Thực hành kỹ thuật lên men và quá trình thiết bị

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM THỰC HÀNH KỸ THUẬT LÊN MEN VÀ QUÁ TRÌNH THIẾT BỊ Giảng viên hướng dẫn TS Nguyễn Thành Chung Sinh vi. Với sự phát triển mạnh mẽ ngành Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm của xã hội hiện đại, các kỹ thuật lên men đang dần phát triển hơn, cải thiện hơn và có tầm quan trọng trong cuộc sống hiện đại. Các thiết bị của quá trình đã phần nào giúp cho kỹ thuật lên men phát triển với số lượng lớn, tạo ra các canh trườngmôi trường giúp vi sinh vật phát triển nhanh, nó đã tạo tiền đề cho sự phát triển mạnh mẽ hơn nữa về xã hội sau này. I. MỤC ĐÍCH, MỤC TIÊU 1. MỤC ĐÍCH • Học hỏi và trải nghiệm khi tiếp xúc với quá trình lên men và các thiêt bị trong xưởng. • Trao đổi thêm những kiến thức để học hỏi và rèn luyện. • Ý thức được với công việc sau này, nguyên lý làm việc của các thiết bị lên men . 2. MỤC TIÊU • Nắm rõ các thao tác và nguyên lý hoạt động các quá trình thiết bị • Nắm rõ được chủng vi sinh vật. • Nắm rõ được quá trình lên men của vi sinh vật. II. CƠ SỞ KHOA HỌC 1. QUÁ TRÌNH LÊN MEN 1.1. Chủng vi sinh vật 1.1.1. Vi sinh vật Probiotic Probiotic hay lợi khuẩn gồm một nhóm các vi khuẩn rất khác nhau, có lợi cho sự tồn tại và phát triển của nhiều loài sinh vật khác, do phương thức sống cộng sinh tự nhiên, thường được tìm thấy trong hệ tiêu hoá của nhiều loài động vật. Chúng còn được gọi là vi khuẩn thân thiện hay vi khuẩn có lợi (vi khuẩn có lợi cho con người), những vi khuẩn này được bổ sung vào chế độ ăn nhằm cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột để cải thiện sức khỏe. Trong Probiotic có hai dạng: + có khả năng sinh bào tử  lấy ở pha suy vong + không có khả năng sinh bào tử  lấy sau pha phát triển, đầu cân bằng Theo nghĩa gốc, biotic hay biosis từ chữ life là đời sống, và pro là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu theo nghĩa cái gì thân thiện với đời sống con người. Trong thực tế, không ít người tìm cách sử dụng men vi sinh vì lợi ích sức khỏe chung chung trong khi đây cũng là một cách thức trị liệu của bác sĩ dành cho các bệnh lý rối loạn tiêu hóa, tăng cường chức năng đường ruột. Hơn nữa, ngay cả những người khỏe mạnh cũng có thể nhận được những lợi ích từ men vi sinh, giảm tần suất xảy ra những khó chịu trên đường tiêu hóa như đầy hơi, co thắt, tiêu chảy và táo bón. Các nhà khoa học luôn tìm tòi, khám phá thêm nhiều chế phẩm sinh học mới đóng vai trò làm men vi sinh để phù hợp với nhiều đối tượng khác nhau. Tuy nhiên, hai nhóm vi khuẩn phổ biến nhất thường được sử dụng để sản xuất men vi sinh cho người là Lactobacillus và Bifidobacterium. Ngoài ra, nấm men, Saccharomyces boulardii và một số chủng E. coli cũng đang là các “ứng cử viên” tiềm năng được sử dụng làm men vi sinh 1.1.2. Vi sinh vật lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn gram dương trong chi Lactobacillus. Nó được liên kết với các tổn thương sâu răng hoạt động. Nó cũng thường được tìm thấy trong lên men động vật và thực vật. Nó đã được tìm thấy trong bột chua. Một số chủng được coi là vi khuẩn có lợi hoặc vi khuẩn thân thiện ở động vật 4 và ít nhất một chủng đã được áp dụng để điều trị nhiễm trùng niệu sinh dục ở phụ nữ. thuộc chi Lactobacillus. Các loài trong chi này được sử dụng cho rất nhiều ứng dụng. Những ứng dụng này bao gồm thực phẩm và thức ăn lên men. Nó đã được tìm thấy rằng một số chủng cho Lactobacillus fermentum có sức đề kháng tự nhiên đối với một số loại kháng sinh và hóa trị liệu. Chúng được coi là các vec tơ tiềm năng của các gen kháng kháng sinh từ môi trường đến người hoặc động vật sang người. Lactobacillus fermentum đã được xác định là vi khuẩn có tiềm năng. Việc sử dụng các vi khuẩn đường ruột làm men vi sinh trong thực phẩm nhằm mục đích ngăn ngừa và điều trị các vấn đề sức khỏe khác nhau. Trong số các vấn đề sức khỏe dị ứng, tăng trưởng tân sinh và bệnh viêm ruột được bao gồm. Các lĩnh vực nghiên cứu gần đây đã tập trung vào sự ảnh hưởng của men vi sinh lên chức năng trao đổi chất của vật chủ. Một lĩnh vực là sự chuyển hóa cholesterol do LAB hoạt động như men vi sinh. Một xem xét quan trọng để xác định sự an toàn của Lactobacillus fermentum là các gen kháng chuyển. Để L. fermentum được coi là một loại vi khuẩn có tiềm năng, nó không được chứa bất kỳ gen kháng thuốc nào. Nếu một gen kháng thuốc có thể chuyển nhượng được, nó có thể làm giảm tác dụng của việc sử dụng kháng sinh.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - THỰC HÀNH KỸ THUẬT LÊN MEN VÀ QUÁ TRÌNH THIẾT BỊ Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thành Chung Sinh viên thực : Lớp : MSSV : Hà Nội, 28 tháng năm 2023 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ………………………………………………………… I MỤC ĐÍCH, MỤC TIÊU ………………………………… MỤC ĐÍCH …………………………………………………… MỤC TIÊU …………………………………………………… II CƠ SỞ KHOA HỌC ………………………………………… KỸ THUẬT LÊN MEN……………………………………… 1.1 Chủng vi sinh vật…………………………………………….5 1.1.1 Vi sinh vật Probiotic………………………………… 1.1.2 Vi sinh vật Lactobacillus fermentum…………………… 1.1.3 Vi sinh vật Lactic…………………………………………7 1.1.4.Vi sinh vật có sinh bào tử ………………………………… 1.2 Kỹ thuật lên men…………………………………………… QUÁ TRÌNH THIẾT BỊ……………………………………….11 2.1 Thiết bị lên men nồi vỏ…………………………….11 2.2 Lọc tiếp tuyến……………………………………….13 2.3 Bơm vuốt……………………………………………14 2.4 Hệ thống lọc nước RO ……………………………… 15 2.5 Tủ đông khô………………………………………… 16 2.6 Tủ cấy……………………………………………….17 2.7 Nồi tiệt trùng……………………………………… 18 2.8 Máy ly ………………………………………….19 tâm III QUY TRÌNH LÊN MEN VI SINH VẬT…………………… 20 Lên men.………………………………………………………20 Thu hồi sản phẩm …………………………………………… 20 IV QUAN SÁT VI SINH VẠT DƯỚI KÍNH HIỂN VI……… 21 CHUẨN BỊ DỤNG CỤ……………………………………….21 TIẾN HÀNH………………………………………………… 21 KẾT QUẢ…………………………………………………… 21 V PHA MÔI TRƯỜNG, CẤY VI SINH VẬT……………… 22 PHA MÔI TRƯỜNG………………………………………….22 CẤY VI SINH VẬT………………………………………… 22 KẾT QUẢ…………………………………………………… 23 MỞ ĐẦU Với phát triển mạnh mẽ ngành Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm xã hội đại, kỹ thuật lên men dần phát triển hơn, cải thiện có tầm quan trọng sống đại Các thiết bị trình phần giúp cho kỹ thuật lên men phát triển với số lượng lớn, tạo canh trường/môi trường giúp vi sinh vật phát triển nhanh, tạo tiền đề cho phát triển mạnh mẽ xã hội sau I MỤC ĐÍCH, MỤC TIÊU MỤC ĐÍCH  Học hỏi trải nghiệm tiếp xúc với trình lên men thiêt bị xưởng  Trao đổi thêm kiến thức để học hỏi rèn luyện  Ý thức với công việc sau này, nguyên lý làm việc thiết bị lên men MỤC TIÊU  Nắm rõ thao tác nguyên lý hoạt động trình thiết bị  Nắm rõ chủng vi sinh vật  Nắm rõ trình lên men vi sinh vật II CƠ SỞ KHOA HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN 1.1 Chủng vi sinh vật 1.1.1 Vi sinh vật Probiotic - Probiotic hay lợi khuẩn gồm nhóm vi khuẩn khác nhau, có lợi cho tồn phát triển nhiều loài sinh vật khác, phương thức sống cộng sinh tự nhiên, thường tìm thấy hệ tiêu hố nhiều lồi động vật Chúng gọi "vi khuẩn thân thiện" hay "vi khuẩn có lợi" (vi khuẩn có lợi cho người), vi khuẩn bổ sung vào chế độ ăn nhằm cân hệ vi khuẩn đường ruột để cải thiện sức khỏe Trong Probiotic có hai dạng: + có khả sinh bào tử  lấy pha suy vong + khơng có khả sinh bào tử  lấy sau pha phát triển, đầu cân - Theo nghĩa gốc, "biotic" hay "biosis" từ chữ "life" đời sống, "pro" thân thiện, nên probiotic hiểu theo nghĩa thân thiện với đời sống người - Trong thực tế, khơng người tìm cách sử dụng men vi sinh lợi ích sức khỏe chung chung cách thức trị liệu bác sĩ dành cho bệnh lý rối loạn tiêu hóa, tăng cường chức đường ruột Hơn nữa, người khỏe mạnh nhận lợi ích từ men vi sinh, giảm tần suất xảy khó chịu đường tiêu hóa đầy hơi, co thắt, tiêu chảy táo bón - Các nhà khoa học ln tìm tịi, khám phá thêm nhiều chế phẩm sinh học đóng vai trị làm men vi sinh để phù hợp với nhiều đối tượng khác Tuy nhiên, hai nhóm vi khuẩn phổ biến thường sử dụng để sản xuất men vi sinh cho người Lactobacillus Bifidobacterium Ngoài ra, nấm men, Saccharomyces boulardii số chủng E coli “ứng cử viên” tiềm sử dụng làm men vi sinh 1.1.2 Vi sinh vật lactobacillus fermentum - Lactobacillus fermentum loài vi khuẩn gram dương chi Lactobacillus Nó liên kết với tổn thương sâu hoạt động Nó thường tìm thấy lên men động vật thực vật Nó tìm thấy bột chua Một số chủng coi vi khuẩn có lợi vi khuẩn "thân thiện" động vật [4] chủng áp dụng để điều trị nhiễm trùng niệu sinh dục phụ nữ - thuộc chi Lactobacillus Các loài chi sử dụng cho nhiều ứng dụng Những ứng dụng bao gồm thực phẩm thức ăn lên men Nó tìm thấy số chủng cho Lactobacillus fermentum có sức đề kháng tự nhiên số loại kháng sinh hóa trị liệu Chúng coi vec tơ tiềm gen kháng kháng sinh từ môi trường đến người động vật sang người - Lactobacillus fermentum xác định vi khuẩn có tiềm Việc sử dụng vi khuẩn đường ruột làm men vi sinh thực phẩm nhằm mục đích ngăn ngừa điều trị vấn đề sức khỏe khác Trong số vấn đề sức khỏe dị ứng, tăng trưởng tân sinh bệnh viêm ruột bao gồm Các lĩnh vực nghiên cứu gần tập trung vào ảnh hưởng men vi sinh lên chức trao đổi chất vật chủ Một lĩnh vực chuyển hóa cholesterol LAB hoạt động men vi sinh - Một xem xét quan trọng để xác định an toàn Lactobacillus fermentum gen kháng chuyển Để L fermentum coi loại vi khuẩn có tiềm năng, khơng chứa gen kháng thuốc Nếu gen kháng thuốc chuyển nhượng được, làm giảm tác dụng việc sử dụng kháng sinh 1.1.3 Vi khuẩn Acid Lactic - Vi khuẩn Lactic thuộc họ Lactobacillaceae Những vi khuẩn thuộc nhóm có đặc điểm sinh thái khác đặc điểm sinh lí tương đối giống - Một vai trị loại vi khuẩn q trình lên men Q trình lên men vi khuẩn sản sinh acid lactic điều làm giảm độ PH môi trường vi khuẩn lên men Độ PH thấp làm cho nhiều loại vi khuẩn có hại khác khơng có điều kiện để phát triển Vì làm tăng thời gian thực phẩm bị phân hủy, giúp cho công nghệ thực phẩm bảo quản lâu Và ứng dụng lớn vi khuẩn đời sống người - Lên men lactic xảy điều kiện yếm khí, gồm loại là: lên men đồng hình lên men dị hình - vi khuẩn lactic có ứng dụng quan trọng trình sau đây:  Vi khuẩn lactic trình lên men sữa chua  Vi khuẩn lactic trình lên men đồ chua: làm dưa chua, làm chua mà không làm màu tự nhiên Thường dùng sản xuất nước tương, đậu phụ nhiều sản phẩm khác  Vi khuẩn lactic giá trị y học: sử dụng chủng vi khuẩn phòng ngừa điều trị bệnh phục hồi trì sức khỏe, vi khuẩn Lactic sử dụng điều trị làm điều chỉnh miễn dịch, giảm cholesterol, ngăn ngừa ung thư … 1.1.4 Vi sinh vật có khả sinh bào tử Trong tự nhiên vi sinh vật có khả sinh bào tử hình thành môi trường hạn chế chất dinh dưỡng - Cơ chế hình thành trình tạo bào tử thường bao gồm giai đoạn sau:  Lúc đầu lớp nguyên sinh chất tế bào sử dụng  Tế bào chất nhân tập trung vị trí định tế bào  Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại tạo thành tiền bảo tử  Tiền bào tử bắt đầu bao bọc dần lớp màng Tiền bào tử phát triển trở thành bào tử  Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng tự phân giải bào tử giải phóng khỏi tế bào mẹ  Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử hút nước bị trương -  Sau đó, vỏ chúng bị phá hủy bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào - Khi dạng bào tử, vi sinh vật khơng hoạt động thời gian dài giữ khả chống chịu đáng kể tác hại mơi trường bên ngồi nhiệt độ, xạ, hóa chất độc hại độ pH khắc nghiệt (như pH dày: 1-3) Đặc điểm bào tử, vi sinh vật ứng dụng nhiều y học, sản suất men tiêu hóa (cho người) với thành phần bào tử vi sinh vật Khi người có hệ tiêu hóa bổ sung bào tử vi sinh vật, bào tử tồn dày sau xuống ruột nảy mầm đầu ruột non, chúng tồn hệ đường ruột - Bào tử trạng thái không hoạt động kháng thuốc nhiều năm, tiếp xúc với chất dinh dưỡng đầy đủ, bào tử sống lại sau vài phút nảy mầm Sự nảy mầm thường kích hoạt diện chất dinh dưỡng, bao gồm axit amin, đường nucleoside 1.2 Kỹ thuật lên men 1.2.1 Khái niệm lên men - - Lên men công nghệ lâu đời tất q trình cơng nghệ sinh học Theo tiếng Latin, động từ fevere, có nghĩa sơi xuất nước chiết malt nghiền tác động nấm men trình sản xuất rượu Lên men q trình chuyển hóa hóa học nhờ thể sống sản phẩm chúng thường sinh khí (CO2) nhiệt Các nhà vi sinh vật xem lên men “bất kỳ trình sản xuất sản phẩm cách nuôi cấy lượng lớn vi sinh vật”, cịn nhà sinh hóa học xem lên - men trình sinh lượng hợp chất hữu tất chất nhường nhận điện tử; lên men q trình kỵ khí mà lượng sản sinh khơng có tham gia oxy chất nhận điện tử vô Đây q trình lên men kỵ khí nhờ vi sinh vật lên men hay gọi lên men truyền thống Lên men phương pháp dùng để chuyển hóa nguyên liệu để thu sản phẩm phục vụ cho đời sống người Ban đầu lên men dùng sản xuất loại thực phẩm rượu, giấm, sữa chua,… Cùng với phát triển khoa học ưu điểm vượt trội mình, lên men cịn dùng để sản xuất nhiều loại sản phẩm dịch vụ khác kháng sinh, hóa chất, xử lý nước thải Kỹ thuật lên men trở nên ngày phong phú nhiều mặt khác nhau: nguyên liệu, sản phẩm, trang thiết bị Q trình lên men có oxy phân tử tham gia, để sinh tổng hợp chất trao đổi sơ cấp thứ cấp, sinh tổng hợp loại enzym v.v… lên men hiếu khí hay cịn gọi lên men sinh tổng hợp 1.2.2 Đặc điểm trình lên men - - - - - Về thực chất, biến đổi chất tác động enzyme vi sinh vật tạo Thế mà vi sinh vật thường không tạo enzyme mà nhiều enzyme khác Do sản phẩm trình lên men gồm nhiều thành phần, bên cạnh thành phần chính, cịn có số thành phần phụ Điều làm cho sản phẩm lên men có nét đặc trưng khác nhau, thí dụ hương vị đặc trưng loại bia -Nếu dịch lên men có tồn nhiều pha, thí dụ lỏng-khí, vi sinh vật thường hoạt động bề mặt giao tiếp pha Như việc làm gia tăng diện tích tiếp xúc pha yêu cầu quan trọng Thường pha lỏng dung dịch nước Nồng độ chất sản phẩm thiết bị lên men thường không cao Một lý quan trọng nồng độ cao chất ức chế trình lên men (thí dụ hàm lượng đường cao hay rượu cao ảnh hưởng xấu đến lên men rượu) Một lý khác nồng độ tối ưu chất sản phẩm cho hoạt động vi sinh vật thường khoảng tương đối hẹp Vi sinh vật điều chỉnh (trong phạm vi định) tiến trình bên thể để đáp ứng với mơi trường bên ngồi Như cho ta thấy mặt, trình lên men có tính linh hoạt đáp ứng với số biến động môi trường lên men, mặt khác, mơi trường lên men có tác động đáng kể đến sản phẩm thu Nho ruộng, thu hoạch hai năm khác có chất lượng vang khác nhau, điều kiện khác lên men giữ giống hệt Các chủng vi sinh vật dùng công nghiệp lên men thường nhạy cảm với mơi trường (pH, nhiệt độ, lượng oxy,…) Do đó, việc trì mơi 10  Bình ni cấy chế tạo vật liệu inox 304 316, mối hàn láng đảm bảo tiêu chuẩn sản xuất vắc xin, sinh phẩm  Hệ thống vận hành thuận tiện, tiệt trùng chỗ điện nóng  Thiết bị điều khiển đo nhiệt độ, độ pH, hiển thị độ hòa tan oxy  Hệ thống khuấy  Thiết bị điều khiển đo nhiệt độ  Vị trí lấy mẫu kiểm tra sản xuất: thuận tiện, dễ dàng an tồn  Các van màng đóng mở có tiếp xúc với sản phẩm theo tiêu chuẩn vi sinh  Phần vỏ áo làm inox 304 bố trí đầu nối van an tồn, van thoát, nguồn nhiệt nguồn nước làm mát vào hợp lý vị trí thao tác  Hệ thống điều khiển cài đặt theo chương trình phù hợp với yêu cầu sản xuất  Phần bình có cửa nhìn vệ sinh cho phía bên bình  Hệ thống vệ sinh, làm sau kết thúc thuận tiện tin cậy sử dụng sản xuất lô  Bộ phận tạo nóng cho việc tiệt trùng van lấy mẫu thu hoạch 12 động hộp giảm tốc khớp nối ổ bi vịng bít kín trục thành thiết bị máy khuấy trộn tuabin trao đổi nhiệt kiểu ống xoắn 10 khớp nối 11 ống nạp khơng khí 12 máy trộn kiểu cánh quạt 13 13 sủi bọt 14 máy khuấy dạng vít 15 ổ đỡ 16 khớp để tháo 17 ao 18 khớp nạp liệu 19.khớp nạp không khí - Ngun lý hoạt động: Q trình ni cấy vi sinh vật phần lớn tiến hành điều kiện tiệt trùng Độ tiệt trùng trình đảm bảo phương pháp tiệt trùng thiết bị lên men, đường ống dẫn, cảm biến dụng cụ; nạp môi trường dinh dưỡng tiệt trùng giống cấy chuẩn vào thiết bị lên men tiệt trùng; khơng khí tiệt trùng để thơng gió canh trường chất khử bọt tiệt trùng; dụng cụ cảm biến tiệt trùng thiết bị lên men để kiểm tra điều chỉnh thông số trình; bảo vệ vật đệm kín trục chuyển đảo, đường ống công nghệ phụ tùng q trình ni cấy 14 2.2 Lọc tiếp tuyến - Lọc tiếp tuyến lọc toàn dịch lỏng đầu vào di chuyển vào cột lọc/casette thông qua bơm áp lực dịch có kích thước/trọng lượng phân tử nhỏ tiếp tuyến qua bề mặt màng lọc để qua đường dịch qua màng (gọi tắt permeate), chất có kích thước/trọng lượng phân tử lớn cỡ lỗ màng lọc qua đường hồi (gọi retentate) quay lại bình chứa bình thu ban đầu 15 Cơng dụng: - Lọc phân loại dịch nuôi cấy tế bào, dịch lên men - Thu hoạch tế bào - Cô đặc tinh loại vắc xin - Cô đặc/ thẩm tích kháng thể đơn dịng, protein tái tổ hợp, enzym, phân tử sinh học lớn, peptid 2.3 Bơm vuốt - Bơm vuốt loại bơm chuyển chất lưu tích cực nhờ ống mềm đàn hồi chuyển quay trịn lăn bên ngồi giúp nén ống tạo chênh áp để hút xả chất bơm - Nguyên lý hoạt động: 16 Bơm vuốt hoạt động dựa nguyên lý thay đổi thể tích ống mềm để tạo áp suất dương đủ để hút xả chất bơm theo lưu lượng định tùy theo tần suất nén mở ống đàn hồi thơng qua chuyển động quay trịn rotor Do hầu hết bơm nhu động bơm có dạng vỏ máy hình trịn Một vịng bơm hoàn chỉnh bao gồm chu kỳ liên tục sau:  Chu kỳ hút: Khi lăn số tiếp xúc với ống ống bị nén kịt lại Lúc phần ống phía sau đàn hồi trở lại trạng thái ban đầu tạo áp suất chân không hút chất bơm vào ống  Chu kỳ chuyển: Khi lăn số chạm ống phần chất lưu hút vào giữ lại phần ống hai lăn, sau q trình quay chuyển phần chất bơm bán chu kỳ quay  Chu kỳ xả: Khi lăn thứ qua bán chu kỳ khơng cịn ép lên ống đàn hồi phần chất bơm bị giữ ống xả bơm nhờ lực đẩy lăn số (vẫn ép ống) 2.4 Hệ thống lọc nước RO - Nguyên lý hoạt động: Đầu tiên, nguồn nước bơm vào hệ thống xử lý Nó xử lý hết toàn kim loại nặng để đưa đến hệ thống xử lý than hoạt tính, hệ thống làm mềm nước, hệ lọc bảo vệ Cuối nước 17 chuyển đến màng lọc thẩm thấu ngược R.O Và để chiết xuất nguồn nước tinh khiết sử dụng tiện lợi cho ăn uống sinh hoạt 2.5 Tủ lạnh -70 độ C - Nguyên lý hoạt đơng: Đơng khơ vi sinh vật q trình tách nước khỏi tế vi sinh vật trạng thái lạnh qua hệ thống thiết bị theo hai bước cụ thể: 18  Đầu tiên vi sinh vật làm huyền phù mơi trường thích hợp, sau giữ điều kiện lạnh sâu (-70 oC) để đóng băng vi sinh vật Ở giai đoạn đầu làm khô, nước đóng băng loại bỏ khỏi mẫu thơng qua trình thăng hoa cách giảm áp suất chân không buồng sấy đến giá trị thấp áp suất bay nước để nước chuyển từ mẫu sang bình ngưng Mơi trường chân khơng làm đẩy nhanh trình thăng hoa nước Khoảng 95% lượng nước mẫu loại bỏ giai đoạn  Sau loại bỏ phần lớn lượng nước, giai đoạn làm khô (tách ẩm) nhằm loại bỏ độ ẩm cịn sót lại mẫu cách tăng nhiệt độ cao giai đoạn đầu Độ ẩm mẫu lúc khoảng 1-5% Sau đó, mẫu hàn kín để đảm bảo mẫu giữ môi trường chân không nhằm tăng thời gian bảo quản 2.6 Tủ cấy vi sinh - Tủ cấy vi sinh (tủ an tồn sinh học hay tủ ni cấy mô ) tên gọi hệ thống làm việc thiết kế để ngăn ngừa tác nhân ô nhiễm thao tác mẫu sinh học, vật liệu nhạy cảm với hạt bụi 19 - Khơng khí hút thơng qua lọc HEPA đưa vào buồng thao tác Ngun lý hoạt động:  Khơng khí phịng vào từ phía tủ cấy thơng qua lớp màng lọc thô Tại hạt bụi lớn giữ lại, trình giúp làm tăng tuổi thọ cho màng lọc Sau khơng khí lọc qua màng lọc vơ trùng HEPA, màng lọc HEPA thổi bay hạt bụi bẩn tạo dịng khí (thổi đứng thổi ngang tùy vào loại tủ cấy vi sinh) vào bên khoang làm việc Khơng khí ngang qua khu vực làm việc (thẳng đứng ngang tùy vào loại tủ) theo hướng chiều thoát từ mặt trước mở cửa tủ  Màng lọc Hepa lọc hạt bụi có kích thước nhỏ từ 0.3um… Hiệu suất lọc đến 99.99% giúp cho khơng khí lọc khử mùi hiệu quả, giúp đảm bảo cho môi trường làm việc đạt chuẩn tiêu chuẩn Về nguyên lý hoạt động tủ cấy vơ trùng cấp khơng khí vơ trùng liên tục vào khoang làm việc 2.7 Nồi tiệt trùng 20 - - Là thiết bị dùng để khử trùng vật dụng cụ phẫu thuật, thiết bị, dụng cụ y tế, hay vật dụng phịng thí nghiệm Trên thực tế, nồi hấp giống nồi áp suất khổng lồ, sử dụng sức mạnh từ nước để tiêu diệt hết loại vi sinh vật hay vi trùng cịn sót lại sau vật cần khử trùng rửa qua nước sôi hay chất tẩy rửa Nguyên lý hoạt động: Các vi sinh vật, bào tử hay vi khuẩn bị tiêu diệt hoàn toàn hấp đun sơi nhiệt độ 100°C Vì vậy, cần có phương pháp tiệt trùng mang đến hiệu cao để đảm bảo tiêu diệt hết vi sinh vật, bào tử hay vi khuẩn vật cần khử trùng Nguyên lý hoạt động nồi hấp tiệt trùng: gia nhiệt, nồi hấp đóng kín van tạo áp suất cao buồng hấp, làm thay đổi nhiệt độ sôi bay nước (thông thường nước sôi bốc 100°C) lên nhiệt độ cài đặt (thường 121°C), tạo nước bão hòa buồng hấp giúp tiệt trùng Theo nghiên cứu, tiệt trùng nhiệt độ khoảng 121°C, khoảng thời gian từ 15 - 20 phút, vi khuẩn vi sinh vật bị tiêu diệt hoàn toàn tác động từ nước bão hòa điều kiện áp suất cao 21 2.8 Máy ly tâm - - - Ly tâm q trình tách đặc phân tử có khối lượng riêng khác nhau, thường tách pha rắn khỏi pha lỏng dựa kích thước hạt mật độ khác chúng nhờ lực ly tâm Do ảnh hưởng trọng lực, hai phần tử có khối lượng khác lắng tốc độ tương đương với trọng lượng Máy ly tâm thiết bị tạo để thực trình ly tâm Nguyên lý hoạt động: Được sử dụng để tách hỗn hợp hai pha rắn - lỏng lỏng - lỏng thành phần riêng biệt Máy có rotor quay với tốc độ lớn tạo lực ly tâm cao Trong máy ly tâm hoạt động, nguyên liệu chuyển động quay với rotor máy Dưới tác dụng lực ly tâm, phần tử có khối lượng riêng khác phân lớp theo hướng gia tốc trường lực Phần tử có khối lượng riêng nhỏ tập trung tâm rotor, ngược lại phần tử có khối lượng riêng lớn tập trung vùng xa rotor Máy ly tâm ứng dụng nhiều lĩnh vực như:  Tách phân tử gây cháy, tách vi khuẩn  Ly tâm trước lọc nhằm tăng suất máy, giảm thời gian, giảm hao phí sản xuất nước quả, dầu thực vật,…  Làm sạch, tách tạp chất sản xuất dầu ăn, tinh bột, giúp nâng cao chất lượng sản phẩm  Khai thác, thu nhận sản phẩm từ hỗn hợp bao gồm pha rắn dung dịch bao quanh thu đường sacarozo, glucozo, mì chính,  Thu enzyme sau thời gian nuôi cấy  Thu nhận chế phẩm enzyme sau kết tủa cồn  Ly tâm để phân chia sản phẩm, ví dụ: tách sữa, bơ, 22 III QUY TRÌNH LÊN MEN VI SINH VẬT LÊN MEN - Bước Kiểm tra chất lượng giống: Chủng giống sản xuất phải đảm sạch, vô trùng, đảm bảo chất lượng đưa vào sản xuất, phải kiểm tra chất lượng giống phịng thí nghiệm trước đưa vào sản xuất Giống bảo quản tủ lạnh sâu hay giống sản xuất, phải kiểm tra chất lượng trước sử dụng, chủng giống có suất cao thường chọn lọc phương pháp gây đột biến hay kỹ thuật gen, dễ bị thối hóa (hay gọi lại giống) - - Bước Hoạt hóa giống: Giống thường bảo quản ống nghiệm tủ lạnh sâu hay tủ lạnh, trước sử dụng phải lấy ống từ từ, tránh gây sốc nhiệt, ảnh hưởng đến chất lượng giống Sau đó, giống cấy truyền sang mơi trường thạch nghiêng ống nghiệm (mỗi loại giống có thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy khác lựa chọn) Giống nuôi tủ ấm nhiệt độ thích hợp giống mọc tốt lấy ra, dùng que cấy cấy giống vào bình tam giác có mơi trường lên men (thường tỷ lệ mơi trường 1/10 thể tích bình) ni máy lắc nhiệt độ phù hợp Thời gian nuôi phù thuộc vào loại vi sinh vật (đối với vi khuẩn 24-48 giờ, nấm men, nấm sợi 48-72 giờ, xạ khuẩn 96120 giờ) sau lấy kiểm tra chất lượng giống, trước đưa vào sản xuất Bước Nhân giống: Để đảm bảo chất lượng giống tốt cho trình lên men giống phải có khả sinh trưởng phát triển tốt (cho sinh khối nhiều) thời gian cấy giống vào bình lên men giống sinh trưởng, phát triển pha tăng tốc (pha log) tốt THU HỒI SẢN PHẨM - Xử lí dịch lên men Phân tách sinh khối dịch lên men bơm vuốt lọc tiếp tuyến Cô đặc sản phẩm cách cho vào tủ âm sâu, vi sinh vật Lactobacillus fermentum vào tủ âm sâu, áp suất chệnh lệch giúp cho nhiệt độ nóng vi sinh vật giảm xuống nhiệt độ để co cụm lại 23 - vi sinh vật Lactobacillus fermentum sinh bào tử có lớp bảo vệ chắn để giúp chúng chịu điều kiện khắc nghiệt Tinh vi sinh vật Hoàn thiện: vi sinh vật cho vào thiết bị làm lạnh, có độ chân khơng cao đồng thời nhiệt độ giảm dần xuống làm cho môi trường vi sinh vật sang trạng thái rắn bắt đầu trình thăng hoa từ trạng thái rắn thành trạng thái không qua trang thái lỏng, giúp cho vi sinh vật không bị biến tính khơng bị diệt vong IV QUAN SÁT VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - Kính hiển vi để soi vi sinh vật Buồng đếm Canh trường bậc vi sinh vật Lactobacillus fermentum Pipette, đầu Dầu để soi kính hiển vi Nước cất Phiến kính TIẾN HÀNH - Pha loãng vi sinh vật Lactobacillus fermentum , nước theo thứ tự 100µL, 900µL Nhỏ giọt nhỏ lên buồng đếm , đặt phiếu kính lên, nhỏ dầu Chờ 2-3 phút cho vi sinh vật Lactobacillus fermentum lắng xuống đếm theo ô KẾT QUẢ - ô :224 tế bào vi sinh vật Lactobacillus fermentum - Ta có phép tính sau: = = 0,000125 mm3 = 125.10-7 ml - Ta có độ phóng đại 100x  =1,792.1010 ( tế bào/ml ) 24 V PHA MÔI TRƯỜNG, CẤY VI SINH VẬT PHA MÔI TRƯỜNG - Lấy 600 mL nước pha với môi trường MRS media sau:  Peplone 6g  Cao thịt 6g  Cao nấm men 3g  Glucose 12g  K2HPO4 1,578g  Amonium citrate 1,2g  MgSO4 0,246g  MnSO4 0,132g  CH3COONa 3g  Agar 12g - Mang khử trùng với 24 đĩa pepti ngồi tiệt trùng Sau tiệt trùng xong, khuấy môi trường nhiệt độ giảm cịn 60-70 độ C mang đổ môi trường agar vào đĩa pepti tủ cấy vi sinh vật CẤY VI SINH VẬT 2.1 Khái niệm - Nuôi cấy vi khuẩn đưa bệnh phẩm nghi ngờ chứa vi khuẩn vào mơi trường thích hợp nhằm tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển Khuẩn lạc loại vi khuẩn định nghĩa cụm (Colony), nhìn thấy mắt thường, sinh khối vi khuẩn chúng phát triển bề mặt giá thể cứng 2.2 Nuôi cấy vi sinh vật - Pha loãng vi sinh vật: Độ pha loãng: pha loãng đến 10-11 + 100: 0,37g vi sinh vật Lactobacillus fermentum 3ml nước  lắc kĩ + 10-1: 300µL lấy từ độ pha lỗng 100 thêm 2700µL nước  lắc kĩ 25 - + 10-2: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-1 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-3: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-2 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-4: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-3 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-5: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-4 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-6: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-5 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-7: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-6 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-8: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-7 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-9: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-8 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-10: 300µL lấy từ độ pha lỗng 10-9 thêm 2700µL nước  lắc kĩ + 10-11:300µL lấy từ độ pha lỗng 10-10 thêm 2700µL nước  lắc kĩ Sử dụng phương pháp cấy trang: Là sử dụng que kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn bề mặt thạch rắn Các bước tiến hành:      Hơ que cấy trang cồn để diệt hết vi khuẩn Lấy 100µL từ độ pha lỗng 10-6 đến 10-11 cho vào môi trường thạch agar(24 đĩa, độ pha loãng lấy đĩa) Sau que cấy trang ngồi cấy trang hết mơi trường lỏng Sau cấy hết 24 đĩa mang nuôi cấy Sau 26 tiếng thu khuẩn lạc từ vi sinh vật Lactobacillus fermentum KẾT QUẢ - Ta thu bảng sau: 10-6 41 46 47 -7 10 5 -8 10 0 10-9 -10 10 0 -11 10 0 - Ta có kết tính mật độ tế bào khuẩn lạc vi sinh vật Lactobacillus fermentum ml sau: -11 = (10 ) mẫu, có 1ml= 1000µl  chuyển ml  Ta có : = = 4,976.10-3 (CFU/ml) - Kết tính mật độ tế bào khuẩn lạc vi sinh vật Lactobacillus fermentum : = = 4,026.109 (CFU/g) 26