PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ThS Nguyễn Kim Thạch BM Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 1 E mail nguyenkimthach@pnt edu vn Kary Mullis 1985[.]
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ThS Nguyễn Kim Thạch BM Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch E-mail: nguyenkimthach@pnt.edu.vn Kary Mullis 1985 Đạt giải Nobel 1993 • PCR: phản ứng chuỗi DNA trùng hợp • Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo đoạn DNA với tốc độ nhanh, có độ xác cao, khơng cần diện tế bào • Phản ứng PCR cho phép khuyếch đại đoạn DNA nằm mồi chuyên biệt, nhờ DNA polymerase Nguyên tắc • Dựa hoạt động emzyme • Sự diện mồi chuyên biệt • Khả nối dài mồi taq polymerase • Các Nu tự môi trường Máy PCR Các bước phản ứng • Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ chu kỳ gồm bước – Bước 1: Biến tính (denaturation) • 94-98oC • 2-5 phút – Bước 2: Gắn mồi (anneealing) • 30-65oC • 20s-2’ – Bước 3: kéo dài (extending) • 68-72oC • 20s-5’ Các bước phản ứng Các chu kỳ kỹ thuật PCR Sơ đồ phản ứng chuỗi Polymerase Mồi (primers) - Oligonucleotide đơn mạch (18-24 b) bổ sung với vùng trình tự DNA - Mồi xuôi (sense primer Forward) bắt cặp với mạch khuôn DNA kéo dài theo chiều phiên mã - Mồi ngược (anti sense primer Reverse) bắt cặp với mạch mã DNA kéo dài ngược theo chiều phiên mã 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Nguyên tắc thiết kế mồi – Trình tự mồi thiết kế cho khơng có bắt cặp mồi xi mồi ngược, kể cấu trúc kẹp tóc – Nhiệt độ gắn mồi mồi xuôi mồi ngược không chênh lệch xa (Không nên nhiều G C nối tiếp thường tỷ lệ G, C nằm khoảng 30%< G+C 5’ exonuclease Tỷ lệ chép sai thấp (1.5x10-6) Sao chép ~ 500b/min Dung dịch đệm (Buffers) • • • Có nhiều loại buffer sử dụng riêng cho loại enzyme Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt ảnh hưởng đến phản ứng Nhiều loại buffer có sẵn ion Mg2+ Nồng độ Mg2+ dNTP • Nồng độ ion Mg2+ cao: xuất thêm sản phẩm khơng đặc hiệu • Nồng độ ion Mg2+ thấp: lượng sản phẩm PCR thấp • Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA polymerase, DNA mẫu thành phần buffer • gradien nồng độ từ 0.5 đến mM với khoảng cách bước 0.2 mM • dNTPs loại hóa chất bền • Lượng dNTP tối ưu 200 µM of loại dNTP Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh yếu tố khác Chất bổ sung khác • Đối với DNA template lớn, giàu GC sử dụng chất biến tính DMSO, formamide, glycerol, and betaine thành phần PCR • Tăng lượng DMSO PCR cần giảm nhiệt bắt mồi xuống • Dầu khống Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR DNA mẫu: (100ng-1g) Enzyme Mồi nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ lai) dNTP: 20-200M/ lọai Nu Nồng độ Mg++ Số lượng chu kỳ phản ứng Thiết bị dụng cụ cho phản ứng Một số vấn đề thường gặp • Vệt smear kích thước lớn sản phẩm mong muốn – Giảm DNA, thời gian kéo dài, số chu kỳ – Tăng nhiệt độ gắn mồi – Thay đổi nồng độ Mg2+ – Tăng thời gian kéo dài sp mear có kt nhỏ Một số vấn đề thường gặp Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp sản phẩm mong muốn – – – – – – – Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi Tăng thời gian kéo dài thêm 30s Giảm nồng độ DNA polymerase Tối ưu hóa nồng độ Mg2+ Tinh DNA template Giảm nồng độ primer Thiết kế cặp primer Tóm tắt qui trình thực phản ứng PCR Thiết kế mồi Chuẩn bị mẫu DNA Pha mix với thành phần theo thứ tự sau: – H2O tiệt trùng – Buffer – dNTP tổng số – mồi xuôi – mồi ngược – Taq polymerase – DNA mẫu Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp Kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose với có mặt thang chuẩn Phân tích kết