.000 hợp chất khác nhau, là sản phẩm của sự trao đổi chất thứ cấp ở thực vật [29] Tất cả các hợp chất phenolic đều có cấu trúc hóa học chung gồm một hay nhiều vòng thơm với một, hoặc nhiều nhóm hydroxyl Các hợp chất phenolic nổi tiếng thường được biết đến như các acid phenolic, coumarin, flavonoid, lignan, stilben, tannin, được tìm thấy nhiều ở rau, trái cây, ngũ cốc, các loại đậu góp phần tạo lên vị, màu sắc trong nhiều loại thực phẩm [29] (bảng 1.8).
Bảng 1.8 Phân loại các nhóm hợp chất phenolic và nguồn thu nhận từ thực vật
Các hợp chất phenolic Nguồn thực vật
Acid Acid Mơ, việt quất, cà rốt, ngũ cốc, lê,
Phenolic hydroxycinnamic anh đào, trái cây họ cam quýt, hạt có dầu, đào, mận, rau bina, cà chua, cà tím
Acid Quả việt quất, ngũ cốc, nam việt quất, hạt có hydroxybenzoic dầu
Anthocyanin Quả việt quất đen, quả lý chua đen và đỏ, quả việt quất, anh đào, chokecherries, nho,
Flavanol Táo, việt quất, nho, hành tây, rau diếp
Flavanone Trái cây họ cam quýt
Flavonol Táo, đậu, quả việt quất, kiều mạch, nam việt quất, endive, tỏi tây, rau diếp, hành tây, ô liu, tiêu, cà chua
Flavone Trái cây họ cam quýt, cần tây, rau mùi tây, rau bina, rutin
Tannin Condensed Táo, nho, đào, mận, măng cụt, lê
Hydrolyzable Lựu, quả mâm xôi Phenolic Alk(en)ylresorcinol Ngũ cốc khác Arbutin Lê
Avenanthramide Yến mạch Capsaisinoid Tiêu
Coumarin Cà rốt, cần tây, trái cây họ cam quýt, mùi tây, rau mùi tây
Lignan Kiều mạch, hạt lanh, hạt mè, lúa mạch đen, lúa mì
Các hợp chất phenolic thực vật đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm nhờ tác dụng chống oxi hóa, phòng ngừa ung thư và các bệnh liên quan đến tim mạch Nhiều hợp chất phenolic được chứng minh là chất chống oxy hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và các carotenoid [30, 31].
Các nghiên cứu về hóa học, dược lý học, lâm sàng đã phần nào lý giải được mối liên quan giữa sức khỏe con người và việc tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm giàu hoạt chất phenolic thiên nhiên [32].
Có nhiều acid phenolic khác nhau được tìm thấy trong tự nhiên, có thể được chia thành hai loại: dẫn xuất acid benzoic (chẳng hạn như acid galic) và các dẫn xuất acid cinnamic (bao gồm acid caffeic và acid ferulic) Các acid cinnamic phổ biến hơn các acid benzoic Các acid hydroxycinnamic được cho là có hiệu quả hơn so với các acid hydroxybenzoic, có thể do tác dụng ổn định của gốc aryloxy qua liên kết của vòng phenyl với nhánh –CH = CH – COOH [31].
Ngoài khả năng chống oxy hóa cao thường được biết đến, các hợp chất phenolic tự nhiên còn cho thấy tác dụng phòng ngừa ung thư đáng kể Ví dụ, chiết xuất từ quả mọng như mâm xôi, việt quất, nam việt quất, dâu tây và các polyphenol phân lập từ dâu tây bao gồm anthocyanin, kaempferol, quercetin, este của acid coumaric và acid ellagic được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào khối u ở miệng (KB, CAL-27), vú (MCF-7), ruột kết (HT-29, HCT-116) và tuyến tiền liệt (LNCaP, DU-145) [33, 34] Ross và cộng sự đã chứng minh hoạt tính chống tăng sinh của chiết xuất quả mâm xôi trong tế bào ung thư cổ tử cung ở người (Hela) chủ yếu liên quan đến ellagitannin [35].Nghiên cứu của McDougall và cộng sự cũng cho thấy thành phần quan trọng liên quan đến việc ức chế sự phát triển tế bào ung thư của các chiết xuất từ quả mọng là ellagitannin, trong khi hoạt tính chống tăng sinh của Linh chi chủ yếu là do vai trò của procyanidins [36] Một hoạt chất phenolic khác có trong đậu nành là isoflavone genistein đã được chứng minh có thể ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm ung thư bạch cầu, hạch, tuyến tiền liệt, vú, phổi và các tế bào ung thư cổ [37] McCann và cộng sự nghiên cứu về tác dụng của chiết xuất giàu phenolic từ táo đối với các giai đoạn quan trọng của quá trình sinh ung thư đại trực tràng, kết quả cho thấy chiết xuất từ táo gây ảnh hưởng có lợi trên cả ba giai đoạn sinh ung thư [38] Nhiều hợp chất flavonoid có trong cam quýt đã được chứng minh có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thư bạch cầu HL-60 [39].Tác dụng ức chế sinh trưởng của một số polyphenol như flavon (apigenin, baicalein, luteolin và rutin), flavanones (hesperidin và naringin) và các lignan trong Vừng (sesaminol, sesamin và episesamin) đã được chúng minh có tác dụng chống lại các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm ruột kết [40], tuyến tiền liệt [41], bệnh bạch cầu [42], gan [43], dạ dày, cổ tử cung, tuyến tụy và vú [44].
1.2.2 Về hóa học và hoạt tính sinh học của acid caffeic và các dẫn xuất caffeate tự nhiên.
1.2.2.1 Về hóa học và hoạt tính sinh học của acid caffeic
Acid caffeic (CA) là một chất có trong hầu hết các loại thực vật, bao gồm rau, trái cây, thảo mộc, hạt cà phê và gia vị từ thực vật.
CA được tìm thấy trong nhiều họ thực vật khác nhau, bao gồm họ Hoa tán (Umbelliferae), Thập tự (Cruciferae), Bầu bí (Cucurbitaceae), Rau răm (Polygonaceae), Cúc (Compositae), Hoa môi (Labiatae), Cà (Solanaceae), Tai hùm (Saxifragaceae), Kim ngân (Caprifoliaceae) và Chè (Theaceae) [45]. ỞViệt Nam, CA đã được tách chiết từ các cây thảo dược dùng nhiều trong các bài thuốc y học cổ truyền như: cây Râu mèo có tác dụng điều trị bệnh sỏi thận, tăng bài tiết và hạ đường huyết [46], cây Cỏ lào đỏ được sử dụng để điều trị một số bệnh viêm nhiễm và chấn thương chảy máu [47], cây Tía tô điều trị cảm sốt và giải độc do thức ăn [48], tác dụng giải cảm, sát trùng và giảm đau tại chỗ của cây Hương nhu trắng [49]; rễ của cây Cà lác được dùng làm thuốc chữa đau dạ dày, phong thấp, lợi tiêu hóa; ở Ấn Độ Cà lác được sử dụng như là một loại thuốc điều trị bệnh thấp khớp [50]; hoa của cây Bông trang được người Ấn Độ sử dụng như thuốc an thần, chống ung thư [51] CA còn được tìm thấy trong hoa, lá và chồi của cây thảo dược Sơn trà để hỗ trợ điều trị các bệnh tim mạch [50] trong tinh dầu của hoa cây Đậu chổi [52], trong hạt của cây Bạc thau tím giúp hạ huyết áp và chống co thắt [50], trong tinh dầu cây Tiểu hồi [53] và trong rễ cây Ngưu bàng giúp lợi tiểu [54].
Các nghiên cứu hiện đại đã chứng mình nhiều hoạt tính đáng quý của acid caffeic như:
Chống oxy hóa: Tương tự như các chất chống oxy hoá khác, CA cũng có thể làm chậm quá trình lão hóa cơ thể Maurya và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt dụng chống oxy hóa của acid caffeic và acid ferulic, kết quả cho thấy chúng có khả năng tiêu diệt một số gốc tự do NO, O 2 , ABTS, DPPH, OH [55] Bằng thử nghiệm tương đương với các chất chống oxy hóa tiêu chuẩn như BHA, BHT alpha-tocopherol (vitamin E) và trolox, Gỹlỗin và cộng sự đó chỉ ra rằng ở nồng độ 10 và 30μg/mL, acid caffeic có thể ức chế lần lượt là 68,2 và 75,8% quá trình peroxy hóa lipid Trong khi đó ở nồng độ 20μg/mL chất chống oxy hóa tiêu chuẩn như BHA, BHT, α-tocopherol và trolox có khả năng ức chế lần lượt là 74,4, 71,2, 54,7 và 20,1% đối với quá trình peroxy hóa lipid CA thể hiện tiềm năng chống oxi hóa cao hơn các chất chống oxy hóa tiêu chuẩn [56].
Chống ung thư: Mặc dù chỉ là nghiên cứu sơ bộ, nhưng một số nghiên cứu cho thấy CA có thể làm chậm quá trình phát triển của ung thư Công bố của Jun Wang và cộng sự năm 2014 cho thấy các dẫn xuất CA ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, trong đó có ung thư ruột kết [57], ung thư ruột già cả ở in vivo và in vitro [58] Các nghiên cứu sơ bộ khác về vai trò của CA trong việc chống khối u đã đạt được những kết quả khác nhau và gần đây có nhiều kết quả hứa hẹn hơn. Một nghiên cứu năm 2010 đã xem xét tác động của CA lên các tế bào ung thư miệng và thấy rằng nó có hiệu quả cao trong việc tiêu diệt các tế bào ung thư miệng và không tiêu diệt các tế bào khỏe mạnh [59] Các nhà nghiên cứu kỳ vọng acid caffeic có thể là một phương pháp thay thế an toàn cho hóa trị liệu.
Viêm mạn tính: CA có tính chống viêm mạnh - đây là lý do vì sao nó có thể chống lại hoặc ngăn ngừa bệnh ung thư Một nghiên cứu vào năm 2013 chứng minh acid caffeic có thể ức chế mạnh các enzyme gây viêm [60].
Tiểu đường: Những nghiên cứu trên chuột đã chứng minh CA có thể chống lại một số biến chứng đái tháo đường Theo một nghiên cứu năm 2020 trên chuột mắc bệnh đái tháo đường cho thấy acid caffeic có thể làm tăng lượng insulin trong máu, hạ đường huyết [60].
Ngoài ra các thí nghiệm in vitro và in vivo đã chứng minh nhiều hoạt tính khác của CA và các dẫn xuất của nó, chẳng hạn như hoạt tính kháng khuẩn [62,63], hoạt tính kháng vi-rút [64, 65], chống xơ vữa động mạch [62,63], bảo vệ tim mạch [64, 66, 67], hoạt tính điều hòa miễn dịch [62], chống tăng sinh tế bào
[62, 68], hoạt tính bảo vệ gan [69] Do đó, các nghiên cứu sâu hơn về các khía cạnh hóa học và dược lý của CA và dẫn xuất của nó là cần thiết, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển một loại thuốc mới trong tương lai và từ đó mở rộng các khả năng điều trị.
1.2.2.2 Về hóa học và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất caffeate tự nhiên
Nhiều dẫn xuất caffeate tự nhiên đã được phân lập và nghiên cứu hoạt tính Methyl caffeate được tìm thấy trong nhiều loài thực vật như Solanum torvum [70], Polygonum amplexicaule [71], Prunus persica [72], Pharbitis purpurea [73] Năm 2012, Chandrasekhar Balachandran và cộng sư đã phân lập và đánh giá hoạt tính của methyl caffeate từ quả loài Solanum torvum Swartz Methyl caffeate chỉ cho thấy tác dụng trung bình với các dòng vi khuẩn, nấm được thử nghiệm Tuy nhiên methyl caffeate có hoạt tính chống lao tốt, như chống lại M tuberculosis (H 37 Rv) và M tuberculosis (Rif R ) với giá trị MIC ở 8μg/ml Kết quả cho thấy methyl caffeate có thể được khảo sát thêm trong chương trình khám phá thuốc liên quan đến bệnh lao [70] Nhiều nghiên cứu về hoạt tính của methyl caffeate cho thấy hoạt tính chống oxy hóa [74], chống kết tập tiểu cầu [75], hoạt tính chống tăng sinh đối với dòng tế bào ung thư cổ tử cung [76], ung thư phổi và bạch cầu [77].
Ethyl caffeate là este của acid caffeic và ethanol, được tìm thấy trong một số loài thực vật, cụ thể là Prunus yedoensis [78], Polygonum amplexicaule [79], và Ligularia fischeri [80] Đặc biệt, Ligularia fischeri là loài được trồng nhiều ở Đông Á và được sử dụng làm thuốc thảo dược Các tác dụng sinh học của ethyl caffeate được biết là có hoạt tính chống ung thư [80], chống viêm [81] và chống xơ hóa [82] Ngoài ra, nó có khả năng điều hòa huyết áp bằng cách ức chế enzym tổng hợp aldosterone [83].
Tổng quan về các dẫn xuất acid caffeic tổng hợp
1.3.1 Phương pháp tổng hợp một số dẫn xuất của acid caffeic
Trong thực vật, trái cây và rau quả, nhiều acid hydroxycinnamic được tìm thấy, bao gồm cả acid caffeic, acid p-coumaric và acid ferulic [93] Trong số các acid hydroxycinnamic này thì CA được phân bố rộng rãi hơn cả, sự quan tâm ngày càng tăng tập trung vào CA vì hoạt tính sinh học phong phú của nó, bao gồm các hoạt tính chống oxy hóa [56], kháng khuẩn và kháng u [93] Dẫn xuất
CA thu hút nhiều sự quan tâm hơn các chất chống oxy hóa tổng hợp do ít gây độc cho cơ thể con người [94] Tuy là một chất chống oxy hóa hiệu quả, nhưng độ hòa tan thấp của CA trong môi trường không phân cực hạn chế ứng dụng của CA
[21] Kumar và Kanwar báo cáo rằng các este của acid hydroxycinnamic có khả năng hòa tan trong dung môi không phân cực mạnh hơn acid hydroxycinnamic
[95] Các dẫn xuất của CA gồm các alkyl este và amid cũng được biết là có hoạt tính chống viêm [38, 39], chống oxy hóa [40, 41], kháng u [9, 10], kháng khuẩn
[25, 26], ngăn ngừa xơ vữa động mạch và các bệnh tim mạch khác [40, 47, 96]. Các amid và este của acid caffeic đã được tổng hợp bằng một số phương pháp khác nhau như sau:
Có thể thu được alkyl este của CA bằng nhiều con đường khác nhau Este hóa trực tiếp (phương pháp Fisher) là một trong phương pháp tổng hợp đơn giản, được sử dụng nhiều nhất để thu được các este có chuỗi alkyl ngắn, trong hầu hết các trường hợp, acid sulfuric hoặc acid p –toluenesulfonic được sử dụng làm chất xúc tác [71 - 74] Shin và cộng sự thực hiện phản ứng este hóa CA với methanol với xúc tác là acid sulfuric để điều chế methyl caffeate, phản ứng được thực hiện trong 10 giờ và hiệu suất đạt được lên tới 71% [97] Steverding và cộng sự thu được isoamyl caffeate bằng phương pháp này khi đun hồi lưu isoamyl ancol, acid caffeic và acid sulfuric, trong 3 giờ [98] (sơ đồ 1.1).
Sơ đồ 1.1 Tổng hợp este của acid caffeic với xúc tác acid sulfuric
Etzenhouser và cộng sự [99], Jun Wang và cộng sự [100] tổng hợp các alkyl este khác nhau bằng cách sử dụng acid p –toluenesulfonic Một quy trình chung để tổng hợp các este của acid caffeic theo sáng chế US20090143397A1 sử dụng acid p –toluenesulfonic làm xúc tác cho sản phẩm methyl caffeate với hiệu suất 98% (sơ đồ 1.2).
Sơ đồ 1.2 Tổng hợp este của acid caffeic với xúc tác acid p –toluenesulfonic
Xie và cộng sự báo cáo một phương pháp điều chế este của CA với hiệu suất cao bằng cách sử dụng ytterbium triflate trong nitromethane Hiệu suất thu được từ 40% đến 60% mà không cần loại bỏ nước [89] (sơ đồ 1.3).
Sơ đồ 1.3 Tổng hợp este của acid caffeic với xúc tác ytterbium triflate
Trong một nghiên cứu khác, Takahashi và cộng sự [57] báo cáo về việc sử dụng xúc tác EDC và DMAP làm xúc tác để tổng hợp các dẫn xuất este của acid caffeic (sơ đồ 1.4).
Sơ đồ 1.4 Tổng hợp este của acid caffeic với xúc tác EDC.HCl/DMAP
Một số tác giả khác [46- 49] cũng báo cáo việc sử dụng BOP là xúc tác để điều chế amide từ acid caffeic Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 0 o C với sự có mặt của triethylamine (sơ đồ 1.5).
Sơ đồ 1.5 Tổng hợp amide của acid caffeic với xúc tác BOP
Ngoài ra, Fancelli và cộng sự, Dai và cộng sự, Misra và cộng sự, Chen và cộng sự, Misra và cộng sự, và Liu và cộng sự [101] đã báo cáo việc sử dụng DCC để điều chế các dẫn xuất amid của acid caffeic (sơ đồ 1.6).
Sơ đồ 1.6 Tổng hợp amide của acid caffeic với xúc tác DCC
Li và cộng sự [55] báo cáo việc sử dụng HATU (1- [bis (dimetylamino) metylen] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxid hexafluorophosphat), một tác nhân hay được sử dụng trong điều chế các peptide để tổng hợp các dẫn xuất amide của acid caffeic Phản ứng xảy ra êm dịu ở nhiệt độ phòng cho các dẫn xuất là các amide với hiệu suất khá tốt (sơ đồ 1.7).
Sơ đồ 1.7 Tổng hợp amide của acid caffeic với xúc tác HATU
1.3.2 Vài nét về dẫn xuất hydrazide
Gần đây một loạt các dẫn xuất hydrazide-hydrazone mới đã chứng minh có hoạt tính đa dạng [16] Các dẫn xuất hydrazide có chứa nhóm chức hoạt động (-C-(= O)-NH-NH 2 ).
Năm 2005, Sherine N Khattab và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp một số hợp chất mới với sự ghép nối của benzoic acid hydrazide và N-Boc-L-amino acid và đánh giá hoạt tính sinh học và nghiên cứu ảnh hưởng của các kim loại như Cu và Cd đến hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất này Các hợp chất thử nghiệm có hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với chủng S aureus và E coli Các hợp chất
(Cu: L), (1: 1) của 60e và (Cd: L), (1:1) của 61c có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng S aureus tương đương với ampicilin Hợp chất 61b và 62a có hoạt tính kháng khuẩn chống lại E coli có thể so sánh với ampicillin [102] (sơ đồ 1.8).
Sơ đồ 1.8 Tổng hợp các amino acid-(N′-benzoyl) hydrazide and amino acid-(N′- nicotinoyl) hydrazide
Isoniazid, còn có tên gọi là hydrazid isonicotinic acid (INH) là thuốc được lựa chọn hàng đầu và được sử dụng kết hợp với các thuốc chống lao khác trong điều trị và phòng lao Thuốc đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại Mycobacterium tuberculosis và một số mycobacterium không điển hình khác như M bovis, M. kansasii Isoniazid diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ thuốc ở vị trí tổn thương và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn, nồng độ tối thiểu kìm hãm vi khuẩn lao là 0,02 - 0,2àg/ml Trong số cỏc mycobacteria khụng gõy bệnh lao (khụng điển hỡnh) chỉ có M kansaii thường nhạy cảm với INH [103].
Nhiều hợp chất hữu hiệu khác, chẳng hạn như iproniazide và isocarboxazide được tổng hợp bằng cách khử hydrazide-hydrazones Iproniazide,giống như INH, có tác dụng chống trầm cảm và bệnh nhân có tâm trạng tốt hơn trong quá trình điều trị Iproniazide, isocarboxazide là các dẫn xuất hydrazide phát huy tác dụng của chúng bằng cách ức chế enzyme monoamine oxidase(MAO) Sự ức chế dẫn đến tăng mức độ norepinephrine, dopamine, tyramine và serotonin trong tế bào thần kinh não và trong nhiều mô khác [104].
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu Ngọc cẩu được thu thập tại huyện Na Hang, tỉnh Tuyên Quang vào tháng 12 năm 2019 Tên loài Balanophora laxiflora Hemsl được xác định bởiTiến sĩ thực vật học Đỗ Hữu Thu Tiêu bản (số BL-ICH 2019) được lưu tại ViệnSinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm KH&CNVN, Hà Nội, Việt Nam.
Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
Các dụng cụ dùng cho tách chiết, tổng hợp và tinh chế chất sạch bao gồm:
+Dụng cụ thuỷ tinh: bình cầu 3 cổ các loại, sinh hàn, phễu nhỏ giọt, phễu các loại, ống đong, cốc các loại, pipette, bình triển khai sắc ký bản mỏng, cột sắc ký
+Bếp từ có gia nhiệt
+Máy cô quay chân không
+Đèn tử ngoại bước sóng 254nm, 365nm
Các hóa chất được sử dụng cho việc tổng hợp các phản ứng hữu cơ và dung môi được mua và sử dụng trực tiếp khi nhận từ các hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ) Silicalgel cho sắc ký cột 100 – 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel (Merck), chất ngược pha RP18 (Merck), Sephadex LH-20.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu
Mẫu Ngọc cẩu sấy khô (6,0kg) được nghiền nhỏ ngâm chiết với cồn thực phẩm - nước (EtOH:H 2 O = 7:3, v/v), x 3 lần) trong thiết bị siêu âm, ở nhiệt độ phòng Dịch chiết thu được được tiến hành lọc bằng vải lọc, gộp dịch chiết và cất loại dung môi trên thiết bị cô quay chân không dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng thô (1,8 kg) Cặn chiết này được lưu trong tủ lạnh để sử dụng cho các nghiên cứu.
2.3.2 Phương pháp phân lập các hợp chất
Các hợp chất được phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là Silica gel có cỡ hạt là 40-63àm và Sephadex LH-20 Dung mụi rửa giải chủ yếu dựng cỏc hệ dung môi cơ bản như n-hexane: CH 2 Cl 2 , n-hexane: EtOAc, n-hexane: acetone,
CH2Cl2 : EtOAc, CH2Cl2 : acetone, CH2Cl2 : MeOH, CH2Cl2 : MeOH : H2O với các tỉ lệ thích hợp Sắc ký lớp mỏng được dùng để khảo sát sơ bộ thành phần các chất trong chiết xuất, các phân đoạn trong quá trình chạy cột và kiểm tra chất sạch.
2.3.3 Phương pháp tổng hợp các dẫn xuất
Sử dụng các phản ứng hữu cơ cơ bản để tổng hợp các chất trung gian và hợp chất đích như: phản ứng este hóa, thế, cộng, phản ứng thủy phân…với nhiều xúc tác cơ bản, hiện đại và phản ứng liên tục.
2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc các hợp chất tách được bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (ESI-MS, HR ESI MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance - NMR) gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) Các loại phổ được đo tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học
2.3.5.1 Phương pháp gây độc tế bào Phương pháp gây độc tế bào bằng xét nghiệm Sulforhodamine B (SRB) [91-94]
Vật liệu: năm dòng tế bào ung thư ở người bao gồm A549 (ung thư phổi),
T24 (ung thư bàng quang), Huh-7 (ung thư gan), 8505 (ung thư tuyến giáp không biệt hóa) và SNU-1 (ung thư dạ dày) được cung cấp bởi Giáo sư J M Pezzuto, Long-Island Univercity, USA và Giáo sư Chi-Ying Huang, Yang-Ming National University, Taiwan
- Các tế bào được cấy vào các đĩa 96 giếng ở nồng độ 3 × 10 4 tế bào/mL và được xử lý với các nồng độ mẫu khác nhau trong 48h trong tủ ấm ở 37°C và 5%
CO 2 Mẫu thử ban đầu được hòa tan trong DMSO 100% và được pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng môi trường nuôi cấy ngay trước khi thử nghiệm.
- Sau khi được ủ trong 24h như mụ tả ở trờn, tiếp tục xử lý với 10àL mẫu để đạt được nồng độ cuối cựng là 100àg/mL; 20,0àg/mL; 4,0àg/mL; 0,80àg/mL và 0,16àg/mL Cỏc đĩa này được ủ tiếp trong 48h.
- Sau đó, tế bào được cố định bằng acid trichloroacetic 20% (TCA), rửa dưới vòi nước và nhuộm SRB 0,4% trong 30’ Thuốc nhuộm SRB liên kết với protein, liên quan đến khả năng tồn tại của tế bào, được hòa tan trong đệm Tris- base Mật độ quang học được xác định tại 540nm bằng đầu đọc ELISA (Tecan GENios Plate Reader).
- Phộp thử được lặp lại 3 lần Ellipticine ở cỏc nồng độ 100àg/mL; 20,0àg/mL; 4,0àg/mL; 0,80àg/mL và 0,16àg/mL được sử dụng là chất đối chứng dương Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
Phương pháp gây độc tế bào ung thư tủy xương cấp
Vật liệu: tế bào OCI-AML3, được lấy từ Bộ sưu tập American Type
Culture 97 (ATCC, Manassas, VA, USA).
Phương pháp: Tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640, bổ sung 10% huyết thanh bò, 100μg/mL penicillin, và 100μg/mL streptomycin ở 37°C trong 5% CO 2 Môi trường được thay đổi 2 ngày một lần Trong thí nghiệm, các tế bào được cấy vào 24 giếng đĩa nuôi cấy, giữ nồng độ ở 2 × 10 5 tế bào / mL và được xử lý trong 24h với các nồng độ khác nhau của dimethylsulfoxide (DMSO) (Nồng độ tối đa là 1,5μl/mL) hoặc các hợp chất thử nghiệm ở nồng độ cuối cùng (được xác định sau khi sàng lọc sơ bộ) Các hợp chất thử nghiệm (10àL) được đưa vào giếng cấy tế bào ở cỏc nồng độ khỏc nhau.
Trong phân tích số lượng tế bào chết theo chương trình và sự tiến triển của chu kỳ tế bào, số lượng các tế bào được đếm trên hemocytomether, phân tích protein bằng kỹ thuật Western Blot Khả năng sống của tế bào và sự tiến triển của chu kỳ tế bào được phân tích bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy, nhân tế bào được nhuộm bằng propidium iodide (PI) Tính tỉ lệ tế bào sống theo công thức: x 100%
Phân tích thống kê: Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPadPrism 6.
2.3.5.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của mẫu đến sự biểu hiện IL-2
Vật liệu: Dòng tế bào: RAW 264.7 do GS TS Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp.
Phương pháp xác định sự phát triển của tế bào RAW264.7: xác định tế bào tỷ lệ sống sót dưới ảnh hưởng của mẫu thử nghiệm bằng MTT Cụ thể, các tế bào
RAW 264.7 được cấy vào đĩa 96 giếng ở nồng độ ở 2,5 x 10 5 tế bào/giếng (190àL) và được ủ với mẫu (10àL) để đạt được nồng độ cuối cựng ở 100àg/mL và 20àg/mL Trờn cựng một đĩa thử, bố trớ một số giếng để làm đối chứng trắng, chỉ cú dung mụi pha mẫu là DMSO 1% Sau đú, 3,2àL MTT (5mg/mL) được thêm vào mỗi giếng của đĩa và ủ ở 37°C trong 4h Tiếp theo, đĩa được lắc nhẹ trong 10 phút trước khi đo hàm lượng màu formazan ở bước sóng 540nm bằng thiết bị đọc đĩa ELISA (BioTek).
Tỷ lệ sống sót của tế bào trong quá trình xử lý mẫu sẽ được xác định bằng cách sử dụng công thức sau:
% sống sót = (OD (chất thử) – OD (đối chứng trắng))/ OD (DMSO) – OD (đối chứng trắng)
Phương pháp xác định ảnh hưởng của mẫu đến biểu hiện interleukin 2 (IL-2): tế bào RAW 264.7 được cấy vào đĩa 96 giếng với lượng tế bào thích hợp
(2,5 ì 10 5 tế bào/giếng trong 190àL mụi trường) và ủ ở 37°C qua đờm Cỏc hợp chất thử nghiệm (10àL) được đưa vào giếng ở cỏc nồng độ khỏc nhau Một số giếng khụng cú mẫu nhưng cú tế bào (190àL) và 10àL của 1% DMSO sẽ được sử dụng làm đối chứng âm Sau 2h ủ, lipopolysaccharide (LPS) ở nồng độ1àL/mL được thờm vào tất cả cỏc giếng thớ nghiệm Sau 24h, cỏc chất nổi trờn bề mặt nuôi cấy tế bào được thu thập và xét nghiệm để đánh giá sự hiện diện của interleukin 2.
2.3.5.3 Hoạt tính ức chế Nitric oxide (NO)
THỰC NGHIỆM
Phân lập một số hợp chất phenolic từ loài Ngọc cẩu
Mẫu Ngọc cẩu thái nhỏ, sấy ở 45 o C đến khô, mẫu khô nghiền nhỏ và cho vào bình ngâm chiết với dung môi EtOH : H 2 O = 7:3, (lặp lại 3 lần) ở nhiệt độ phòng, thu được dịch chiết tổng, dịch chiết lọc qua vải lọc, cất loại dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm thu được 1,8 kg cặn chiết tổng Hòa tan cặn chiết tổng với nước sau đó đem chiết phân đoạn lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và cặn còn lại hòa tan trong ethanol Cất loại dung môi thu được các cặn chiết tương ứng (sơ đồ 3.1).
Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane (40g) bằng phương pháp sắc ký với chất hấp phụ là silicagel, hệ dung môi chloroform : methanol (100: 0 → 50: 1 → 40: 1 → 20: 1 → 15: 1) cho 10 phân đoạn Các phân đoạn tiếp tục được phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel, hệ dụng môi dichloromethane : methanol hoặc sephadex LH-20 (dung môi methanol) thu được
4 hợp chất từ BL1->BL4 (sơ đồ 3.2).
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ mẫu Ngọc cẩu
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane của mẫu Ngọc cẩu
Các hợp chất BL1->BL4 được xác định cấu trúc bằng các phương pháp đo phổ.
3.1.1 Methyl gallate (methyl 3,4,5-trihydroxybenzoate) (BL1)
1H-NMR (500 MHz, CD3OD, δ ppm): 7,06 (2H, s, H-2/H-6); 3,83 (3H, s, OCH3).
13C-NMR (125 MHz, CD3OD, δ ppm): 121,5 (C-1); 110,1 (C-2/C-6); 146,5 (C-3/C-5); 139,8 (C-4); 169,0 (C=O).
3.1.2 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde [3-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-2-propenal] (BL2)
1H-NMR (500 MHz, CDCl 3, δ ppm): 7,07 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2); 6,96 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 7,12 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6); 6,60 (1H, dd, J= 7,5, 16,0 Hz, H-8); 7,40 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7); 9,67 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-9); 3,94 (1H, s, OCH3).
13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ ppm): 56,0 (OCH3); 126,6 (C-1); 109,5 (C- 2); 149,0 (C-3); 147,0 (C-4); 115,0 (C-5); 124,0 (C-6); 153,2 (C-7); 126,3 (C-8); 193,7 (C-9).
3.1.3 Methyl 4-hydroxy cinnamate [Methyl 4-hydroxy cinnamate [methyl - trans -3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoate] (BL3)
1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,43 (2H, d, J = 8,5 Hz; H-2/H-6);
13C-NMR (125 MHz, CDCl 3 , δ (ppm): 51,60 (OCH 3 ); 126,7 (C-1); 130,0 (C-2/C-6); 116,0 (C-3/C-5); 158,5 (C-4); 144,8 (C-7); 114,8 (C-8); 168,0 (C-9).
3.1.4 Methyl caffeate [methyl trans -3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate] (BL4)
1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,06 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2); 6,83
(1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 6,94 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6); 7,57 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7); 6,23 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-8), 3,80 (3H, s, OCH3).
13C-NMR (125 MHz, CDCl 3 , δ ppm: 51,56 (OCH 3 ); 126,8 (C-1); 113,9 (C-2);145,4 (C-3); 147,2 (C-4); 115,1 (C-5); 122,0 (C-6); 144,6 (C-7); 114,4 (C-8); 168.3(C-9) HMBC (H C, s: strong, w: weak): H-2/C-6, C-7, H-5/C-1, C-3, H-6/ C-8,C-7, H-7/C-9s, C-8, C-6, H-8/C-9 w, C-1, C-9 s.
Tổng hợp methyl caffeate
Hợp chất methyl caffeate được tổng hợp một cách đơn giản bằng phương pháp este hóa trực tiếp (phương pháp Fisher) với xúc tác acid sulfuric theo sơ đồ sau:
Phổ NMR của sản phẩm phù hợp với chất BL4 ở từng vị trí tương ứng.
Tổng hợp một số dẫn xuất caffeyl hydrazide
Các dẫn xuất caffeyl hydrazide được tổng hợp theo sơ đồ 3.3:
Sơ đồ 3.3 Tổng hợp các hợp chất caffeyl hydrazide
(i) C 2 H 5 OH, H 2 SO 4 , C 2 H 5 OH, hồi lưu 12h
(ii) NH 2 NH 2 (80%), C 2 H 5 OH, hồi lưu 10h
(iii) Acid caffeic, COMU, DMF, Triethyl amin (hoặc N- Ethyl diisopropylamin)
- Bước 1: Este hóa acid (A1 -> A8): Đun hồi lưu một hỗn hợp của dẫn xuất acid benzoic hoặc phenyl acetic (1g, 0,75mmol) trong EtOH (20mL), H 2 SO 4 đặc (1 mL) trong 12h Kiểm tra quá trình phản ứng bằng TLC, hệ dung môi n-hexan-ethyl acetate (8:2) Phản ứng sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng Trung hòa phản ứng đến pH=7 bằng Na 2 CO 3 1 %
(20 mL) DCM (30 mL) được thêm vào và chiết với nước Pha hữu cơ được tác ra, làm khan bằng Na2SO4, cô quay thu được sản phẩm dạng dầu.
- Bước 2: Este (E1 -> E8) được hòa tan trong EtOH (20 mL) NH2NH2.H2O(3eq) sau đó được thêm vào và phản ứng được đun hồi lưu trong 10 giờ Theo dõi phản ứng bằng TLC, hệ dung môi DCM: MeOH (10:1) Kết thúc phản ứng, để nguội DCM (30 mL) được thêm vào và chiết với nước (20 mL x 3) Pha hữu cơ được tách ra và làm khan bằng Na 2 SO 4 Cô quay loại dung môi DCM thu được sản phẩm dạng rắn, màu trắng.
- Bước 3: Hỗn hợp của acid caffeic 180mg, 1 mmol) trong DMF (5 mL), Triethylamin (0,14 mL) hoặc N-Ethyl diisopropylamino (0,2 mL), COMU (1- Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy) dimethylamino-morpholino- carbenium hexafluorophosphate) (1mmol), được khuấy ở 0 o C trong 30’ Thêm vào phản ứng hydrazide điều chế ở trên (1mmol) Phản ứng được khuấy ở 0 o C trong 2 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ Kết thúc phản ứng, ethyl actetate (30 mL) được thêm vào và phần chiết ethyl actetate được rửa lần lượt với
H2O, HCl 1N, NaHCO3 1M và H2O Pha hữu cơ được tách ra và làm khan bằng
Na 2 SO 4 , cô quay ở áp suất giảm thu được cặn tương ứng Sắc ký cột silicagel cặn chiết với hệ dung môi DCM-MeOH (12:1) cho các sản phẩm tương ứng.
1HNMR (600 MHz, DMSO-d 6 ): δ 10,34 (1H, s, NH); 9,99 (1H, s, NH); 9,41 (1H, br s, OH); 9,17 (1H, br s, OH); 7,81 (2H, d, J = 7,2 Hz, H-2′, H-6′); 7,36 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-); 7,30 (2H, d, J = 7,2 Hz, 1H, H-3′, H-5′); 7,01 (1H, s, H-2); 6,89 (1H, d, J = 7,2 Hz, H-5); 6,77 (1H, d, J = 7,2 Hz, H-6); 6,44 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-); 2,37 (3H, s, CH 3 ).
1HNMR (600 MHz, DMSO-d 6 ): δ 10,36 (1H, s, NH); 10,02 (1H, s, NH), 9,41 (1H, br s, OH); 9,17 (1H, br s, OH); 7,72 (1H, s); 7,68 (1H, s); 7,37 (1H, d, J 16,0 Hz, H-); 7,36 (1H, s); 7,30 (2H, d, J = 7,2 Hz); 7,01 (1H, s); 6,90 (1H, d, J 7,5 Hz); 6,78 (1H, d, J = 7,5 Hz); 6,44 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-); 2,37 (3H, s, CH3).
1HNMR (600 MHz, DMSO-d 6 ): δ 7,97 (2H, dd, J = 8,6; 2,0 Hz); 7,38
(1H, d, J = 15,6 Hz, H-); 7,34 (2H, d, J = 8,6 Hz); 7,02 (1H, s); 6,90 (1H, d, J 7,8 Hz); 6,78 (1H, d, J = 7,2 Hz); 6,45 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-).
13C-NMR (150 MHz, DMSO-d 6 ): δ 164,98 ( 1 J CF = 249 Hz, C-4′); 164,90;164,44; 147,7; 145,6; 140,8; 130,1 ( 3 J CF = 9,0 Hz, C-2′, C-6′); 128,99; 126,0; 120,8;115,8; 115,54 ( 2 J CF = 21,0 Hz, C-3′, C-5′); 115,51; 113,9.
,6 Hz, H-); 6,86 (1H, d, J = 7,6 Hz); 7,30-7,38 (m, 3H); 6,76 (1H, d, J = 7,6 Hz); 6,42 (1H, d, J = 16,2 Hz, H-); 3,54 (s, 2H, CH 2 ).
Hz, NH); 9,41 (1H, br s, OH); 9,17 (1H, br s, OH); 7,59 (1H, dt, J = 7,2; 1,8 Hz, H- 4′); 7,59 (1H, q, J = 7,8; 1,8 Hz, H-5′); 7,38 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-); 7,34-7,31 (2H, m, H-3′, H-6′); 7,01 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2); 6,90 (1H, dd, J = 8,4 Hz, 1,8 Hz, H-6); 6,78 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-5); 6,42 (1H, d, J = 16,2 Hz, H-).
13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ 164,4 ( 1 J CF = 237 Hz, C-2′); 160,0;158,4; 147,7; 145,6; 140,8; 133,0; 130,1; 126,0; 124,5; 120,8; 116,3 ( 2 J CF = 21 Hz,C-3′); 115,8; 115,4; 113,8.
1HNMR (600 MHz, DMSO-d6): δ10,55 (1H, s, NH); 10,09 (1H, s, NH); 9,42 (1H, br s, OH); 9,20 (1H, br s, OH); 7,76 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 7,68 (1H, d, J = 7,8 Hz); 7,59-7,55 (m, 1H); 7,39 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-), ); 7,44 (1H, d, J = 7,8; 7,2 Hz); 7,02 (1H, s); 6,90 (1H, d, J = 7,8 Hz); 6,76 (1H, d, J = 7,8 Hz); 6,44 (1H, d, J 15,6 Hz, H-).
13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6): δ 164,9; 164,2; 162,7 ( 1 J CF = 243 Hz, C- 3′); 147,8; 145,6; 140,9; 134,8 ( 3 J CF = 7,5 Hz, C-1′); 130,8 ( 3 J CF = 7,5 Hz, C-5′);
1HNMR (600 MHz, DMSO-d6): δ 7,68 (1H, dd, J = 7,2; 1,8 Hz); 7,42 (1H, dd, J = 7,8; 1,8 Hz); 7,34 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-); 7,28 (1H, dt, J = 7,8 Hz; 1,8 Hz); 7,00 (1H, d, J =1,8 Hz); 6,86 (1H, dd, J = 8,4; 2,2 Hz, H-6); 6,77 (1H, d, J = 7,8
3.3.1.8 N′-(2-fluorophenyl aceto)-N-caffeyl hydrazide (CA4.8)
1HNMR (600 MHz, DMSO-d6): δ δ10,22 (1H, s, NH); 10,02 (1H, s, NH); 7,68 (1H, dd, J = 7,2; 1,8 Hz); 7,42 (1H, d, J = 7,8 Hz); 7,42 (1H, d, J = 7,8; 1,8 Hz); 7,34 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-); 7,00 (1H, d, J=1,8); 6,86 (1H, dd, J = 8,4; 1,8 Hz); 6,77 (1H, d, J = 7,8 Hz); 6,77 (1H, d, J = 8,4 Hz); 6,40 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-); 3,68 (2H, s, H-11a/11b).
13C-NMR (150 MHz, DMSO-d 6 ): δ 167,8; 164,2; 161,3 ( 1 J CF = 243 Hz, C-2′); 147,7; 145,6; 140,6; 131,7 ( 3 J CF = 4,5 Hz, C-6′); 128,7 ( 3 J CF = 7,5 Hz, C-4′); 126,0; 124,1 ( 4 J CF = 3 Hz, C-5′); 122,7 ( 2 J CF = 15 Hz, C-1′); 120,7; 115,8; 115,5; 115,0
THẢO LUẬN VÀ KẾT QUẢ
Xác định cấu trúc một số hợp chất phenolic phân lập từ loài Ngọc cẩu
4.1.1 Methyl gallate (methyl 3,4,5-trihydroxybenzoate, BL1)
Phổ IR xuất hiện các tín hiệu dao động đặc trưng của nhóm OH ở ν max 3363cm -1 (rộng, tù), và nhóm carbonyl ở νmax 1692cm -1 (C=O).
Phổ 1 H-NMR của BL1 cho hai loại tín hiệu của vòng thơm có nhóm thế đối xứng, trong đó có một tín hiệu singlet của hai proton thơm ở δH 7,06 (2H; s; H-2/H-6) và tín hiệu còn lại là của nhóm methoxy ở δH 3,83 (3H, s, OCH3).
Phổ 13 C-NMR cho 4 tín hiệu của 6 carbon thơm, trong đó có cặp 2 carbon đối xứng ở δC 110,1 (C-2/C-6); 146,5 (C-3/C-5) và δC 121,5 (C-1); 139,8 (C-4) và 1 tín hiệu của carbon carbonyl ở 169,0 (C-7).
Phổ HMBC xuất hiện tín hiệu tương tác của nhóm methoxy với với nhóm carbonyl (δH 3,83; δC 169,0), cho phép xác định được cấu trúc của BL1 là methyl este của acid gallic (methyl gallate).
Phân tích tổng thể các số liệu phổ NMR của hợp chất BL1 và so sánh với dữ liệu phổ NMR của hợp chất methyl gallate [115] là trùng khớp, do đó hợp chất BL1 được xác định là methyl gallate.
4.1.24-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde [3-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-2-propenal, BL2].
Phổ 1 H-NMR của BL2 cho một tín hiệu singlet của nhóm methoxy ở δ H 3,94 (3H, s, OCH3), một tín hiệu doublet của proton với nhóm carbony ở δH 9,67 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-9), các tín hiệu proton thơm ở δ H 7,07 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2); 6,96 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 7,12 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz, H-6); một cặp doublet ở δ H 6,60 (1H, dd, J= 7,5 Hz, 16,0 Hz, H-8); 7,40 (1H, d, J = 16,0
Phổ 13 C-NMR cho đầy đủ 10 tín hiệu carbon, trong đó có một tín hiệu của carbon carbonyl ở 193,7 (C-9), gợi ý đây là một aldehyde Các tín hiệu carbon thơm khác ở δC 126,6 (C-1); 109,5 (C-2); 149,0 (C-3); 147,0 (C-4); 115,0 (C-5); 124,0 (C-6) Ngoài ra có một tín hiệu carbon của nhóm methoxy ở 56,0 (OCH 3 ) và tín hiệu ở 153,2 (C-7), 126.3 (C-8).
Phân tích tổng thể các số liệu phổ NMR, chất BL2 được xác định là 4- hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde.
4.1.3 Methyl 4-hydroxy cinnamate [methyl trans-3-(4-hydroxyphenyl)-2- propenoate, BL3]
Phổ IR xuất hiện các tín hiệu dao động đặc trưng của nhóm cacbonyl νmax
Phổ 1 H-NMR của BL3 có cặp tín hiệu doublet của 4 proton thơm ở δ H
7,43 (2H; d, J = 8,5 Hz, H-2/H-6) và 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3/H-5), cho phép xác định phân tử có 1 vòng thơm có hai nhóm thế ở vị trí C-1 và 4 (nhóm thế para) Cặp doublet với hằng số tương tác J = 16 Hz, cho thấy phân tử có một nối đôi có cấu hình trans ở δ H 7,64 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7) và 6,30 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-8) Tín hiệu của nhóm methoxy ở δ H 3,80 (3H, s, OCH 3 ).
Phổ 13 C-NMR cho đầy đủ 10 tín hiệu trong đó có tín hiệu của carbon thơm ởδC 126,7 (C-1); 130,0 (C-2/C-6); 116,0 (C-3/C-5); 139,8 (C-4) và 1 tín hiệu của carbon carbonyl ở 169,0 (C-9), tín hiệu 144.8 (C-7), 114.8 (C-8).
Phân tích số liệu phổ NMR của hợp chất BL3 và so sánh với dữ liệu phổ NMR của hợp chất BL4, cấu trúc của chất BL3 được xác định là methyl 4- hydroxy cinnamate [3].
4.1.4 Methyl caffeate [methyl trans -3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate, BL4]
So sánh phổ 1 H-NMR của BL4 với chất BL3 cho thấy chúng đều có một cặp doublet với hằng số tương tác J Hz, cho thấy phân tử có một nối đôi có cấu hình trans Phổ 13 C-NMR đều có tín hiệu của 10 carbon trong đó có một nhóm carbonyl và một nhóm methoxy, cho thấy chất này là một dẫn xuất methyl của acid trans-cinnamic Theo đó tín hiệu của nhóm methoxy ở δH 3,80 (3H, s, OCH 3 ), một cặp doublet với hằng số tương tác J = 16 Hz, cho thấy phân tử có một nối đôi có cấu hình trans ở δ H 7,58 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7) và 6,26 (1H, d,
J = 16,0 Hz, H-8) Khác với BL3, chất này có thêm một nhóm thế ở C-3, được chứng minh qua các tín hiệu ở δ H 7,08 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2); 6,87 (1H, d, J 8,0 Hz, H-5); 7,01 (1H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-6).
Phổ 13 C-NMR cho đầy đủ 10 tín hiệu trong đó có tín hiệu của carbon thơm ởδC 127,8 (C-1); 114,49(C-2); 144,7 (C-3); 146,1 (C-4); 115,6 (C-5); 122,6 (C-
6), 1 tín hiệu của carbon carbonyl ở 167,8 (C-9), một tín hiệu nhóm methoxy ở51,7 (OCH3), tín hiệu 143,7 (C-7); 115,65 (C-8) Nhóm methyl este được xác định qua tương tác của δH 3,80 và δC 167,8 trong phổ HMBC Các tương tác HMBC chính của chất BL4 được biểu diễn ở hình 4.1.
Hình 4.1 Tương tác HMBC chính của BL4 (H/C)
Phân tích số liệu phổ NMR của hợp chất BL4 và so sánh với dữ liệu phổ NMR của hợp chất methyl caffeate [68] là trùng khớp, do đó cấu trúc của hợp chất BL4 được xác định là methyl caffeate.
Hình 4.2 Phổ 1 H-NMR của BL4
Hình 4.3 Phổ 13 C-NMR của BL4
Hình 4.4 Phổ HSQC của BL4
Hình 4.5 Phổ HMBC của BL4
Tổng hợp methyl caffeate
Hợp chất methyl caffeate được tổng hợp một cách đơn giản đi từ acid caffeic, một nguyên liệu dễ kiếm trên thị trường, bằng phương pháp este hóa trực tiếp, có xúc tác acid sulfuric (sơ đồ 4.1).
Sơ đồ 4.1 Sơ đồ cơ chế hình thành các dẫn xuất caffeate
Dưới tác động của xúc tác acid, proton gắn vào nhóm carbonyl của nhóm carboxyl, đôi điện tử của oxi thuộc nhóm OH của ancol tấn công vào ion dương axyl để hình thành nên ion của este đã được proton hóa, cuối cùng ion này loại nước và proton để sinh ra este Độ tinh sạch của sản phẩm được xác định bằng cách so sánh TLC và phổ 1 H-NMR cho kết quả phù hợp với chất methyl caffeate được phân lập từ loài Ngọc cẩu.
Tổng hợp và xác định cấu trúc một số dẫn xuất caffeyl hydrazide
4.3.1 Tổng hợp một số dẫn xuất caffeyl hydrazide
Các caffeyl hydrazide được tổng hợp thông qua ba bước:
4.3.1.1 Tổng hợp este trung gian
Tương tự như tổng hợp methyl caffeate, các hợp chất este trung gian E1-
>E8 được tổng hợp một cách đơn giản bằng phương pháp este hóa trực tiếp với xúc tác H 2 SO 4 (sơ đồ 4.2).
Sơ đồ 4.2 Sơ đồ tổng hợp các este trung gian
Các hợp chất từ E1->E8 được kiểm tra độ tinh sạch bằng TLC.
4.3.1.2 Tổng hợp các dẫn xuất hydrazine Ởbước 2, hydrazine phản ứng với các este (E1->E8) thông qua quá trình khử Wolff-Kishner Khi hydrazine tấn công nhóm carbonyl của este, chất trung gian tứ diện được tạo ra và bị phá vỡ để tạo thành các hydrazide (H1->H8) như được thể hiện trong sơ đồ 4.3:
Sơ đồ 4.3 Sơ đồ cơ chế hình thành các dẫn xuất hydrazine
4.3.1.3 Cơ chế hình thành các dẫn xuất caffeyl hydrazide
Bước cuối cùng là phản ứng giữa acid caffeic với các dẫn xuất hydrazine.
Sơ đồ dưới đây mô tả cơ chế để tổng hợp các caffeyl hydrazide với xúc tácCOMU [116] Bước đầu tiên là sự tấn công nucleophin của acid caffeic A tại gốc uronium của COMU B tạo ra chất trung gian C C bị phân hủy, sau đó E tấn công vào nhóm cacbonyl của D và tạo thành F và G Cuối cùng, dẫn xuất hydrazide tương ứng được tạo thành do sự tấn công nucleophin của một hydrazine vào nhóm cacbonyl của G và sản phẩm phụ H tan trong nước được loại bỏ [116] (sơ đồ 4.4).
Sơ đồ 4.4 Sơ đồ cơ chế hình thành các dẫn xuất caffeyl hydrazide
4.3.2 Xác định các sản phẩm tổng hợp caffeyl hydrazide
Cấu trúc của sản phẩm tổng hợp caffeyl hydrazide (CA4.1-4.8) được xác định bằng phổ NMR một chiều và hai chiều Dưới đây là biện luận phổ chi của một chất đại diện.
Phổ 1 HNMR (600 MHz, DMSO-d6) của CA4.6: cho hai tín hiệu singlet của proton của nhóm NH ở δ10,55 (1H, s, NH); 10,09 (1H, s, NH), hai tín hiệu singlet tù đặc trưng cho nhóm OH ở δ H 9,42 và 9,20 (mỗi tín hiệu 1H, br s, OH). Cặp doublet với hằng số tương tác J = 15,6 Hz, cho thấy phân tử có một nối đôi có cấu hình trans ở δ H 6,44 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-); 7,39 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-) Các tín hiệu của proton thơm ở δ 7,76 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,68 (1H, d, J 7,8 Hz); 7,57 (1H, d, J = 7,8; 7,2 Hz); 7,44 (1H, d, J = 7,8; 7,2 Hz); 7,02 (1H, s); 6,90 (1H, d, J = 7,8 Hz); 6,76 (1H, d, J = 7,8 Hz).
Phổ 13 C-NMR (150 MHz, DMSO-d 6 ) của CA4.6: cho đầy đủ 16 tín hiệu trong đó có tín hiệu của carbon thơm ở δC 162,7; 161,1; 147,8; 145,6; 140,9; 134,8; 130,8; 126,0; 123,6; 120,9; 118,81; 115,8; 115,5; 114,3; 113,9 và 2 tín hiệu của carbon carbonyl ở δ 164,9 (C=O, C-9); 164,2 (C=O, C-10) Sự có mặt của Flo trong cấu trúc thể hiện qua sự tách vạch đặc trưng ở các tín hiệu cộng hưởng: δC 162,7 ( 1 J CF = 243 Hz, C-3′); 134,8 ( 3 J CF = 7,5 Hz, C-1′); 130,8 ( 3 J CF 7,5 Hz, C-5′); 118,8 ( 2 J CF = 21 Hz, C-4′); và 114,3 ( 2 J CF = 22,5 Hz, C-2′).
Ngoài ra, phổ HMBC cho phép khẳng định liên kết este caffeyl hydrazide qua các tương tác của nhóm carbonyl (C-9) với H-7, H-8 Phân tích tổng thể các số liệu phổ NMR của hợp chất CA4.6 (Bảng 4.1), xác định được cấu trúc của
CA4.6 là N′-(3-fluorobenzoyl)-N-caffeyl hydrazide.
Bảng 4.1 Số liệu phổ chất của chất CA4.6
*Gán phổ H/C dựa trên phổ HSQC và HMBC. aĐo ở 600 MHz cho 1 H- NMR và b 150 MHz cho 13 C-NMR; Dung môi đo
DMSO-d6, δ ppm; J δ tính bằng ppm; giá trị J (Hz) được cho trong dấu ngoặc đơn.
Hình 4.6 Phổ 1 H-NMR của CA4.6
Hình 4.7 Phổ 13 C-NMR của CA4.6
Hình 4.8 Phổ HSQC của CA4.6
Hình 4.9 Phổ HMBC của CA4.6
Kết quả thử hoạt tính sinh học
4.4.1Kết quả thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phenolic phân lập từ loài Ngọc cẩu BL1-BL4
4.4.1.1 Hoạt tính các hợp chất BL1-BL4 với tế bào ung thư tủy xương cấp (OCI-ALM)
Các hợp chất BL1-BL4 được phân lập từ Ngọc cẩu được nghiên cứu tác dụng chống tăng sinh, làm chết tế bào và bắt giữ chu kỳ tế bào Tế bào ung thư tủy xương cấp (OCI-ALM3), một dòng tế bào gốc được lựa chọn để nghiên cứu sâu về gây chết tế bào theo chu kỳ và cơ chế Tác động của các hợp chất BL1–
BL4 lên sự phát triển của tế bào OCI-AML3 được đánh giá bằng cách đánh giá số lượng tế bào, quá trình chết rụng và sự tiến triển của chu kỳ tế bào Kết quả cho thấy rằng hợp chất BL1 và BL3 làm tăng đáng kể quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở nồng độ 150 và 300μg/mL, trong khi hợp chất BL4 làm tăng đáng kể quá trình chết tế bào theo chương trình ở nồng độ 15,6μg/mL. Hợp chất BL2 không thể hiện hoạt tính (hình 4.10) Việc giảm số lượng tế bào OCI có thể là do tăng quá trình chết rụng, giảm sự tăng sinh hoặc cả hai.
Hình 4.10 Ảnh hưởng của các hợp chất (BL1), (BL2), (BL3) và (BL4) đến số lượng các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis)
Ghi chú: Các thanh trắng là DMSO làm đối chứng, thanh ghi thể hiện ảnh hưởng của các hợp chất ở các nồng độ thử nghiệm khác nhau Các nồng độ thử nghiệm được thể hiện trên trục x (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).
(A) Các cột thể hiện số lượng tế bào OCI-AML được tính sau 24 giờ thử nghiệm
(B) Các cột thể hiện phần trăm tế bào chết theo chương trình được tính sau 24 giờ thử nghiệm
Trong phân tích chu kỳ tế bào, các hợp chất BL1, BL2, BL3 và BL4 làm tăng đáng kể tỷ lệ tế bào trong pha G0/G1 Các hợp chất BL1, BL2, BL3 (ở nồng độ 300μg/mL) và BL4 làm giảm tỷ lệ tế bào trong pha S Các hợp chất BL3 (ở nồng độ 300μg/mL) và BL4 có thể giảm tỷ lệ tế bào trong pha G2/M (hình 4.11).
Hình 4.11 Ảnh hưởng của các hợp chất (BL1), (BL2), (BL3) và (BL4) đến số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha của chu kỳ của tế bào
Ghi chú: Các thanh trắng là DMSO làm đối chứng, thanh ghi thể hiện ảnh hưởng của các hợp chất ở các nồng độ thử nghiệm khác nhau Các nồng độ thử nghiệm được thể hiện trên trục x (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).
(A) Cột thể hiện cho tỷ lệ phần trăm phần trăm tế bào chết theo chương trình được tính sau 24 giờ thử nghiệm ở giai đoạn pha G0/G1
(B) Cột thể hiện cho tỷ lệ phần trăm phần trăm tế bào chết theo chương trình được tính sau 24 giờ thử nghiệm ở giai đoạn pha S
(C) Cột thể hiện cho tỷ lệ phần trăm phần trăm tế bào chết theo chương trình được tính sau 24 giờ điều trị ở giai đoạn pha G2 / M
Trong số bốn hợp chất được thử nghiệm, các hợp chất BL1, BL3 và BL4 làm giảm số lượng tế bào trong các tế bào OCI-AML3 Nghiên cứu này đã xác minh rằng methyl este (hợp chất BL1 và BL4) có tác dụng chống bệnh bạch cầu cao hơn BL3, trong khi chất có nhóm aldehyde (BL2) không có tác dụng lên tế bào Chất BL4 có tác động đáng kể ở nồng độ thấp hơn nhiều so với BL1 và phát huy tác dụng của nó bằng cách ngăn chặn các tế bào ở pha G0/G1 của chu kỳ tế bào Chất BL4 được chọn để nghiên cứu thêm vai trò của nó trong caspase, dấu hiệu của sự chết tế bào apoptotic Các tế bào được thử với chất BL4 được kích hoạt caspase-3 và caspase-8, nhưng không được kích hoạt caspase-9 (hình 4.12).
Do đó, chất BL4 đã thúc đẩy quá trình tự chết của tế bào OCI, như được chứng minh bằng cách kích hoạt caspase-3 thông qua con đường ngoại sinh phụ thuộc caspase-8 Hình 4.12B cho thấy chất BL4 làm tăng đáng kể sự biểu hiện của FasL nhưng không làm tăng đáng kể TNF-α và TGF-β.
Hình 4.12 Ảnh hưởng của BL4 đến quá trình apoptotic
Chú thích: (A) Phân tích Western blot của pro-caspase-3 (caspase-3), caspase-3 hoạt hóa (caspase 3 phân cắt), pro-caspase-8 (caspase-8), caspase-8 được kích hoạt (caspase 8 phân cắt), pro-caspase-9 (caspase 9) và caspase-9 được kích hoạt (caspase 9 phân cắt) trong các tế bào OCI-AML3 được xử lý bằng chất đối chứng (Control) hoặc BL4 ở nồng độ 15,62 μg/mL trong 24 giờ. Western blots là đại diện của năm thí nghiệm độc lập (B) Phân tích Real-time PCR (RT-PCR) thời gian thực từ năm thí nghiệm độc lập (trung bình ± SEM) của Fas-L, TNF-α, TGF-β, trong các tế bào được xử lý bằng đối chứng hoặc BL4 ở nồng độ 15,62 μg / mL (4), ** p