Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và nghiên cứu ứng dụng trong Dược Mỹ Phẩm

Nội dung chính của đề tài là chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác. Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng (TLC), UV-VIS. Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đường kính vòng vô khuẩn.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU

BÁO CÁO

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT

POLYPHENOL TRONG LÁ CHÈ XANH TRỒNG TẠI TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG

DỤNG TRONG DƯỢC MỸ PHẨM

Chủ nhiệm đề tài: Sinh viên: Tống Thị Ngọc Bé, lớp DH15HC

đồng hướng dẫn TS Nguyễn Thị Tuyết

BÀ RỊA - VŨNG TÀU, tháng 07, năm 2019

- Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là:

Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ chiết 65 OC, thời gian: 35 phút

- Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là 20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là 22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng

là 20,79% và hiệu suất tăng 1,04 lần

Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17% Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất thấp 1,41%

- Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết

để ứng dụng nó trong một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế

- Xây dựng được quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phòng thí nghiệm)

5 Thời gian nghiên cứu: Từ 12/03/2018 đến 12/06/2019

6 Chữ ký của CNĐT:………

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC SƠ ĐỒ iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu chung về cây chè 5

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè 5

1.1.2 Phân loại 5

1.1.3 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam 6

1.1.4 Thành phần hóa học cơ bản của lá chè 6

1.1.5 Dược tính của chè 8

1.2 Polyphenol trong chè 9

1.2.1 Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật 9

1.2.2 Các hợp chất Polyphenol có trong chè 10

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè 16

1.2.4 Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè 17

1.2.5 Hoạt tính sinh học của polyphenol chè 22

1.3 Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong chè 24

1.3.1 Bản chất của quá trình trích ly 24

1.3.2 Các phương pháp trích ly 24

1.4 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của sản phẩm 28

1.4.1 Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi 28

1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 30

1.4.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 30

1.4.4 Ảnh hưởng của pH 31

1.4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 31

1.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn 33

1.5.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 42

1.5 Phương pháp Sấy thăng hoa 44

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 46

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 46

2.1.1 Nguyên liệu chè 46

2.1.2 Chủng vi sinh vật 46

2.1.3 Hóa chất, thiết bị 46

2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis 47

2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 47

2.2.2 Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic 48

2.3 Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ lá chè 49

2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ 49

2.3.2 Một số quy trình khảo sát khác 52

2.3.3 Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol lá chè bằng dung môi có hỗ trợ enzym 52

2.3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm và độ già của lá 53

2.3.5 Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết lá chè 53

2.4 Định tính, định lượng polyphenol trong cao chiết lá chè 54

2.4.1 Định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá chè bằng thuốc thử 54

2.4.2 Định tính polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 56

2.4.3 Định tính bằng UV-VIS 56

2.4.4 Định tính và định lượng polyphenol bằng HPLC 57

2.5 Xác định hoạt tính sinh học của dịch chiết chè 57

2.5.1 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết chè 57

2.5.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 58

2.6 Khảo sát các quy trình quy trình sấy 61

2.6.1 Sấy nhiệt độ cao 61

2.6.2 Sấy thăng hoa 61

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

3.1 Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết tách polyphenol của lá chè 64

3.1.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát các yếu tố công nghệ 64

3.1.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát ảnh hưởng của enzym 65

3.1.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát hoạt tính oxy hóa 65

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi polyphenol 66

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 66

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng 67

3.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 68 3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng 69

3.2.5 Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng 70

3.3 Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè 71

3.4 Ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác 72

3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym đối với hiệu quả chiết tách polyphenol 73

3.5.1 Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol 73

3.5.2 Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol 74

3.6 Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol đến hàm lượng polyphenol tổng 75

3.7 Kết quả định tính, định lượng polyphenol trong lá chè 76

3.7.1 Định tính các hợp chất trong lá chè bằng thuốc thử 76

3.7.2 Định tính bằng TLC 77

3.7.3 Định tính bằng UV – VIS 78

3.7.4 Định lượng polyphenol lá chè bằng HPLC 79

3.8 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của lá chè 80

3.8.1 Kết quả hoạt tính oxy hóa 80

3.8.2 Hoạt tính kháng khuẩn 82

3.9 Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè 85

3.9.3 Sấy thăng hoa cao chiết lá chè 87

3.10 Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da 89

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92

4.1 Kết luận 92

4.2 Kiến nghị 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu 21

Bảng 3 1: Phương trình đường chuẩn axit gallic 64

Bảng 3 2: Phương trình đường chuẩn axit gallic 65

Bảng 3 3: Phương trình đường chuẩn axit gallic 65

Bảng 3 4: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 66

Bảng 3 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng 67

Bảng 3 6: Ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 68

Bảng 3 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng 69

Bảng 3 8: Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng 70

Bảng 3 9: Khảo sát Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá 71

Bảng 3 10: Khảo sát một số quy trình chiết khác 72

Bảng 3 11: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol 73

Bảng 3 12: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol 74

Bảng 3 13: Khảo sát Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol 76

Bảng 3 14: Kết quả khảo sát định tính các nhóm chất 77

Bảng 3 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol 78

Bảng 3 16: Kết quả đo bước sóng của dịch chè sau khi tinh chế 78

Bảng 3 17: Hàm lượng các chất trong polyphenol 79

Bảng 3 18: Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 80

Bảng 3 19: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ 81

Bảng 3 20: Kết quả lực kháng oxy hoá theo nồng độ 81

Bảng 3 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè 83

Bảng 3 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 86

Bảng 3 23: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da 90

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT 5

Hình 1 2: Công thức cấu tạo của catechin 11

Hình 1 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG 11

Hình 1 4: Công thức cấu tạo của ECG 13

Hình 1 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B) 13

Hình 1 6: Công thức cấu tạo của Anthoxanthin 14

Hình 1 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin 16

Hình 1 9: Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi 34

Hình 1 10: Vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi 35

Hình 1 11: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi 37

Hình 1 12: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi 38

Hình 1 13: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi 41

Hình 2 1: Lá chè sau khi xử lý 50

Hình 2 2: Thiết bị chiết tách 51

Hình 2 3: Mẫu đo UV - VIS 51

Hình 2 4: Hệ thống cô quay chân không 51

Hình 2 5: Mẫu chè được ủ với enzyme 53

Hình 2 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao 57

Hình 2 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hoá 58

Hình 2 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn 59

Hình 2 9: Tủ sấy nhiệt độ cao 61

Hình 2 10: Thiết bị sấy thăng hoa 62

Hình 3 1: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 64

Hình 3 2: Đường chuẩn axit gallic 64

Hình 3 3: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 65

Hình 3 4: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 66

Hình 3 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ tới hàm lượng polyphenol tổng 66

Hình 3 6: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian tới hàm lượng polyphenol tổng 68

Hình 3 7: Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 69

Hình 3 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng 70

Hình 3 9: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ PH đến hàm lượng polyphenol tổng 71

Hình 3 10: Biểu đồ ảnh hưởng của độ non già của lá 72

Hình 3 11: Biểu đồ ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác đến hàm lượng polyphenol tổng 73

Hình 3 12: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym cenlulozo đến hàm lượng polyphenol tổng 74

Hình 3 13: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym pectinase đến hàm lượng polyphenol tổng 74

Hình 3 14: Cao chiết lá chè được tinh chế với clorofom và etylaxetat 75

Hình 3 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol 76

Hình 3 16: Định tính polyphenol bằng TLC hiện bản UV: 254 nm 77

Hình 3 17: Phổ quét bước sóng UV VIS của dịch chè trước và sau tinh chế 79

Hình 3 18: Phổ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 80

Hình 3 19: Biểu đồ khả năng oxy hoá các loại lá 81

Hình 3 20: Biểu đồ lực kháng oxy hoá theo nồng độ 82

Hình 3 21: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè 83

Hình 3 22: Khả năng kháng 5 chủng vi khuẩn của cao chiết lá chè 84

Hình 3 24: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol 85

Hình 3 23: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol 86

Hình 3 25: Bột chiết lá chè sau khi sấy thăng hoa 87

Hình 3 25: Kem dưỡng da từ cao chiết lá chè 90

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 1: Phân loại polyphenol 10

Sơ đồ 1 2: Quy trình tinh chế polyphenol 32

Sơ đồ 2 1: Quy trình chiết tách polyphenol 49

Sơ đồ 2 2: Sơ đồ tinh chế polyphenol 54

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây chè là sản phẩm nông nghiệp chủ yếu của đất nước ta, theo thống kê của

Hiệp hội Chè Việt Nam, khối lượng xuất khẩu chè tháng 8 năm 2017 ước đạt 13 nghìn

tấn đưa khối lượng xuất khẩu chè 8 tháng đầu năm 2017 ước đạt 90 nghìn tấn Đối với

tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu có thuận lợi về khí hậu và địa hình nương rẫy, phù hợp cho diện

tích trồng chè lớn.[77] Ngành công – nông nghiệp và thương mại chè đã giải quyết công

ăn việc làm cho hàng triệu lao động, đặc biệt ở các vùng khó khăn, vùng trung du đồi

núi Theo thống kê của Tổng cục hải quan, trong khoảng 5 năm gần đây, kim ngạch

xuất khẩu chè bình quân của Việt Nam vào khoảng 150 triệu USD Điều này cho thấy,

sản phẩm chè Việt Nam đã có chỗ đứng trên thị trường thế giới và đã có đóng góp

không nhỏ vào nền kinh tế nước nhà Tuy nhiên, sự phát triển của cây chè và các sản

phẩm từ chè Việt Nam hiện nay chưa tương xứng với tiềm năng của nó, đời sống

người trồng và chế biến chè vẫn khó khăn do giá trị sản phẩm thấp Do vậy, cần đẩy

mạnh việc đầu tư nghiên cứu nâng cao chất lượng, đa dạng hóa sản phẩm chế biến,

đồng thời cần nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính sinh học cao (polyphenol)

nhằm ổn định, phát triển sản xuất và nâng cao giá trị của cây chè Việt Nam

Nhiều kết quả ngiên cứu cho thấy hợp chất trong chè xanh có hoạt tính sinh học

như: hoạt tính chống oxy hóa, chống xơ vữa động mạch, chống các bệnh về tim mạch,

ngăn chặn sự phát triển của khối u, đặc biệt là ung thư da, bảo quản thực phẩm.[78]

Liên quan đến hoạt tính sinh học, Fumio và cộng sự [35]

đã chỉ ra rằng, khả năng quét gốc tự do DPPH của các catechin chè cao gấp 6 đến 16,4 lần α – tocopherol hay từ 4,3

đến 11,8 lần vitamin C Ngoài ra, hoạt tính này của chè xanh cũng cao gấp 1,4 lần so

với hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so với oải hương.[70]

Gần đây, khi so sánh khả năng quét gốc tự do DPPH của chè vàng (một loại chè bán

lên men) với một số đối tượng khác, Barhe và Tchouya[23] cũng chỉ ra rằng, hoạt tính

này của chất chiết chè vàng > chất chiết đỗ tương > vang đỏ > hibiscus Bên cạnh hoạt

tính kháng oxi hóa, nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng chỉ ra rằng, polyphenol (chất

chiết chè) có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây ngộ độc và gây thối

hỏng thực phẩm.[21][49] Điều này cho thấy, đối tượng này không chỉ có tiềm năng ứng

dụng cao trong mỹ phẩm, dược phẩm mà còn mở ra những ứng dụng quan trọng trong

chè như một chất bảo quản tự nhiên không độc hại Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong

bối cảnh hiện nay,khi tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm đang ngày càng trở lên

trầm trọng, mất kiểm soát ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam

Có thể thấy, mặc dù việc nghiên cứu chiết xuất polyphenol trong lá chè xanh

cũng như việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học của chúng đã được báo cáo Tuy

nhiên những nghiên cứu này thường giới hạn hoặc với dung môi nước nên hiệu quả

chiết tách còn hạn chế, hoặc sử dụng các kỹ thuật hiện đại chi phí đầu tư cao, khó áp

dụng trong điều kiện Việt Nam hiện nay như trích ly có hỗ trợ vi sóng hay trích ly

dùng sóng siêu âm, nhiều công trình nghiên cứu và khai thác hoạt tính sinh học của

Polyphenol từ chè xanh, nhưng ở Việt Nam vấn đề này còn khá mới mẻ, nhất là hoạt

tính kháng khuẩn Để khai thác lợi ích của chúng một cách tối ưu, các thành phần hóa

học có hoạt tính sinh học có trong lá chè xanh vẫn cần phải được nghiên cứu sâu hơn

và hướng tới thương mại hóa sản phẩm ra thị trường, đặc biệt đối với những khu vực

có trữ lượng trà xanh lớn như các nước Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ Vì vậy;

trong nghiên cứu này này, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách hợp chất

POLYPHENOLS ứng dụng trong Dược - Mỹ Phẩm và Thực phẩm từ lá Chè Xanh

được trồng tại xã Suối Nghệ - huyện Châu Đức - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu” nhằm tìm ra

phương pháp chiết tách polyphenol phù hợp ở điều kiện Việt Nam và khảo sát hoạt

tính sinh học của chúng với nguồn chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu Từ đó nghiên

cứu ứng dụng của chúng làm mặt nạ dưỡng da nhằm giải quyết các vấn đề: Lợi ích

kinh tế cho người trồng chè, khai thác triệt để hoạt tính sinh học của polyphenol, tạo ra

sản phẩm đẹp da, chất lượng tốt và an toàn

2 MỤC TIÊU

- Xây dựng được quy trình chiết tách các hợp chất polyphenol từ lá chè xanh

- Tính chất hóa lý, định tính, định lượng polyphenol trong lá chè

- Đánh giá được khả năng oxy hóa và kháng khuẩn của polyphenol trong lá chè

- Ứng dụng cao polyphenol trong các sản phẩm làm đẹp da

3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu này các nội dung được giới hạn như sau:

- Đối với lá chè khảo sát: chúng tôi sử dụng chè trồng tại xã Suối Nghệ, huyện Tân

Thành, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu

- Đối với nghiên cứu chiết tách polyphenol: phương pháp trích ly bằng dung môi

được chúng tôi sử dụng Do đây là phương pháp khá đơn giản, có khả năng cho

hiệu suất thu hồi cao Bên cạnh đó, phương pháp này cũng chỉ đòi hỏi đầu tư vừa

phải, dễ áp dụng cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ, phù hợp với điều kiện Việt

Nam

- Đối với xác định hoạt tính oxy hóa: Xác định lực kháng oxy hoá tổng (total

antioxydant capacity) theo mô hình phospho molybdenum.[56]

- Đối với hoạt tính kháng khuẩn: Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết được xác

định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên 5 chủng vi khuẩn Escherichia

coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và

Salmonella typhi được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Đại Học Công Nghiệp

Thành Phố Hồ Chí Minh

- Đối với nghiên cứu ứng dụng chất chiết polyphenol chè trong dược mỹ phẩm:

Nghiên cứu trên 2 dòng sản phẩm Mặt nạ dưỡng da và kem dưỡng da từ trà xanh

Các thí nghiệm được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa

Vũng Tàu

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác

- Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng

(TLC), UV-VIS

- Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đường

kính vòng vô khuẩn

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

5.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả của đề tài tạo ra bộ dữ liệu khoa học tương đối toàn diện về hàm lượng

các hợp chất có hoạt tính sinh học cao (định tính, định lượng hàm lượng polyphenol

tổng số, các catechin thành phần) cũng như hoạt tính sinh học (khả năng kháng oxi

hóa, kháng khuẩn), so sánh hàm lượng polyphenol tổng số của các loại chè non, chè

già của giống chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu Các dữ liệu khoa học này là nguồn

tư liệu hữu ích cho công tác đào tạo, nghiên cứu và khai thác chè ở tỉnh Bà Rịa Vũng

Tàu nói riêng và Việt Nam nói chung

- Kết quả nghiên cứu công nghệ trích ly polyphenol từ lá chè đã bổ sung thêm

các thông tin khoa học quan trọng cho biết ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến

hiệu suất thu hồi polyphenol lá chè Đây là nguồn thông tin khoa học hữu ích trong

việc nghiên cứu và triển khai sản xuất bột chiết polyphenol từ chè xanh nguyên liệu

- Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của enzym cenlulozo, pectinase tới

hiệu suất chiết tách polyphenol trong lá chè

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài góp phần nâng cao giá trị của cây chè ở nước ta, đồng thời góp phần cải

thiện đời sống người nông dân

- Sản phẩm của luận án tinh chế polyphenol tạo ra các sản phẩm thực phẩm, thực

phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm

6 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu tổng thể và đánh giá về hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh

học là polyphenol tổng số của giống chè ở Suối Nghệ, Bà Rịa Vũng Tàu

- Việc sử dụng hệ dung môi etanol nước trong trích ly polyphenol từ lá chè, đã đề

xuất được quy trình công nghệ chiết tách chế phẩm polyphenol cho hiệu suất thu hồi

và chất lượng chế phẩm cao (bao gồm độ tinh sạch và khả năng kháng oxy hóa, kháng

khuẩn) Với quy trình này, việc chuyển giao cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ ở Việt

Nam là hoàn toàn khả thi và thuận lợi, không phải đầu tư lớn, tận dụng được nguồn

phụ phẩm chế biến chè

- Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của 2 loại enzym cenlulozo và pectinase đối với

hiệu suất chiết tách polyphenol trong lá chè

- Nghiên cứu ứng dụng trong các sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc tự nhiên Thúc

đẩy nền công nghiệp Mỹ phẩm sản xuất hàng Việt Nam chất lượng cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây chè

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè

Cây chè có tên khoa học Camellia sinensis (L) O Kuntze được phát hiện bởi

người Trung Quốc vào khoảng 2700 TCN Hiện nay, nhiều nghiên cứu cho rằng, cây

chè có nguồn gốc phát sinh ở miền núi phía Nam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ và miền núi

phía Bắc Việt Nam [6] Chè phân bố khá rộng, trong những điều kiện tự nhiên rất khác

nhau, từ 30 độ vĩ nam (Natan - Nam Phi) đến 43 độ vĩ bắc (Grudia), tập trung ở vùng

nhiệt đới và á nhiệt đới [9]

Hình 1 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT

1.1.2 Phân loại

Cây chè thuộc: Ngành hạt kín (Angiospermae), Lớp song tử diệp

(Dicotyledonae), Bộ chè (Theales), Họ chè (Theaceae), Chi chè (Camellia) và Loài

(Camellia (Thea) sinensis) Hiện nay, chè được chia thành 4 giống chính:[9]

* Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var bohea)

Thuộc loại cây bụi thấp, phân cành nhiều, lá nhỏ (dài 3,5 – 6,5 cm), dày nhiều

gợn sóng, màu xanh đậm, răng cưa nhỏ, không đều Giống này có đặc điểm năng suất

thấp, chất lượng trung bình nhưng khả năng chịu rét tốt Phân bố chủ yếu ở miền

Đông, Đông nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số vùng khác

* Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var macrophylla)

Cây thuộc loại thân gỗ nhỡ, cao tới 5 m trong điều kiện sinh trưởng tự nhiên Lá

to trung bình, màu xanh nhạt, bóng, răng cưa sâu không đều, đầu lá nhọn Giống có

đặc điểm năng suất cao, chất lượng tốt Nguyên sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung

Quốc)

* Chè Shan (Camellia sinensis var shan)

Cây thuộc loại thân gỗ, cao từ 6 đến 10 m Lá to, màu xanh nhạt, đầu lá dài,

răng cưa nhỏ và dày Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng và mịn trông như tuyết nên còn

gọi là chè tuyết Giống có đặc điểm năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng thích

ứng trong điều kiện ấm ẩm, phát triển tốt ở vùng có địa hình cao Nguyên sản ở Vân

Nam - Trung Quốc, miền bắc của Miến Điện và Việt Nam

* Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var assamica):

Thân gỗ cao tới 17 m, phân cành thưa, lá dài tới 20 - 30 cm, mỏng, mềm, thường có

màu xanh đậm, dạng lá hình bầu dục, phiến lá gợn sóng, đầu lá dài Giống này thuộc

loại có năng suất cao, phẩm chất tốt nhưng không chịu được rét hạn Giống được trồng

nhiều ở Ấn Độ, Miến Điện, Vân Nam (Trung Quốc) và một số vùng khác

1.1.3 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam

Năm 2012, Việt Nam đã vươn lên hàng thứ sáu thế giới về diện tích (115.964

ha), thứ năm về sản lượng chè (216.900 tấn), chỉ đứng sau Trung Quốc, Ấn Độ,

Srilanka, Kenya và tương đương Indonesia Trong 15 năm, từ 1995 – 2010, diện tích

chè của nước ta đã tăng 2,2 lần từ 52.100 ha lên 113.200 ha, sản lượng tăng 4,94 lần từ

40.200 tấn lên 198.466 tấn.[79]

Theo ước tính của Hiệp hội chè Việt Nam, cả nước hiện có khoảng 6 triệu lao

động sống dựa vào ngành công – nông nghiệp trồng và chế biến chè, và 116 doanh

nghiệp tham gia xuất khẩu chè, hàng năm thu về gần 200 triệu đô la, đóng góp không

nhỏ vào sự phát triển chung của nền kinh tế nước nhà

Về các giống chè ở Việt Nam, bên cạnh giống truyền thống (Trung du), hiện

chúng ta đã chọn lọc và lai tạo được khá nhiều giống mới

1.1.4 Thành phần hóa học cơ bản của lá chè

1.1.4.1 Nước

Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè, thường chiếm từ 75 - 82% trọng

lượng búp Hàm lượng nước trong búp thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ

thuật canh tác và tiêu chuẩn thu hái [4]

1.1.4.2 Tannin chè

Tannin thiên nhiên đều là hỗn hợp của gallic acid và digallic acid ở dạng tự do

cũng như kết hợp với glucose Đây là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật và

được chia làm hai dạng: tannin thủy phân (tannin pyrogallic) và tannin không bị thủy

phân (tannin pyrocatechin) Tannin trong chè tồn tại ở cả hai dạng trên nhưng chủ yếu

là dạng pyrocatechin Pyrocatechin là hỗn hợp polymer của catechin và

leucoanthocyanidin.[10] Hàm lượng tannin trong chè vào khoảng 32-40% CK, phụ

thuộc vào giống, độ non già của lá, mùa vụ thu hoạch và chế độ canh tác.[9]

1.1.4.3 Polyphenol

Polyphenol là thành phần quan trọng nhất, quyết định chính đến màu sắc,

hương vị và tính chất dược lý của nước chè pha Thành phần chính của polyphenol chè

là các hợp chất catechin Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của polyphenol chè

không giống nhau mà thay đổi theo từng giống, tiêu chuẩn và mùa vụ thu hái, điều

kiện vĩ độ, thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác,

1.1.4.4 Alkaloid

Trong chè có nhiều loại alkaloid nhưng nhiều nhất là caffeine Hàm lượng

caffeine trong chè vào khoảng 2 - 4% CK, thay đổi theo giống, độ non già của lá, thời

vụ thu hoạch và điều kiện canh tác Caffeine có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung

ương, hoạt động của thận, của tim và có tác dụng lợi tiểu.[9]

1.1.4.5 Amino acid và protein

Trong chè, protein chiếm khoảng 18% CK và có khoảng 17 loại amino acid

Protein trong lá chè chủ yếu là dạng glutelin hoà tan trong kiềm Trong quá trình chế

biến, protein và amino acid đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương và vị của

nước chè pha.[4]

1.1.4.6 Carbohydrate

Glucid trong chè rất đa dạng, bao gồm các monosacharide (chiếm khoảng 1 -

2%) và các polysaccharide (chiếm 10 – 12%) Ở chè, các dạng đường tan trong nước

có hàm lượng không nhiều nhưng rất cần thiết cho việc hình thành chất lượng đặc

trưng của chè thành phẩm.[4]

1.1.4.7 Tinh dầu

Tinh dầu trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong lá chè tươi vào khoảng

0,007 – 0,009% và trong chè bán thành phẩm khoảng 0,024 – 0,025% Hàm lượng này

phụ thuộc nhiều vào giống và độ cao trồng trọt.[9]

1.1.4.8 Vitamin

Có nhiều loại vitamin trong chè Chính vì vậy, giá trị dược liệu cũng như giá trị

dinh dưỡng của chè rất cao Hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1000 g

chất khô như sau: Vitamin A: 54,6; B1: 0,7; B2: 12,2; PP: 47,0; C: 27,0 v.v Đáng

chú ý nhất là hàm lượng vitamin C ở trong chè nhiều hơn trong cam chanh từ 3 đến 4

lần.[4]

1.1.4.9 Enzyme

Trong búp chè có hầu hết các loại enzyme nhưng chủ yếu gồm hai nhóm chính:

nhóm thủy phân (amylase, glucosidase, protease ) và nhóm oxi hóa khử (peroxidase

và polyphenoloxidase) Các enzym này đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế

biến chè.[4]

1.1.4.10 Chất tro

Hàm lượng tro trong chè tươi vào khoảng 4 - 5% CK và lên tới 5 - 6% CK

trong chè thành phẩm Các chất khoáng có nhiều trong chè là K, Se, Mn, Zn [4]

1.1.5 Dược tính của chè

Chè là loại nước uống tốt nhất trên thế giới, mọi người điều biết chè đã được sử

dụng như là một phương thuốc trong y học phương đông từ rất lâu Căn cứ vào các

sách đông y dược, ghi chép qua các thời đại và thực tiễn chứng minh chẳng những bảo

vệ sức khỏe mà còn có tác dụng điều trị nhiều loại bệnh, nên người ta coi chè là loại

thuốc chữa bệnh

Tuy nhiên các hiểu biết về cơ chế tác đông của lá chè mới được bắt đầu nghiên

cứu mạnh mẽ trong thế kỉ 20 Trước đây tác dụng của trà được cho rằng do tác động

của các thành phần caffeine và vitamin C Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế kỉ

20, việc nghiên cứu chi tiết về chè đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý của

chè là do sự có mặt của nhiều nhóm hợp chất như; alcoloid: caffeine, theophyllin,

theobromin, purin Các flavonoid, chất catechin, lipid, dẫn chất phenol, tinh dầu, các

acid amin và nhiều sinh tố cùng các nguyên tố hằng lượng và vi lượng như P, sắt, iod,

Mg, Cu….tổng cộng trên 300 loại thành phần các thành phần này có tác dụng trọng

yếu trong phòng và chữa bệnh đối với cơ thể con người

Một số tác dụng cụ thể của trà:

- Tinh thần nâng cao, đầu óc tỉnh táo: khi đầu óc xây xẩm, tinh thần mệt mỏi,người

ta uống một chén chè mới pha, sẽ cảm thấy tinh thần sảng khoái

- Thanh lợi đầu và mắt: uống trà lâu dài có thể thanh lợi đầu và mắt, đạt tác dụng

làm tinh thần sảng khoái, mắt tinh, tai sáng Trong trà có chứa nhiều thành phần

dinh dưỡng có quan hệ tới thị lực như là: tiền sinh tố A ( β − caroten ), vitamin B1,

B2, và C, đều là những chất cần thiết duy trì thị lực

- Tiểu thử giải khát: sau khi uống trà nóng, tinh dầu thơm trong trà và caffeine mau

phát huy tác dụng, làm giãn huyết quản, mở tuyến mồ hôi, thân thể hơi toát mồ

hôi, tán phát nhiệt lượng trong cơ thể, do đó đạt được mục đích tiêu thử giáng thấp

thanh nhiệt, sau khi uống trà nóng gia tăng được lượng nước tiểu, làm cho tiểu tiên

bài tiết điều hòa, tự nhiên sẽ có bộ phận nhiệt lượng thoe đường tiểu tiện tiết ra

ngoài, làm cho ra mồ hôi Ngoài ra, làm co dãn cơ trơn dạ dày, ruột giãn giải co

thắt trường vị, cho nên uống trà điều trị được thử nhiệt, sa khí, đau bụng

- Giảm béo: chè xanh chứa nhiều thành phần như chứa chất dẫn phenol, flavonoid,

quereetin cùng nhiều loại sinh tố, nhất là vitamin C với lượng lớn dẫn chất phenol

trong lá chè giáng giải chất mỡ, flavonoid, quereetin hỗ trợ việc giáng thấp

cholesterol Vitamin C hỗ trợ lợi tiểu làm cholesterol bài tiết ra ngoài nhanh

chóng Các vitamin khác cải thiện cơ năng chuyển hóa của cơ thể, hỗ trợ và để

phòng mạch máu bị xơ cưng Trong lá chè có diệp lục (chlorophyll ) sau khi vào

cơ thể, sẽ loại cholesterol từ thức ăn, ngăn cản tiêu hóa hấp thụ cholesterol trong

cơ thể

Ngoài ra còn trà còn rất là nhiều công dụng khác như sử dụng trong mỹ phẩm,

vì chúng có tác dụng làm ẩm da và chống nếp nhăn, có trong thuốc đánh răng có tác

dụng diệt khuẩn

1.2 Polyphenol trong chè

1.2.1 Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật

Các hợp chất phenol là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật, rất đa dạng

về cấu trúc và chức năng Trong cây, nhìn chung hàm lượng của chúng ở các bộ phận

khác nhau là khác nhau Các phenol không hòa tan trong nước (lignin,

hydroxycinnamic acid ) thường là thành phần của thành tế bào, trong khi loại hòa tan

thường cư trú ở không bào.[73]

Sơ đồ 1 1: Phân loại polyphenol

1.2.2 Các hợp chất Polyphenol có trong chè

Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong

chè Nhờ các hợp chất này mà chất chiết từ chè xanh có những đặc tính quý giá như

khả năng chống ung thư, chống oxy hóa, giảm cholesteron trong máu…

Các hợp chất polyphenol trong chè chủ yếu là các hợp chất flavonoid, trong đó chia

Trong các loại thực vật, catechin thường tồn tại ở trạng thái tự do hoặc ở dạng

este với axit gallic Catechin trong chè thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3- ol, là thành

phần chính của polyphenol chè Đồng thời nó cũng có vai trò quyết định trong hoạt

tính sinh học và tính chất cảm quan của nước chè pha.[21], [49] Catechin có công thức

cấu tạo chung như sau:

Hình 1 2: Công thức cấu tạo của catechin Trong các hợp chất catechin, R1 và R2 có thể cùng là nguyên tử H-, R2 có thể là

gốc galloyl, R1 cũng có thể là gốc –OH

Khi R1 = R2 = H ta có catechin (C); khi R1 = H, R2 = OH ta có gallocatechin

(GC) Khi R2 là gốc galloyl, còn R1 là OH thì chất trên sẽ là catechingallate (CG) và

nếu R2 là gốc galloyl, còn R1 là H thì chất tạo thành là gallocatechingallate (GCG)

Bên cạnh đó, cấu trúc phân tử của catechin có phân tử có 15 cacbon bao gồm hai vòng

6 cacbon A và B được nối bởi 3 đơn vị cacbon ở vị trí 2; 3; 4, hình thành một dị

vòng C chứa một nguyên tử oxy Cấu trúc của catechin có chứa hai cacbon bất đối ở

vị trí 2 và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2; 3 và nhóm 4-oxo nên có thể tạo ra nhiều

đồng phân khác nhau Hiện nay đã nhận diện được 7 catechin trong chè là

Epigallocatechingallate (EGCG), Epicatechingallate (ECG), Epigallocatechin (EGC),

Gallocatechingallate (GCG), Epicatechin (EC), Gallocatechin (GC) và Catechin (C)

Trong đó, các catechin chủ yếu là EGCG, EGC, ECG, EC và C.[18]

Hàm lượng catechin trong chè có thể lên đến 15 - 20 % CK và thường chiếm trên 70 % tổng lượng

polyphenolcủa lá chè.[10]

EGCG

Đây là thành phần chính trong các hợp chất catechin của chè, công thức phân tử

C22H18O11, không màu, kết tinh hình kim nhỏ, vị chát hơi đắng, có khả năng kết tủa

với gelatin, tan trong nước, dễ tan trong acetone, ethanol, ethylacetate [4]

Trong công thức cấu tạo, R2 là nhóm –OH và R1 là gốc galloyl

Hình 1 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG

Do trong công thức phân tử vừa có gốc galloyl, vừa có 3 nhóm –OH ở vòng B

nên EGCG được cho rằng có cấu trúc phân tử và các trung tâm hoạt động chống oxi

hóa hiệu quả nhất trong các catechin chè Khi nghiên cứu hiệu quả quét gốc tự do

DPPH của catechin và các dẫn xuất của nó, Nanjo và cộng sự [52] đã chỉ ra rằng, hiệu

quả quét gốc tự do của các catechin được galloyl hóa (EGCG, ECG, CG) mạnh hơn

nhóm không có gốc galloyl (C, EC, GC, EGC) và các catechin mà vòng B có 03 nhóm

–OH thì hiệu quả hơn so với các catechin chỉ có 2 nhóm -OH Tuy nhiên các tác giả

cũng chỉ ra rằng, ngoài đặc tính cấu trúc thì mức độ phân cực, trạng thái ion hóa và cấu

hình không gian cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu quả kháng oxi hóa của các hợp chất

này

Về hàm lượng EGCG trong lá chè, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hàm lượng

này phụ thuộc rất lớn vào giống chè, độ non già của lá và mùa vụ thu hoạch.[22] [27] Lin

và cộng sự [44] đã phân tích 10 giống chè Đài Loan vào vụ hè (chiết bằng nước ở

700C/30 phút, tỷ lệ chè/nước là 1/10) cho kết quả trung bình về hàm lượng EGCG là

2,6 ± 0,2% CK Tuy nhiên hàm lượng này lên tới 9,1 đến 12,9% CK trong búp chè tại

Australia.[74]

EGC

Trong chè, EGC là thành phần catechin có hàm lượng đứng thứ 2, chỉ sau

EGCG Thành phần này có công thức phân tử C15H14O7, kết tinh hình kim nhỏ không

màu, vị chát mạnh nhưng có vị ngọt, không tác dụng với gelatin, tan trong nước và

ethylacetate, dễ tan trong acetone.[4]

Trong lá chè, hàm lượng EGC thay đổi theo giống, độ non già của lá và mùa vụ

thu hoạch.[27][74] Với thành phần này, Lin và cộng sự [44] thu được kết quả 1,1 ± 0,1%

CK, trong khi nó lên tới 3,6 đến 5,2% CK trong nghiên cứu của Yao và cộng sự

(2005).[74]

ECG

Epicatechingallate là thành phần có hàm lượng thường đứng thứ 3 sau EGCG

và EGC Đây là một trong các catechin được galloyl hóa Trong công thức cấu tạo, gốc

galloyl được gắn vào vị trí C3 ở vòng C (hình 1.4) Cấu tử này có công thức phân tử

C15H18O10, kết tinh hình kim nhỏ không màu, vị chát hơi đắng, tác dụng với gelatin

cho kết tủa màu trắng, tan trong nước, dễ tan trong acetone, ethanol, ethylacetate [4]

Hàm lượng ECG cũng thay đổi tùy theo giống chè, độ non già của lá và mùa vụ

thu hoạch Kết quả nghiên cứu của Lin [44] và Yao [74] về hàm lượng catechin này là 1,1

± 0,1% CK và từ 3,2 đến 4,1% CK tương ứng

Hình 1 4: Công thức cấu tạo của ECG

EC và C

Đây là 2 cấu tử catechin có hàm lượng thấp nhất trong các catechin chè Công

thức phân tử của nó là C15H11O6, ở dạng tinh khiết không màu, kết tinh hình lăng trụ,

chát dịu có dư vị ngọt, không kết tủa với gelatin, khó tan trong nước lạnh nhưng dễ tan

trong nước nóng, ethanol, acetone [4]

Hình 1 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B) Cũng giống như các thành phần khác, hàm lượng EC và C thay đổi theo giống,

độ non già của lá [74]

Kết quả phân tích của Lin và cộng sự [44] trong 10 giống chè Đài Loan cho hàm lượng trung bình của chúng là 0,33% và 0,13% CK tương ứng

Tính chất của các hợp chất catechin có trong chè

Các hợp chất catechin trong lá chè đã được tách ra từng chất ở dạng tinh khiết,

ở thể rắn chúng là những chất kết tinh không màu, hình kim hoặc hình lăng trụ, có vị

chát ở mức độ khác nhau, riêng hai chất L-EGC và este gallat của nó có vị chát hơi

đắng khi ở dạng tự do và chuyển thành vị chát dịu khi ngưng thành các catechin

Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, axeton, etyl axetat tạo

dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít

phân cực như benzen hoặc clorofooc

Các catechin tác dụng với FeCl3 cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo

số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử Các catechin có tính khử mạnh nên dễ dàng bị

oxy hóa bởi dung dịch KMnO4 trong môi trường axit và bởi dung dịch I2 trong môi

trường kiềm, chúng có thể tự oxy hóa trong không khí ẩm Dưới tác dụng của các men

oxy hóa khử hoặc nhiệt độ cao, các chất catechin bị oxy hóa và tiếp đến sản phẩm oxy

hóa trung gian của chúng lại gây ra hàng loạt các biến đổi hóa học làm chuyển hóa các

chất có trong lá chè, góp phần tạo ra các chất thơm đặc trưng cho các loại chè

1.2.2.2 Hợp chất anthoxanthin (flavonol)

Các hợp chất anthoxanthin trong chè đã được nhận dạng là kaempferol,

quercetin và myricetin Các hợp chất này thường tồn tại ở cả dạng tự do và kết hợp

(dạng glycoside) Hàm lượng anthoxanthin trong chè rất thấp nếu so sánh với các

catechin Trong giống chè Trung Quốc, chúng chỉ dao động từ 0,4 – 1,5% CK.[4]

Chúng có công thức cấu tạo chung như sau [7]:

Hình 1 6: Công thức cấu tạo của Anthoxanthin Trong đó:

- Nếu R1 = R3 = (-H); R2 = (-OH): ta có chất Kaempferol

- Nếu R1 = R2 = (-OH); R3 = (-H): ta có chất Quercetin

- Nếu R1 = R2= R3 = (-OH): ta có chất Myricetin

Các anthoxanthin trong lá chè tươi tồn tại cả hai dạng tự do và kết hợp, hơn nữa

các glycosid của chúng thường đính gốc đường tại vị trí thứ 3

1.2.2.3 Hợp chất anthocyanin

Hợp chất anthocyanin thuộc nhóm flavonoid dẫn xuất croman Trong thực vật,

hầu như các hợp chất anthocyanin đều tồn tại ở trạng thái kết hợp với các gốc đường

(glycosid)

Tất cả các anthocyanin đều có chứa trong vòng pyran oxy hóa trị tự do

Ở trạng thái tự do, anthocyanin gồm 3 aglycon chủ yếu là pelargonidin, cyanidin và

delphinidin

Các glycosid của anthocyanin được tạo thành do gốc đường glucoza,

galactoza hoặc ramnoza kết hợp với gốc aglycon có màu gọi là anthocyanidin Do đó,

khi thủy phân các glycosid của anthocyanin thì được đường và anthocyanidin.[6][7]

Chúng tan trong nước và có trong dịch bào thực vật, có vị đắng và màu sắc thay đổi

phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: hàm lượng catechin và anthoxanthin, nhiệt độ dung

dịch và nồng độ của chúng Nhìn chung, các giống chè có búp màu tím thường hàm

lượng anthocyanin cao hơn búp màu xanh.[4]

1.2.2.4 Phenol carbocylic acid

Axit phenol cacboxylic là nhóm chất tự nhiên có trong thực vật, trong phân tử

có chứa nhóm phenol và nhóm cacbonyl

Trong lá chè tươi có nhiều acid hữu cơ như: gallic acid, ellagic acid,

methadigallic acid, chlorogenic acid, cafeic acid, para-coumaric acid, galloylquinic

acid Tuy nhiên hàm lượng của chúng không cao Trong các acid này, gallic acid có

vai trò quan trọng trong việc hình thành chất chát và hoạt tính kháng oxi hóa của dich

chiết chè [4] Fernandez và cộng sự [33] đã phân tích hàm lượng gallic acid trong 12 mẫu

chè xanh có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, các tác giả cho biết hàm lượng

này rất thấp, chỉ dao động từ 0,004% CK đến 0,12% CK

1.2.2.5 Hợp chất leucoanthocyanin

Hợp chất leucoanthocyanin là sự kết hợp của các gốc aglycol với gốc đường

(glycosid) Các leucoanthocyanin trong thành phần polyphenol chè thường gặp là

leucoxyanidin và leucodelphinidin Chúng tồn tại ở cả trạng thái tự do và dạng

glycoside Hàm lượng của chúng trong lá chè tươi cũng rất ít nếu so sánh với các

catechin Các leucoanthocyanin là dạng trung gian giữa catechin và anthocyanin.[4]

Hình 1 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè

Giống chè: Hàm lượng polyphenol/catechin phụ thuộc rất lớn vào giống chè

Nhìn chung, chè Ấn Độ (Asammica) thường có hàm lượng polyphenol cao hơn giống

chè Trung Quốc (Sinensis).[9] Wu và cộng sự [71] cho biết, hàm lượng catechin tổng số

trong 04 giống chè Trung Quốc (Ziya, Wuniuzao, Huangyezao, Fudingdabaicha) dao

động từ 11,4% CK đến 22,5% CK Ở Việt Nam, Vũ Hồng Sơn và Hà Duyên Tư [7]

đã chỉ ra rằng, hàm lượng polyphenol tổng số của giống chè Shan > PH1 > Trung du >

LDP1 Nhìn chung hàm lượng này trong lá non thu hái vụ đông dao động trong

khoảng từ 17,5 – 19,6% CK

Độ non già của nguyên liệu: Độ non già của lá chè có ảnh hưởng rất lớn đến

hàm lượng polyphenol Nhìn chung, lá càng non hàm lượng polyphenol/catechin càng

lớn Trong một búp chè, hàm lượng này giảm theo thứ tự: lá 1 > lá 2 > lá 3 > cuộng.[10]

Trong nghiên cứu của Baptista và cộng sự,[22] hàm lượng polyphenol tổng số đạt

18,5% CK trong búp 1 tôm 2 lá, trong khi nó chỉ là 11,5% CK trong các lá bánh tẻ và

già (hỗn hợp từ lá thứ 3 đến lá thứ 8)

Mùa vụ thu hoạch: Sự tổng hợp tannin hay polyphenol trong lá chè chịu ảnh

hưởng rất lớn bởi cường độ chiếu sáng, khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượng

này tăng và ngược lại.[9][74]

Do vậy trong một năm, hàm lượng polyphenol trong lá chè thường đạt cực đại vào mùa hè và thấp hơn ở mùa thu và mùa xuân

Chế độ canh tác: Dinh dưỡng cho cây chè cũng ảnh hưởng đến hàm lượng

tannin và polyphenol trong nguyên liệu Nhìn chung, khi tăng lượng bón phân đạm thì

hàm lượng polyphenol trong lá chè giảm và hàm lượng này tăng khi tăng lượng lân và

ka li.[17]

Ngoài các yếu tố trên thì hàm lượng polyphenol trong lá chè cũng chịu ảnh

hưởng của các yếu tố như thổ nhưỡng, khí hậu, tuổi cây [45] Nguyễn Văn Chung và

Trương Hương Lan [2] đã khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số trong chè xanh tại

Phú Thọ, Thái Nguyên và Lâm Đồng, các tác giả cho biết hàm lượng này đạt trung

bình 14,8% CK, 18,5% CK và 18,8% CK tương ứng

1.2.4 Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè

1.2.4.1 Phương pháp định tính bằng thuốc thử

- Định tính nhóm Anthranoid bằng phản ứng Borntraeger

- Định tính nhóm Steroid – triterpenoid bằng: Thuốc thử Salkowski, Liebermann –

Burchard, Rosenthaler,

- Định tính alkaloid bằng: Thuốc thử Mayer, Wagner

- Định tính nhóm flavonoid bằng: Dung dịch FeCl3 bão hoà, H2SO4 đặc

- Định tính nhóm saponin bằng khả năng tạo bọt, định tính chỉ số tạo bọt

Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid

Phản ứng Borntraeger

Nguyên tắc: Trong thiên nhiên các hợp chất Anthranoid có thể tồn tại dưới dạng

oxy hoá (Anthraquinone) hoặc dạng khử (Anthranol, Anthrone), dạng tự do (aglycone)

hoặc dạng kết hợp (glycoside) Các hợp chất Anthranoid khi tác dụng với kiềm

(amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolate có màu

đỏ tím

Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid

Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên,

cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường

hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên Steroid có nguồn gốc sinh

tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat Sterol thuộc

nhóm steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc

saponinsteroid Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol,

β –sitosterol, ergosterol, stigmasterol,…) Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của

cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester Sterol là chất

không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene Tan nhiều trong các

dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng

các dung môi này để chiết sterol Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường

là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, carotene, lecitin Phải qua giai đoạn xà

phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu

cơ Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn

Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:

Thuốc thử Liebermann – Burchard:

 Anhidrid acetic 1 ml

 H2SO4 đậm đặc

Dung dịch xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính

Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh

tím là phản ứng dương tính

Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid:

- Vanilin 1%/ethanol 2 giọt, 10 ml nước cất

- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất

Dung dịch sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt

Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid

Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base,

thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật

Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng Đa số chúng không tan trong nước (trừ

nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether,

chloroform,…

Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine)

Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối

với hệ thống thần kinh Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người

(như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành

phần quan trọng trong một số thực phẩm (như cacao, cà phê,…)

Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các

loại nấm độc

Một số thuốc thử Alkaloid:

Thuốc thử Mayer:

• Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất

• Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất

• Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất

Dung dịch xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt

Thuốc thử Wagner:

• I2 : 1,27g

• KI: 2 g

• H2O: vừa đủ 100 ml

Dung dịch xuất hiện tủa màu nâu

Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid

Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều

màu cho rau, quả, hoa, Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ

hay không màu Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng

Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối

với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6 Nếu dây C3 đóng thì đánh

số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A,

Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến

xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau

Khảo sát sự hiện diện của saponin

Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:

Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh

khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc

Định nghĩa: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi

cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách

Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được

trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim

loại

Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo

tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận

Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử

được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau

Kết quả

Ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng

Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc

phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất

làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di

chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch

chuyển của dung môi:

Rf =baTrong đó:

a: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử hay còn gọi là phương pháp đo quang,

phương pháp phân tích trắc quang phân tử là một trong những phương pháp phân tích

công cụ thông dụng với rất nhiều thế hệ máy khác nhau, từ các máy đơn giản của thế

hệ trước còn được gọi là các máy so màu đến các máy hiện đại được tự động hóa hiện

nay, gọi là máy quang phổ hấp thụ phân tử UV - VIS Các máy đo quang làm việc

trong vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS) từ 190nm đến khoảng 900nm

Sự hấp phụ ánh sáng của dung dịch màu:

Dung dịch có màu là do bản thân dung dịch đã hấp thụ một phần quang phổ

(một vùng phổ) của ánh sáng trắng, phần còn lại ló ra cho ta màu của dung dịch, chính

là màu phụ của phần ánh sáng trắng đã bị hấp thụ (vùng quang phổ còn lại)

Sự hấp thụ của dung dịch theo màu được trình bày trong bảng :

Bảng 1 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu

1.2.4.4 Phương pháp định lượng bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách trong đó pha động

là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu

phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến

đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ

chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử )

1.2.5 Hoạt tính sinh học của polyphenol chè

1.2.5.1 Hoạt tính kháng oxi hóa của polyphenol chè

Ngày nay mối quan tâm trong việc sử dụng và đo lường các chất chống oxy hóa

trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm ngày càng tăng Mối

quan tâm này bắt nguồn từ các bằng chứng tích lũy kết nối căng thẳng oxy hóa với

nhiều phân loại, ví dụ như lão hóa sớm, ung thư và một loạt các bệnh trong đó có liên

quan đến các gốc tự do Ngoài ra, thực hiện các quy định rất nghiêm ngặt về việc sử

dụng chất bảo quản thực phẩm, do đó họ chỉ cho phép sử dụng chất chống oxy hóa tự

nhiên

Các ứng dụng tiềm năng là chất bảo quản trong thực phẩm, mỹ phẩm và các

ngành công nghiệp dược phẩm Sự quan tâm về việc loại bỏ chất độc của trong quá

trình tổng hợp các chất chống oxy hóa trong thực vật và trong việc xác định các nguồn

chất chống oxy hóa tự nhiên đã thúc đẩy chúng tôi phát triển để xác định giá trị của

chất tan trong nước

Khi nghiên cứu khả năng quét gốc tự do tổng hợp như 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

(ABTS)…, các polyphenol-catechin đều thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất

kháng oxy hóa đối chứng như vitamin C, vitamin E Nanjo và cộng sự [52] đã chỉ ra

rằng, các catechin có hoạt tính quét gốc tự do DPPH cao gấp 6 đến 16,4 lần α –

tocopherol hay từ 4,3 đến 11,8 lần vitamin C Trong các hợp chất catechin, nhìn chung

dạng galloyl hóa có khả năng quét DPPH cao hơn so với dạng khác Trong các thành

phần của catechin chè, khả năng quét DPPH được xếp theo trật tự giảm dần như sau:

EGCG > ECG > EGC > EC > C [41][47] Đối với chè, thành phần các catechin đóng góp

khoảng 70-80% khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết.[49]

Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo cũng chỉ ra rằng, polyphenol chè có hiệu

quả cao trong việc giảm cholesterol tổng số cũng như phần LDL trong huyết

thanh,[59][76] chống oxy hóa các acid béo,[28][31] hay quét các gốc tự do superoxyl,

hydroxyl.[19][66] Trong nghiên cứu về tác dụng của polyphenol đối với độc tố

ochratoxin A ở tế bào gan, Hundhausen và cộng sự [39] đã chỉ ra rằng, EGCG có hoạt

tính kháng oxi hóa cao gấp 4 lần trolox và genistein, 3,4 lần daidzein và khoảng 1,3

lần quercetin

Khả năng kháng oxi hóa của chất chiết chè xanh cũng là chủ đề của nhiều

nghiên cứu Khi đánh giá khả năng này của chè xanh, hoa nhài, oải hương, hoa hồng,

sả và hương thảo thông qua khảo sát khả năng quét DPPH, khả năng kháng oxi hóa

tương đương trolox (TEAC) và khả năng hấp phụ gốc oxygen (ORAC assay) Tsai và

cộng sự [70] đã nhận thấy rằng, trong tất cả các thử nghiệm, chè xanh có hoạt tính

kháng oxi hóa mạnh nhất Cụ thể với DPPH, hoạt tính này của chất chiết chè xanh cao

gấp 1,4 lần so với hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so với

oải hương (bảng 1.2) Trong thí nghiệm khác với cùng đối tượng, Aoshima và cộng sự

[15] cũng cho quy luật tương tự

Một phương pháp xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity)

khác dựa theo mô hình phospho molybdenum [56] bằng phép đo quang phổ trên cơ sở

việc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo

của phức chất atacidic photphat / Mo (V) màu xanh lá cây Phương pháp này đã được

tối ưu hóa và đặc trưng theo khoảng cách tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số

hấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa

Phương pháp này phù hợp với quy mô và thiết bị của phòng thí nghiệm trường

Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu nên chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp này để xác

định lực kháng oxy hóa của Polyphenol lá chè xanh

1.2.5.2 Hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol chè

Về cơ chế kháng khuẩn của polyphenol chè, các catechin đặc biệt là EGCG đã

can thiệp vào quá trình tổng hợp acid béo type II của tế bào vi khuẩn.[75] Bên cạnh đó,

gốc galloyl của catechin cũng gây ra sự rối loạn đặc hiệu trong cấu trúc của lớp đôi

phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine trong thành màng tế bào.[26] Ngoài

ra, hiệu quả sát khuẩn của catechin còn có thể liên quan đến việc tạo hydrogen

peroxide – kết quả từ tác động của oxygen với EGCG.[16]

Khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm của polyphenol/chất chiết chè

được tổng hợp qua bảng 1.3 [49] Đối với vi khuẩn, polyphenol chè có tác dụng tốt đối

với nhiều loài vi khuẩn gây ngộ độc cũng như gây thối hỏng thực phẩm.[21]

Mendel [49] đã chỉ ra rằng, EGCG, CG, EGC thể hiện hoạt tính kháng B cereus

ở mức độ nmol, chất chiết chè xanh và chè đen đều có thể ức chế sự phát triển của C

jejuni và C coli trong vòng 4 giờ [30], nồng độ ức chế tối thiểu (minmum inhibitory

concentration) trung bình của các catechin chè đối với S aureus và một số chủng

Vibrio là 192 ± 91 và 162 ± 165 µg/ml tương ứng trong khi đối với các vi khuẩn gram

(-) như Salmonella và E coli là 795 ± 590 và 1519 ± 949 µg/ml tương ứng.[68]

Một số nghiên cứu đã tiến hành về ảnh hưởng của polyphenol chè đối với các vi

sinh vật gây bệnh cho cây trồng Fukai và cộng sự [34] đã nghiên cứu ảnh hưởng của

chất chiết catechin chè trên 8 chủng Erwinia gây bệnh thối rữa đối với xà lách, súp lơ,

cà chua, củ cải và 10 chủng Pseudomonas gây bệnh héo xanh (wilt), thối ướt (spring

rot), đốm lá (necrotic leaf spot) trên tỏi, súp lơ, xà lách…, kết quả chỉ ra rằng, catechin

chè là chất ức chế tốt đối với các vi khuẩn này, nồng độ ức chế tối thiểu của các

polyphenol chè đều dưới 100 ppm Trong số 4 cấu tử catechin thử nghiệm (EGC,

EGCG, EC, ECG), thì EGCG và EGC hiệu quả hơn cả Liên quan đến khả năng kháng

một số vi khuẩn gây thối hỏng thực phẩm, Yam và cộng sự [72] cũng kết luận rằng, chất

chiết chè cũng như thành phần polyphenol chè có tiềm năng trong bảo quản thực

phẩm, đặc biệt khả năng kháng lại P vulgaris, P aeruginosa và S marcescens

1.3 Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong

chè

1.3.1 Bản chất của quá trình trích ly

Bản chất của quá trình trích ly là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất

rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán các chất có

nồng độ khác nhau Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng gọi là trích ly lỏng – lỏng,

còn trích ly chất hòa tan trong chất rắn là trích ly rắn – lỏng [21]

1.3.2 Các phương pháp trích ly

Hiện nay tùy theo mục đích (mục đích khai thác và mức độ tinh sạch mong

muốn hay mục đích phân tích) cũng như điều kiện áp dụng công nghệ mà việc trích ly

các hợp chất có trong thực vật có thể tiến hành theo một số phương pháp sau:

1.3.2.1 Kỹ thuật soxhlet

Chiết soxhlet là một trong các kỹ thuật cổ điển nhất, được đề xuất bởi nhà hóa

học người Đức Franz Ritter Von Soxhlet Đầu tiên nó được thiết kế chủ yếu cho việc

tách chất béo nhưng hiện nay được ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau, trong đó

có chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học Trong chiết soxhlet, dung môi thích

hợp liên tục được bốc hơi, ngưng tụ và tiếp xúc với vật liệu rắn để tách chất mục tiêu

trong một thiết bị chuyên dụng (bộ soxhlet) Đối với kỹ thuật này, do những hạn chế

như làm việc gián đoạn, năng suất thấp, thời gian chiết dài nên hiện nay thường chỉ

được sử dụng trong nghiên cứu, phân tích và để đối sánh với các kỹ thuật mới khác

[31]

1.3.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm (maceration)

Với kỹ thuật này, quá trình chiết thường gồm các bước cơ bản sau:

i) vật liệu được nghiền nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi, ii) dung môi

thích hợp được đưa vào trong bình chiết và được trộn đều với vật liệu, iii) tách dung

môi có chứa chất mục tiêu ra khỏi bã và ép bã để thu hồi triệt để chất mục tiêu, iv) lọc

làm sạch dung môi chứa chất mục tiêu thu được Ngoài ra, trong phương pháp này

người ta thường kết hợp với khuấy đảo để tăng quá trình khuếch tán của chất tan và

làm mới dung môi trên bề mặt vật liệu Từ đó làm tăng hiệu suất trích ly.[20]

Ưu điểm của phương pháp là rẻ tiền, đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu

thiết bị phức tạp, thích hợp với việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệt nhưng có

nhược điểm là thời gian trích ly dài và có hạn chế về hiệu suất trích ly

1.3.2.3 Kỹ thuật ngấm kiệt (percolation)

Trong kỹ thuật này, vật liệu được ngâm ngập trong dung môi và không có

khuấy đảo Khi sự chênh lệch nồng độ chất tan trong vật liệu và ngoài dung môi gần

đạt trạng thái cân bằng, dung môi chứa chất tan sẽ được chiết rút từ từ nhỏ giọt ra khỏi

bình chiết Đồng thời với quá trình này, dung môi mới sẽ được đưa vào để chiết kiệt

chất mục tiêu trong vật liệu Kỹ thuật này có thể thực hiện đơn giản như trên hoặc có

thể tiến hành theo cách phân đoạn Trong chiết phân đoạn, dịch chiết loãng được sử

dụng làm dung môi để chiết vật liệu mới

Kỹ thuật này cũng có ưu điểm là khá đơn giản, dễ áp dụng Tuy nhiên thời gian

chiết dài và lượng dung môi tiêu thụ lớn

1.3.2.4 Trích ly có hỗ trợ siêu âm

Cơ sở của phương pháp này là sử dụng sóng siêu âm làm tăng cường quá trình

phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng cường quá trình chuyển khối, từ đó có thể làm tăng hiệu

suất trích ly Bên cạnh đó, phương pháp này cũng cho phép rút ngắn thời gian trích ly

và làm giảm tiêu tốn dung môi…[3] Tuy nhiên kỹ thuật này có thể làm tăng nhiệt của

hệ dung môi – vật liệu trong quá trình, do đó có thể không thích hợp trong trích ly các

hoạt chất nhạy cảm nhiệt như polyphenol Ngoài ra, những khó khăn trong việc triển

khai công nghiệp cũng là điểm hạn chế của kỹ thuật này [58]

Cuối cùng, hiện nay phương pháp này vẫn chưa có các đánh giá toàn diện như

ảnh hưởng của sóng siêu âm đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt tính sinh học của chất

cần trích ly, hiệu suất trích ly polyphenol có thực sự được cải thiện hay không vẫn

chưa có những kết luận đồng thuận Ví dụ như trong khi Tao và cộng sự [69] cho biết,

trích ly polyphenol từ chè có hỗ trợ siêu âm cho phép nâng hàm lượng polyphenol

trong dịch chiết từ 22,04% lên 22,67% thì Amir và cộng sự [14] lại không nhận thấy có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh giữa trích ly polyphenol từ vỏ quả hồ trăn

(Pistachia vera) có và không có hỗ trợ của sóng siêu âm với cả hai dung môi là nước

và methanol

1.3.2.5 Trích ly có hỗ trợ vi sóng

Trích ly có hỗ trợ vi sóng cũng được xem là một phương pháp mới trong trích

ly các hợp chất tự nhiên Trong kỹ thuật này, trường điện từ trong dải tần từ 300 MHz

tới 300 GHz thường được sử dụng Chúng tạo ra hai trường dao động trực giao là

trường từ và trường điện Trong quá trình này, năng lượng điện từ sẽ được chuyển hóa

thành năng lượng nhiệt.[20] Kỹ thuật này thường gồm 3 bước:[13] i) đầu tiên có sự phân

tách chất mục tiêu khỏi các vị trí hoạt động của vật liệu do sự tăng nhiệt độ và áp suất,

ii) tiếp theo có sự di chuyển của dung môi vào trong vật liệu, iii) cuối cùng, chất mục

tiêu được hòa tan vào dung môi

Ưu điểm của phương pháp này là thời gian nâng nhiệt và chiết tách nhanh, ít

tiêu tốn dung môi, hiệu suất thu hồi cao.[13] Tuy nhiên, nó cũng gặp những hạn chế như

trong kỹ thuật trích ly có hỗ trợ siêu âm như kém phù hợp trong chiết tách các hợp

chất nhạy cảm nhiệt và những vấn đề về thiết bị trong triển khai công nghiệp.[103]

1.3.2.6 Trích ly siêu tới hạn

Cơ sở của phương pháp: khi chất khí ở nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn

(gọi là chất lỏng tới hạn) nó bộc lộ khả năng của một dung môi, nhưng có độ nhớt và

khả năng khuếch tán của một chất khí Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch tán

cao, tính vận chuyển tốt hơn một chất lỏng thường vì vậy nó có khả năng thích ứng với

quá trình chiết tách Trong kỹ thuật này, CO2 thường được lựa chọn vì nó có mật độ

tới hạn cao (0,47 g/cm3).[63]

Ưu điểm chính của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp, có thể

giảm thiểu sự oxi hóa các chất cần trích ly, an toàn không độc hại và không tốn năng

lượng để tách dung môi (chất lỏng tới hạn) sau trích ly.[63][58] Tuy nhiên nhược điểm

chính của phương pháp này là đầu tư trang thiết bị lớn và hiệu quả thấp đối với việc

trích ly các hợp chất phân cực như catechin chè Để sử dụng phương pháp này cho

trích ly polyphenol, người ta thường phải kết hợp CO2 siêu tới hạn với một dung môi

phân cực khác như ethanol

Sau hơn 30 năm phát triển, phương pháp này hiện đã được phát triển ở quy mô

công nghiệp trong việc tách caffeine từ cà phê và hoa húp lông.[58]

1.3.2.7 Chiết dung môi ở áp suất cao

Phương pháp này lần đầu tiên được mô tả bởi Richter và cộng sự vào năm

1996.[20] Cơ sở của phương pháp là sử dụng áp suất cao trong quá trình chiết để lưu

giữ trạng thái lỏng của dung môi trên điểm sôi của nó Do vậy, điều kiện làm việc này

(nhiệt độ và áp suất cao) sẽ làm tăng khả năng hòa tan của chất mục tiêu, giảm độ nhớt

và sức căng bề mặt của dung môi Điều này cho phép làm tăng tốc độ chuyển khối và

cải thiện hiệu suất trích ly Bên cạnh đó, khả năng có thể tự động hóa quá trình cũng là

một trong các ưu thế của kỹ thuật này.[40] Tuy vậy, với điều kiện làm việc ở nhiệt độ và

áp suất cao có thể kém phù hợp trong việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệt như

catechin chè

1.3.2.8 Trích ly bằng dung môi có hỗ trợ enzym

Xử lý enzyme của các mẫu thực vật là một kỹ thuật khác phù hợp để giải phóng

các hợp chất phenolic Phenolics trong vật liệu thực vật dường như được liên kết với

các polysacarit vách tế bào thực vật bởi cả hai liên kết kỵ nước và kỵ nước.Việc bổ

sung các enzyme có thể làm tan rã các liên kết thành tế bào phenolic và tăng cường

chiết xuất phenolic Gần đây, thủy phân enzyme sử dụng kết hợp pectinase, cellulase

và hemiaellulase đã được chứng minh là tăng cường chiết xuất phenolic từ chất thải

rắn mâm xôi Maier et al đã phát triển ứng dụng enzyme để chiết xuất phenolic từ

bưởi nho Kapasakalidis và cộng sự đã báo cáo rằng các chế phẩm enzyme cellulose

thương mại thúc đẩy việc chiết xuất polyphenol và anthocyanin từ quả bưởi đen

Trong một nghiên cứu khác, việc so sánh ứng dụng của ba loại chế phẩm enzyme khác

nhau bao gồm-amylase, Viscozyme L và Ultraflo L đã được tiến hành trên thân cây

Ipomoea batatas (khoai lang) Ultraflo L và Viscozyme L tạo điều kiện phục hồi

phenolic và dẫn đến sản lượng axit ferulic và axit vanillic cao hơn, tương ứng, trong

chiết xuất Hong và Van Veit đã so sánh các kỹ thuật của UAE và chiết xuất các hợp

chất phenol có hỗ trợ enzyme từ quả acerola, ngược lại, sản lượng phenolics cao hơn

bằng phương pháp mới của UAE so với chiết xuất enzyme

Nhận xét chung về các phương pháp trích ly:

Như đã trình bày ở phần trên, Tất cả các kỹ thuật chiết tách polyphenol từ lá

trà xanh đều có lợi thế và hạn chế riêng Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn nghiên

cứu các điều kiện chiết tách cho phương pháp chiết polyphenol trong lá chè bằng

dung môi, ngoài ra khảo sát thêm sự hỗ trợ của một số enzym nhằm cải thiện và tối

ưu hóa cả hiệu suất trích ly cùng hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol/catechin

đồng thời phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu và

dễ dàng triển khai ở quy mô nhỏ so với các nghiên cứu đã từng được tiến hành ở Việt

Nam

1.4 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của

sản phẩm

Những nghiên cứu trên thế giới về chiết tách polyphenol chè nhìn chung cũng

tập trung chủ yếu đến việc tìm hiểu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất

trích ly và chất lượng của sản phẩm thu được (hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn

của dịch chiết/chất chiết polyphenol)

1.4.1 Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi

Việc lựa chọn dung môi có thể ảnh hưởng đến cả loại và hàm lượng các hợp

chất phenol chiết tách được Độ hòa tan của các hợp chất phenol chịu ảnh hưởng lớn

bởi độ phân cực của dung môi sử dụng Trong chiết xuất các hợp chất phenol, các

dung môi có độ phân cực cao như nước hoặc ít phân cực như chlorofom hay hexane

thường không cho hiệu suất thu hồi cao.[46] Dung môi nước tuy an toàn nhưng thường

làm cho dịch chiết có lượng tạp chất lớn, gây khó khăn cho việc làm sạch về sau Nếu

quá trình chiết hướng tới nhiều loại hợp chất khác nhau cùng tồn tại trong vật liệu,

người ta thường sử dụng hỗn hợp các loại dung môi để tạo ra một dung dịch có độ

phân cực trung bình Điều này cho phép cải thiện hiệu suất trích ly đối với tổng thể các

hợp chất đích.[46] Trong chiết tách các hợp chất phenolic chè, dung môi thường được