THÍ NGHIỆM các PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG cụ

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CN HÓA HỌC & THỰC PHẨM BỘ MƠN: CN HĨA HỌC THÍ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CƠNG CỤ (Tài liệu lưu hành nội bộ) TH HCM, 03/2020 BÀI 1: PHƯƠNG PHÁP PHỔ TỬ NGOẠI- KHẢ KIẾN (UV-VIS) XÁC ĐỊNH Fe TRONG THUỐC BẰNG 1,10-PHENANTROLIN (PHƯƠNG PHÁP DÃY CHUẨN) Để xác định sắt dạng Fe3+ người ta thường dùng phương pháp so màu với thuốc thử thiocyanat, acid salicylic acid sulfosalicylic; dạng Fe2+ với thuốc thử 1,10-phenantrolin Trong thực tập này, xác định hàm lượng Fe2+ Fe3+ thuốc thuốc thử 1,10-phenantrolin I NGUYÊN TẮC Ion Fe2+ tạo phức màu đỏ cam với phân tử 1,10-phenantrolin gọi tên Ferroin 2+ 2+ Fe + Fe N N N N Phức tồn dạng cation tồn khoảng pH rộng từ 2.0 – 9.0, có hấp thu cực đại 508nm hệ số hấp thu phân tử () 1.1*104 L.mol-1.cm-1 Phức bền, có cường độ màu khơng thay đổi nhiều tháng Khoảng tuân theo định luật Beer 0.13 – g/mL I   Định luật Lambert Beer đuợc phát biểu dạng biểu thức sau:  A  lg o   l.c  với A độ I   hấp thu (mật độ quang), Io I cường độ xạ trước sau hấp thu;  độ hấp thu phân tử, l chiều dày dung dịch mẫu cho xạ truyền qua c nồng độ chất phân tích dung dịch mẫu đo Do có phản ứng màu chọn lọc 1,10-phenantrolin với Fe2+ (tức Fe3+ phản ứng với 1,10-phenantrolin phức lại khơng có màu) nên ta xác định lượng Fe2+ có mặt Fe3+ Để xác định tổng hàm lượng sắt ta khử ion Fe3+ Fe2+ chất khử hydroxylamin, hydrazin acid ascorbic Trong thực tập này, ta xác định Fe2+ tổng hàm lượng Fe Từ kiện ta tính hàm lượng Fe3+ II HĨA CHẤT VÀ DỤNG CỤ Hóa chất a Dung dịch chuẩn gốc: 1000 ppm Fe Cách pha: Dung dịch Fe (II) tiêu chuẩn: cân xác khoảng 3.5110 g muối Mohr (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O loại tinh khiết phân tích (chọn tinh thể tốt, màu xanh nhạt) Hòa tan 500 mL nước cất hai lần, thêm vào 5mL H2SO4 đậm đặc Dung dịch kiểm tra nồng độ Fe phép chuẩn độ oxy hóa khử, chất chuẩn K2Cr2O7 hay KMnO4 b Dung dịch chuẩn trung gian: 50 ppm c Dung dịch 1,10-phenantrolin 0.5% pha ethanol: nước (1:9) d Dung dịch hydroxylamin 10% nước e Dung dịch HCl M (Cán PTN chuẩn bị dung dịch a) Phân nhiệm vụ: SV chuẩn bị hóa chất mục từ b-f; Nhóm 1, 2, 3: Điều chế 100 mL dung dịch b đề sử dụng riêng Nhóm 1: Điều chế 100 mL dung dịch từ c dùng chung cho tất nhóm Nhóm 2: Điều chế 100 mL dung dịch từ d dùng chung cho tất nhóm Nhóm 3: Điều chế 500 mL dung dịch e dùng chung cho tất nhóm (3 lớp) Nhóm định: Điều chế 100 mL dung dịch f dùng chung cho tất nhóm Dụng cụ, thiết bị Máy so màu UV-Vis, cuvet nhựa (mỗi nhóm cuvét); bình định mức 100 mL, pipet loại III CÁCH TIẾN HÀNH Điều chế dãy dung dịch chuẩn Mỗi nhóm tự xây dựng đường chuẩn riêng cho nhóm Lấy vào bình định mức 100 mL xác thể tích Fe2+ 50 ppm theo bảng Bảng 1: Cách pha dung dịch Fe2+ để xây dựng đường chuẩn Nồng độ dãy chuẩn (ppm) Thể tích (mL) Dung dịch trung gian Fe 50 ppm Blank STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 0.1 0.5 1.0 2.5 5.0 0.20 1.00 2.00 5.00 10.00 Hydroxylamin 10% (NH2OH) 1.0 Đệm pH 5.0 1,10 – phenantrolin 0.5% 1.0 Nước cất Thêm đến vạch mức fiol 100 mL Phức ổn định sau 10 phút Mỗi mẫu chuẩn bị lần Vẽ phổ hấp thu phức để chọn max: Mỗi nhóm tự thực vẽ phổ hấp thu phức để chọn max Chọn bình dung dịch chuẩn (STD5) để khảo sát phổ hấp thu phức Chọn chế độ: Wavelength Scan Sinh viên khảo sát phổ hấp thu phức Fe(1,10-phenantrolin)32+ khoảng bước sóng 400-700 nm Vẽ đồ thị biểu diễn A theo bước sóng Tìm giá trị bước sóng hấp thu cực đại max (SV sử dụng đĩa CD (Không dùng USB), copy số liệu từ máy tính, xử lý excel để vẽ phổ hấp thu) Xác định Fe viên thuốc Nhiệm vụ nhóm:  Mỗi nhóm tự chuẩn bị mẫu dược phẩm  Mỗi nhóm phân tích mẫu dược phẩm nhóm đồng thời nhóm cịn lại  Phịng thí nghiệm cung cấp mẫu dược phẩm Các nhóm phân tích mẫu dược phẩm  Cung cấp số liệu kết mẫu nhóm với để báo cáo Lưu ý: Để kết phân tích đáng tin cậy Trong q trình phân tích cần thực mẫu để kiểm soát chất lượng sau:  Blank quy trình: thực mẫu blank theo quy trình phân tích để kiểm sốt nhiễm mẫu (kiểm sốt hố chất, dụng cụ thí nghiệm, mơi trường…)  Mẫu thêm chuẩn: Thêm lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử mẫu trắng, phân tích mẫu thêm chuẩn đó, tính hiệu suất thu hồi Sinh viên tự tính tốn mẫu thêm chuẩn báo cáo đến GV trước tiến hành thí nghiệm  Phân tích mẫu lặp: Mỗi mẫu cần thực lần 3.1 Lấy mẫu đồng mẫu: - Cân 10 viên thuốc Từ suy giá trị trung bình viên thuốc - Dùng cối giã nhuyễn 10 viên thuốc thành bột Sau trộn lại cho 3.2 Quy trình 3.2.1 Điều chế dung dịch Fe gốc - Bước 1: Cân xác mẫu đồng với khối lượng khoảng viên thuốc vào beaker 150mL - Bước 2: Thêm 25mL HCl 6M Khuấy đợi vài phút Đậy beaker mặt kính đồng hồ đun sơi 15 phút Thêm nước cất thể tích nhỏ 15ml q trình đun sơi - Bước 3: Để nguội khoảng 10 phút, chuyển định lượng vào fiol 100mL Tráng rửa beaker mặt kính đồng hồ vài lần nước ấm Để nguội đến nhiệt độ phòng định mức nước cất lần - Bước 4: Lọc dung dịch vào ống ly tâm giấy lộc, đậy nắp bảo quản phần dịch lọc Dán nhãn với thông tin “Dung dịch Fe gốc” 3.2.2 Điều chế dung dịch Fe Dùng pipet lấy 5,00 ml dung dịch Fe gốc vào bình định mực 100 mL, thêm nước đề ion tới vạch Dán nhãn: “Dung dịch Fe pha loãng” Các tiến hành xác định hàm lượng Fe viên thuốc Cách tiến hành: Với dung dịch Fe pha loãng: Dùng pipet lấy 10 mL mẫu đo vào bình định mức 100 mL đánh số 1a, 1b Bình a dùng để xác định tổng hàm lượng Fe bình b để xác định riêng Fe2+ Thêm 1.00 mL NH2OH vào bình a, bình b khơng thêm hydroxylamine, lắc đều, để yên 30 phút để phản ứng khử diễn hoàn toàn, thêm tiếp mL đệm acetat pH 5, mL phenantrolin, dùng nước cất định mức đến vạch mức Các dung dịch ổn định sau 10 phút Với mẫu trắng: mẫu xác định cần loại dung dịch mẫu trắng khác Các dung dịch mẫu trắng không thêm Fe2+ - Mẫu trắng cho dung dịch “a”: có hydroxylamin Thực mẫu trắng mẫu trắng dãy chuẩn (bình 0) - Mẫu trắng cho dung dịch “b”: khơng có hydroxylamin - Độ hấp thu mẫu trắng ghị nhận trừ với độ hấp thu dung dịch “a” “b” tương ứng Chú ý: phức Fe2+-1,10-phenantrolin bền nên chuẩn bị dãy chuẩn mẫu thời điểm khác Tuy nhiên để đảm bảo độ phép phân tích, nên chuẩn bị chuẩn mẫu đồng thời Mẫu Chuẩn bị mẫu a Chuẩn bị mẫu b Blank a Bình a Blank b Bình b Dung dịch Fe pha loãng (mL) 10,00 10,00 NH2OH 1.00 1.00 0 Đệm pH 5.00 5.00 5.00 5.00 1,10-phenantrolin 1.00 1.00 1.00 1.00 H2O Thêm đến vạch mức fiol 100 mL Phức ổn định sau 10 phút Lưu ý: Blank a chuẩn bị tương tự Blank (Bảng 10, khơng cần chuẩn bị nữa) Chuẩn bị mẫu QC đo Mẫu QC phòng TN chuẩn bị, biết trước nồng độ SV thực chuẩn bị mẫu tương tự mẫu a b pha loãng 20 lần Chuẩn bị mẫu QCa Mẫu Chuẩn bị mẫu QCb Blank QCa Bình QCa Blank QCb Bình QCb Dung dịch Fe pha loãng (mL) 5,00 5,00 NH2OH 1.00 1.00 0 Đệm pH 5.00 5.00 5.00 5.00 1,10-phenantrolin 1.00 1.00 1.00 1.00 H2O Thêm đến vạch mức fiol 100 mL Đo đuờng chuẩn mẫu: Đo độ hấp thu quang học dung dịch chuẩn mẫu max xác định theo thí nghiệm trên, cuvet 1cm IV TÍNH TỐN VÀ XỬ LÝ KẾT QỦA Dựng đồ thị phụ thuộc A theo C Xác định lượng Fe(II) tổng Fe Fe (III) Lượng Fe(III) tính từ hiệu hai giá trị Fe tổng Fe(II) Hãy biểu diễn lượng sắt mg/L hay ppm Tính tốn kết theo phương pháp bình phương tối thiểu từ phương trình tuyến tính bậc (ISO-8466-1) A = a + bC Trong C nồng độ tính theo µg/mL a, b hệ số hồi quy Tính hệ số a, b: b a n Ci Ai   Ci  Ai n C i2  ( Ci ) 2 i C  A  C C A n C  ( C ) i i i i i i Tính phương sai dư: S re2  i A  a  Ai  b  AiCi  s y2 n2 n số điểm đường chuẩn f = n – số bậc tự Tính độ lệch chuẩn cho hệ số hồi quy a b: S b  S re n n  C  ( C i ) S a  S re C n C  ( C ) i i i i Biện luận hệ số a: khoảng tin cậy a tính theo cơng thức:  a  t 0.95, f   b  t 0.95, f  Sa n Sb tra hệ số Student bảng xác suất 0.95 độ tự f = n – n Từ giá trị trên, thiết lập phương trình hồi quy sau: A = (a ± a) + (b ± b)C Tính nồng độ chưa biết Cx theo công thức: A a Cx  x b Tính sai số mẫu xác định theo phương pháp lan truyền sai số Sx  S re b n( Ax  Ai ) 1   n m b n C i2  Ci 2   n: số điểm đường chuẩn m: số lần đo mẫu xác định Ax ; giá trị trung bình Ax mẫu thử Ai : giá trị trung bình A điểm đường chuẩn Nồng độ chất phân tích mẫu đo đuợc biểu diễn sau: Cmâu  C x  t0.95; n   S x 100 V Lưu ý: hệ số pha loãng (100/v); tùy thuộc vào đường chuẩn, mẫu đo mà thay đổi hệ số pha loãng, cho độ hấp thu A mẫu phải nằm khoảng tuyến tính đường chuẩn Nồng độ chất phân tích mẫu thực tế: C  Cmâu Đánh giá đường chuẩn (độ tuyến tính) Y=ax+b + Đánh giá thông qua R2 (R2  0.995) + Đánh giá độ chệch tín hiệu thơng qua hệ số QC (QC Vtđ1 ? Tại ta không chuẩn đến điểm tương đương thứ acid phosphoric ? Tính pHtđ1 pHtđ2, so sánh với kết thực tế Tại phải hoạt hóa điện cực cách ngâm qua đêm với dung dịch HCl 1M? Mục đích hiệu chuẩn điện cực gì? 29 BÀI 5: XÁC ĐỊNH HỖN HỢP CAFFEIN VÀ PARACETAMOL TRONG MẪU DƯỢC PHẨM BẰNG HPLC-UV MỤC ĐÍCH – Sinh viên hiểu hoạt động máy HPLC - Sinh viên thực bước pha chế dung dịch, lọc mẫu, chuẩn dung mơi – Sinh viên giải thích điều kiện thiết lập cho trình chạy sắc ký – Sinh viên đọc kết phân tích xử lý kết CƠ SỞ LÝ THUYẾT Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cơng cụ phân tích quan trọng để tách định lượng thành phần hỗn hợp chất lỏng phức tạp Trong sắc ký lỏng gồm pha động chất lỏng pha tĩnh chất rắn Mẫu phân tích hòa tan pha động, cho qua pha tĩnh cách liên tục khơng hịa lẫn với Pha tĩnh cố định cột hay bề mặt chất rắn Các chất tan thành phần mẫu di chuyển qua pha động với ]tốc độ khác tùy thuộc vào tương tác pha tĩnh – pha động – chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, thành phần mẫu tách riêng biệt thành dải, làm sở cho phân tích định tính định lượng Tùy thuộc vào chế lưu giữ phân loại HPLC thành nhiều loại 2.1 Cách thức chuẩn bị pha động HPLC 2.1.1 Yêu cầu pha động – Pha động phải trơ với pha tĩnh sử dụng – Chất phân tích mẫu phải tan pha động rửa giải – Khi thay đổi pha động phải lưu ý tính tan lẫn dung mơi khác pha động khác Đặc biệt pha động nước có muối vơ đóng vai trò làm dung dịch đệm ổn định pH, muối môi trường hữu thường hay bị tủa làm nghẹt cột – Pha động phải bền vững theo thời gian: Càng bền lâu tốt pha động không bị phân hủy suốt thời gia phân tích mẫu – Pha động phải có độ tinh khiết cao: Dung môi sử dụng HPLC phải dùng loại dành cho HPLC có xuất xứ đáng tin cậy – Phải nhanh đạt cân trình sắc ký – Phải phù hợp với loại detector: Nếu đầu dị UV – VIS dung mơi phải có UV cutoff thấp bước sóng làm việc Nếu đầu dị huỳnh quang dung mơi khơng phát quang Nếu đầu dị MS pha động phải dễ hóa – Các dung mơi có mặt pha động rẻ thân thiện với môi trường tốt 2.1.2 Làm dung môi Pha động phải lọc qua màng lọc, thông qua hệ thống lọc áp suất thấp, thường dùng màng lọc có lỗ xốp 0,45µm sắc ký Các loại màng lọc thông dụng bao gồm: 30 – Màng lọc celluloseacetate: Được sử dụng với mẫu nước chứa 10% dung môi hữu Với dung môi nhiều thành phần hữu hơn, màng lọc bắt đầu hòa tan nhiễm bẩn mẫu – Màng lọc Teflon: Được sử dụng cho dung môi hữu với 75% nước Khi dùng màng lọc Teflon với dung mơi có tỷ lệ hữu cao, trước tiên làm ướt màng lọc dung môi hữu tinh khiết, với dung mơi nước, sau bắt đầu lọc – Màng lọc nylon: Có thể sử dụng cho dung môi nước dung môi hữu Tuy nhiên nên tránh dùng dung môi acid hay kiềm, màng lọc hỏng Nếu tiến hành sắc ký theo chế độ đẳng dòng kênh phải phối trộn pha động theo tỷ lệ thành phần mong muốn, sau lọc hệ thống lọc chân khơng với màng lọc 0,45µm Nếu tiến hành sắc ký theo chế độ chế độ đẳng dòng đa kênh gradient lọc riêng loại dung môi Các loại dung môi phối trộn có khả tủa (đặc biệt đệm phốt phát mơi trường hữu cơ) Vì phải phối trộn với tỷ lệ muối đệm cao (theo chương trình gradient nghiên cứu) trước ngày để quan sát, dung dịch suốt bình thường tiến hành sắc ký theo chương trình gradient 2.1.3 Đuổi khí Trong dung mơi sau lọc cịn khí, bọt khí vào cột ảnh hưởng đến trình sắc ký Vì vậy, phải đuổi khí cách đặt chai chứa pha động vào bể siêu âm thường khoảng 15 phút (đối với dung môi hữu cơ) 35 phút (đối với dung môi nước) 2.2 Định danh Khi tiêm mẫu vào cột sắc ký, chất tan di chuyển dọc theo cột có thời gian lưu giữ định cột sắc ký Mỗi chất có thời gian lưu cố định điều kiện sắc ký, thời gian lưu đại lượng để định danh chất Có thể thực định danh hai cách: – Cách 1: Tiêm chuẩn hỗn hợp sau tiêm chuẩn đơn – Cách 2: Tiêm chuẩn hỗn hợp Tiếp theo tiêm chuẩn hỗn hợp có chuẩn tăng nồng độ lên Sắc ký đồ cho thấy peak cao lên chuẩn pha với nồng độ tăng lên 2.3 Kỹ thuật tính tốn Trong sắc ký, diện tích peak tỷ lệ với nồng độ chất phân tích tiêm vào cột Diện tích peak xác định tay tự động phần mềm Tùy thuộc vào kỹ thuật tiến hành mà cách tính tốn thay đổi phù hợp 2.3.1 Kỹ thuật so sánh chuẩn Tiêm mẫu chuẩn vào máy có diện tích peak (S) ứng với nồng độ C Ta có S = K.C  K = S/C 31 Tiêm mẫu xác định vào máy sắc ký có diện tích peak SX  CX=SX/K 2.3.2 Kỹ thuật đường chuẩn Dựng dãy chuẩn, tiêm vào máy sắc ký có diện tích peak Si tương ứng với nồng độ C chất phân tích mẫu thứ i Thiết lập mối tương quan S = f(Ci) phương trình hồi quy tuyến tính Thực tương tự mẫu, có tín hiệu SX Thế giá trị SX vào phương trình hồi quy suy giá trị Cx DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 3.1 Dụng cụ thiết bị Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường thiết bị, dụng cụ cụ thể sau: - Cân phân tích, cân xác đến 0,001 g Bể siêu âm - Giấy lọc, loại trung tính, tốc độ chảy trung bình Bộ lọc dung mơi, với màng lọc có cỡ lỗ 0,45 m 3.2 Hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao - Cột phân tích HPLC C18, kích thước cột 250 mm x 4màng diot (DAD), Bình chứa dung mơi, Hệ thống bơm mẫu, máy tính xử lý liệu 3.3 Hóa chất STT Tên Hóa chất Chuẩn caffein Chuẩn Paracetamol Methanol for HPLC Nước cât hai lần Xuất xứ Phân chia nhóm chuẩn bị hóa chất - Chuẩn bị pha động: (1 nhóm) giao nhiệm vụ chuẩn bị pha động Dung dịch chuẩn gốc (1 nhóm) Chuẩn gốc caffeine 100 ppm: điều chế 100 mL Dd chuẩn caffeine 100 ppm (mg/L) Chuẩn gốc paracetamol 100 ppm: điều chế 100 mL DD chuẩn paracetamol 100 ppm (mg/L) 32 Dung dịch chuẩn gốc, sau điều chế xong, cho vào chai đượng, bảo quản tủ lạnh tháng Chai được dãn nhãn, thời gian pha, người pha Sau làm xong, nhóm có trách nhiệm pha đưa vào tủ lạnh để lưu trữ ngăn mát Dung dịch chuẩn làm việc (Sử dụng cho thí nghiệm 4.2.2; 4.2.3) (1 nhóm) Chuẩn hỗn hợp (A): Pha 100 mL chuẩn hỗn hợp caffeine 10ppm paracetamol 2,5ppm từ chuẩn gốc 100 ppm nước cất hai lần Chuẩn đơn caffeine (B): 100 mL chuẩn đơn caffeine 10 ppm từ dd chuẩn gốc 100 ppm nước cất hai lần Chuẩn đơn paracetamol (C): 100 mL chuẩn đơn paracetamol 2,5 ppm từ 100 ppm nước cất hai lần Chuẩn hỗn hợp trung gian (D): Pha 100 mL hỗn hợp chuẩn caffeine 100ppm paracetamon 25 ppm từ chuẩn gốc 1000ppm (dung dịch D) Các dung dịch chuẩn làm việc A, B, C, D sau pha xong, lọc xy lanh màng lọc 0,45µm, chuyển phần lọc vào ống nghiệm dán nhãn theo tên dung dịch Dãy chuẩn Đường chuẩn pha theo bảng sau: Viết nhãn Blank Nồng độ dãy CAF: chuẩn (ppm) PAR: Thể tích dung dịch D (mL) Định mức STD1 STD2 STD3 CAF: PAR: 0,25 CAF: PAR: 0,50 CAF: PAR: 1,25 1.00 2.00 5.00 STD4 CAF:10 PAR: 2,5 10.00 STD5 CAF:20 PAR: 20.00 Định mức tới vạch 100mL nước cất lần Các dãy dung dịch chuẩn sau pha xong, lọc xy lanh màng lọc 0,45µm (PTFE (Poly Tetra Fluoro Thylene- filter), chuyển phần lọc vào ống nghiệm dán nhãn theo đứng tên dung dich THỰC NGHIỆM 4.1 Nguyên tắc Caffeine paracetamol dược phẩm xác định HPLC- UV Tối ưu trình tách chuẩn, dựng đường chuẩn định lượng mẫu thuốc 4.2 Qui trình 4.2.1 Tối ưu trình tách 33 Do thời gian thực tập có hạn nên sinh viên không tiến hành khảo sát tốc độ dòng, mà chọn theo điều kiện tối ưu tốc độ dòng 1mL/phút 4.2 Khảo sát thành phần pha động Chọn bước sóng 263nm để khảo sát sơ trình tách Dùng chuẩn hỗn hợp A để khảo sát thành phần pha động Thành phần pha động khảo sát theo tỉ lệ dung môi (V:V) sau thay đổi tùy theo thực nghiệm MeOH: H2O = 50: 50 MeOH: H2O = 30: 70 MeOH: H2O = 20: 80 Lưu ý: Với máy HPLC-DAD, chọn CH1: 272nm; CH2: 207 nm 4.2.3 Định danh peak khảo sát bước sóng Caffein có thành phần pha động phù hợp, tiến hành tiêm chuẩn đơn B C để định danh peak (tR) chất Caffein: bước sóng 272 nm Paracetamol: bước sóng 207 nm 4.2.4 Xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính – Xác định LOD, LOQ – Tiến hành tiêm dung dịch vào hệ thống HPLC Đầu tiên mẫu trắng đến dung dịch chuẩn có nồng độ từ thấp đến cao chuẩn hỗn hợp caffeine Paracetamol – Xác định LOD, LOQ với mẫu trắng nước cất Sau đó, chạy dung dịch chuẩn cho S/N ~ Sau xác định S/N ~ chất sinh viên thực pha chuẩn hỗn hợp điểm chuẩn mà sinh viên xác định thực chạy thêm lần để xác nhận LOD Từ tính LOQ Ngun tắc xác định LOD thực tập: Có nhiều cách xác định LOD khác tuỳ thuộc vào phương pháp xác định như: xác định dựa độ lệch chuẩn, dựa tỷ lệ tín hiệu nhiễu, dựa đường chuẩn…Trong thực tập này, sinh viên tiếp cận cách xác định LOD dựa tỷ lệ tín hiệu nhiễu Cách xác định LOD dựa tỷ lệ tín hiệu nhiễu áp dụng quy trình sử dụng cơng cụ có nhiễu đường Thơng thường cách tính áp dụng phổ biến cho phương pháp sắc ký, điện di Cách xác định: 34 Chạy mẫu, mẫu thêm chuẩn chuẩn nồng độ thấp để cịn tín hiệu chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio), Trong đó: S chiều cao tín hiệu chất phân tích, N nhiễu đường Nhiễu đường tính hai phía đường tốt tính nhiễu lân cận hai bên píc, bề rộng bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng peak nửa chiều cao LOD chấp nhận nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3 Hình 1: Xác định LOD cách tính S/N 4.2.3 Phân tích mẫu thuốc Mỗi nhóm phân tích mẫu thuốc nhóm chuẩn bị mẫu PTN cung cấp: Cân 10 viên thuốc nghiền thành bột mịn Cân xác khoảng 500mg vào cốc thêm khoảng 50mL MeOH, đánh siêu âm chuyển hết vào bình định mức 100mL, định mức nước cất, lọc hệ thống áp suất lọc áp suất thường, sau lọc qua màng lọc 0,45μm Tiêm vào hệ thống HPLC Căn vào hàm lượng paracetamol cafein viên thuốc hệ số đáp ứng paracetamol caffeine mà pha loãng cho phù hợp Từ xác định hàm lượng paracetamol caffein viên thuốc Lưu ý Để kết phân tích đáng tin cậy Trong q trình phân tích cần thực mẫu để kiểm soát chất lượng sau:  Blank quy trình: thực mẫu blank theo quy trình phân tích để kiểm sốt nhiễm mẫu (kiểm sốt hố chất, dụng cụ thí nghiệm, mơi trường…)  Mẫu thêm chuẩn: Thêm lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử mẫu trắng, phân tích mẫu thêm chuẩn đó, tính hiệu suất thu hồi Sinh viên tự tính tốn mẫu thêm chuẩn báo cáo đến GV trước tiến hành thí nghiệm  Phân tích mẫu lặp: Mỗi mẫu cần thực lần (Sinh viên tự tính tốn, dự tính báo lại cho GV biết, ghi lại báo cáo phần kết quả) 35 Các dung dịch mẫu thử sau pha xong, lọc xy lanh màng lọc 0,45µm (PTFE (Poly Tetra Fluoro Thylene- filter), chuyển phần lọc vào ống nghiệm dán nhãn theo đứng tên dung dich YÊU CẦU BÁO CÁO 5.1 Tính kết Từ liệu có q trình đo: – Định danh chất sắc ký đồ, giải thích thứ tự rửa giải paracemol cafein – Nhận xét kết thu thay đổi thành phần pha động – Nêu điều kiện chạy tiến hành sắc ký với hổn hợp paracemol cafein – Xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính (tính với ppm chuẩn; tính với số µg bình định mức chứa mẫu tiêm vào máy HPLC) – Tính LOD, LOQ – Hàm lượng caffeine paracetamol mẫu tính với kỹ thuật đường chuẩn, kỹ thuật so sánh chuẩn, so sánh hai chuẩn 36 TRẢ LỜI CÂU HỎI Câu Trình bày cấu tạo hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao Câu Trình bày chế hoạt động van tiêm mẫu sắc kí lỏng Câu Trình bày nguyên tắc hoạt động đầu dị UV Câu Trình bày cách xác định LOD, LOQ Câu Trình bày cách xác đinh phương trình hồi quy tuyến tính Câu Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa thơng số sắc ký đồ? Giải thích 37