X Po pleu XÂY DỰN orcine cir ropneum NG QUY rcovirus ty moniae GÂ Y TRÌNH type 2, H ÂY BỆN H MULTI Haemoph NH HÔ H IPLEX P ilus para HẤP PHỨ PCR PHÁ asuis, Act ỨC HỢP ÁT HIỆN tinobacill TRÊN H N lus HEO

    BỘ B GIÁO D DỤC VÀ ĐÀO Đ TẠO TRƯỜN NG ĐẠI HỌ ỌC NÔNG G LÂM TH HÀNH PHỐ Ố HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠN NG NGHỆ Ệ SINH HỌ ỌC K KHÓA A LUẬ ẬN TỐ ỐT NG GHIỆP P X XÂY DỰN NG QUY Y TRÌNH H MULTIIPLEX P PCR PHÁ ÁT HIỆN N Poorcine cirrcovirus type ty 2, Haemoph H ilus paraasuis, Acttinobacilllus pleuropneum moniae GÂ ÂY BỆN NH HÔ HẤP H PHỨ ỨC HỢP TRÊN H HEO Ngành h học : CÔNG G NGHỆ S SINH HỌC C Sinh viiên thực hiiện : ĐỒN N THỊ NH HUNG Khóa : 2009 - 2013 háng 6/2013 Th BỘ B GIÁO D DỤC VÀ ĐÀO Đ TẠO TRƯỜN NG ĐẠI HỌ ỌC NÔNG G LÂM TH HÀNH PHỐ Ố HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠN NG NGHỆ Ệ SINH HỌ ỌC K KHĨA A LUẬ ẬN TỐ ỐT NG GHIỆP P X XÂY DỰN NG QUY Y TRÌNH H MULTIIPLEX P PCR PHÁ ÁT HIỆN N Poorcine cirrcovirus type ty 2, Haemoph H ilus paraasuis, Acttinobacilllus pleuropneum moniae GÂ ÂY BỆN NH HÔ HẤP H PHỨ ỨC HỢP TRÊN H HEO ọc: Hướng dẫẫn khoa họ Sinh viên thực hiện: h TS NGUY YỄN TẤT TOÀN ÀN THỊ NHUNG ĐOÀ ThS ĐỖ TIẾN DUY Y háng 6/2013 Th LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời biết ơn chân thành đến Bố Mẹ sinh thành, không quản nắng mưa vất vả nuôi nấng, dạy dỗ ngày hôm Gia đình ln bên lúc nơi, chỗ dựa tinh thần vững cho sống Em xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, tồn thể q thầy tận tâm tạo điều kiện thuận lợi truyền đạt kiến thức suốt trình học tập trường thực khóa luận Em xin chân thành biết ơn: TS Nguyễn Tất Toàn ThS Đỗ Tiến Duy hết lòng hướng dẫn, động viên em suốt q trình thực khóa luận BSTY Lê Thị Hạnh Dung BSTY Nguyễn Phạm Huỳnh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực tập tốt nghiệp Xin cảm ơn: Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Các anh chị công tác làm đề tài tốt nghiệp Bệnh Viện Thú Y nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt thời gian thực tập Tập thể lớp DH09SH quan tâm, giúp đỡ, động viên chia sẻ vui buồn tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn ĐỒN THỊ NHUNG   i TÓM TẮT Đề tài “Xây dựng quy trình multiplex-PCR phát Porcine circovirus type (PCV2), Haemophilus parasuis (HP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) gây bệnh hô hấp phức hợp heo” thực từ 15/12/2012 đến 30/06/2013 Phòng xét nghiệm sinh học phân tử - tế bào thuộc Bệnh Viện Thú Y, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát đồng thời mầm bệnh Porcine circovirus type (PCV2), Haemophilus parasuis (HP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) xác hiệu Các kết nghiên cứu đạt gồm: (1) kiểm tra ba quy trình s-PCR phát riêng lẻ PCV2, APP, HP hồn tồn đặc hiệu; (2) quy trình m-PCR có nồng độ mồi tối ưu HPF-cysS, HPR-cysS; APPF-cpxA, APPR-cpxA; PCV2F-ORF2, PCV2R-ORF2 0,5 µM, 0,5 µM; 0,5 µM, 0,5 µM; µM,1 µM; (3) chu trình luân nhiệt phản ứng mPCR tối ưu sau: tiền biến tính 95oC phút; biến tính 94oC 30 giây; bắt cặp 56oC phút; kéo dài 72oC phút; giai đoạn kéo dài cuối 72oC phút Quy trình multiplex – PCR sau tối ưu hóa ứng dụng khả thi mẫu thực địa, nhiên chưa đạt kết mong muốn việc phát PCV2 nên cần có điều chỉnh nhỏ để ứng dụng khả thi thực tiễn ii SUMMARY The study entitled "Development of multiplex-PCR to detect the porcine Circovirus type (PCV2), Haemophilus parasuis (HP), and Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) causes complex respiratory disease in swine" carried out from 15/12/2012 to 30/06/2013 in molecular biology - the cell laboratory of Veterinary Hospital, Faculty of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Ho Chi Minh city Agriculture and Forestry University This study aimed to develop a procedure of Multiplex-PCR for simultaneous detection of three major pathogens such as porcine Circovirus type (PCV2), Haemophilus parasuis (HP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) accurately and efficiently The research results achieved include (1) all three individual s-PCRs detected PCV2, APP, and HP were completely specific, (2) the m-PCR primer concentrations optimized HPF-cysS, HPR-cysS; APPF-cpxA, appr-cpxA; PCV2FORF2, PCV2R-ORF2 were 0.5 uM, 0.5 uM; 0.5 uM, 0.5 uM; uM, uM, respectively (3) m-PCR thermal cycling reaction optimized as follows: predenaturation at 95 °C for minutes, denaturation at 94oC for 30 seconds, and annealing temperature at 56 °C in one minute, then extension at 72oC for minute; final phase of last elongation for minutes at 72oC This multiplex-PCR procedure after optimization was possible applications in field samples, however, a bit have not achieved the desired results in the detection of PCV2 then still need a minor adjustment to external applications more feasible in pratice Keywords: multiplex PCR, Porcine circovirus type 2, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae, swine iii MỤC LỤC   Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan bệnh virut Porcine circovirus type (PCV2) 2.1.1 Đặc điểm Porcine circovirus type (PCV2) 2.1.2 Dịch tễ học Porcine circovirus type (PCV2) 2.1.3 Bệnh liên quan đến Porcine circovirus type (PCV2) 2.2 Tổng quan bệnh vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 2.2.1 Đặc điểm Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 2.2.2 Dịch tễ học Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 2.2.3 Cơ chế sinh bệnh Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 2.2.4 Triệu chứng bệnh Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 2.3 Tổng quan bệnh vi khuẩn Haemophilus parasuis (HP) 2.3.1 Đặc điểm Haemophilus parasuis (HP) 2.3.2 Dịch tễ học Haemophilus parasuis (HP) 2.3.3 Cơ chế sinh bệnh Haemophilus parasuis (HP) 2.3.4 Triệu chứng bệnh Haemophilus parasuis (HP) 2.4 Tổng quan bệnh hô hấp phức hợp 2.5 Polymerase chain reaction (PCR) .10 iv 2.5.1 Định nghĩa phản ứng PCR .10 2.5.2 Các giai đoạn phản ứng PCR 10 2.5.3 Các thành phần phản ứng PCR 11 2.5.4 Đọc kết phản ứng PCR 11 2.5.5 Ứng dụng kỹ thuật PCR 12 2.5.6 Ưu điểm nhược điểm kỹ thuật PCR .12 2.6 Phản ứng Multiplex – PCR 13 2.7 Quy trình ly trích DNA .14 2.8 Định lượng DNA phương pháp đo mật độ quang 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .17 3.2 Vật liệu 17 3.2.1 Nguyên liệu 17 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 17 3.2.3 Hóa chất 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu .18 3.3.1 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi 19 3.3.2 Phản ứng s-PCR phát Haemophilus parasuis (HP) 19 3.3.3 Phản ứng s-PCR phát Porcine circovirus type (PCV2) 20 3.3.4 Phản ứng s-PCR phát Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) .20 3.3.5 Xây dựng quy trình multiplex PCR phát PCV2, APP, HP 21 3.3.5.1 Kiểm tra khả hình thành cấu trúc thứ cấp mồi 21 3.3.5.2 Đánh giá khả hoạt động mồi 21 3.3.5.3 Xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR 22 3.3.5.4 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng m-PCR .23 3.3.5.5 Xác định nồng độ DNA tối thiểu phát phản ứng m-PCR .24 3.3.5.6 Ứng dụng quy trình m-PCR tối ưu mẫu thực địa .24 3.3.5.7 Điện di sản phẩm PCR 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi 26 4.2 Kết thực phản ứng s-PCR phát HP .28 4.3 Kết thực phản ứng s-PCR phát PCV2 30 v 4.4 Kết thực phản ứng s-PCR phát APP .31 4.5 Kết xây dựng quy trình m-PCR phát đồng thời PCV2, APP, HP 32 4.5.1 Kết kiểm tra khả hình thành cấu trúc thứ cấp mồi .32 4.5.2 Kết đánh giá khả hoạt động mồi 33 4.5.3 Kết xác định nồng độ mồi tối ưu .34 4.5.4 Kết xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 35 4.5.5 Kết xác định nồng độ DNA tối thiểu phát phản ứng m-PCR .36 4.5.6 Kết áp dụng quy trình m-PCR mẫu bệnh 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận .39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO .40     vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APP Actinobacillus pleuropneumoniae DNA Deoxyribonucleoic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetate HP Haemophilus parasuis m-PCR Multiplex polymerase chain reaction NT Nghiệm thức OD Optical density PCR polymerase chain reaction PCV2 Porcine circovirus type PMWS Post – Weaning Wasting Syndrome SDS Sodium dodecyl sulfate s-PCR Single polymerase chain reaction TBE Tris borate EDTA TE Tris EDTA vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng phản ứng s-PCR m-PCR 18 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng s-PCR phát HP 19 Bảng 3.3 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát HP 19 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng s-PCR phát PCV2 20 Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát PCV2 20  Bảng 3.6 Thành phần phản ứng s-PCR phát APP 21 Bảng 3.7 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát APP 21 Bảng 3.8 Thành phần phản ứng m-PCR đánh giá khả hoạt động mồi 22 Bảng 3.9 Chu trình luân nhiệt m-PCR đánh giá khả hoạt động mồi 22 Bảng 3.10 Thành phần phản ứng m-PCR xác định nồng độ mồi 23 Bảng 3.11 Thành phần phản ứng m-PCR xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 23 Bảng 3.12 Chu trình luân nhiệt xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 24 Bảng 3.13 Nồng độ DNA với lần pha loãng 24 Bảng 4.1 Các đặc tính cặp mồi 26 Bảng 4.2 Các cấu trúc thứ cấp mang lượng tự thấp 27 Bảng 4.3 Các cấu trúc thứ cấp mồi mang lượng tự thấp 32 Bảng 4.4 Kết phản ứng m-PCR s-PCR mẫu thực địa 37 viii Kết khảo sát cấu trúc thứ cấp thể bảng 4.2 cho thấy cấu trúc thứ cấp kể có lượng tự lớn -9 kcal/mol nên không gây ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động cặp mồi phản ứng s-PCR Chỉ trừ cấu trúc hetero primer mồi HP – cysS có Delta G nhỏ -9 kcal/mol -11,01 kcal/mol Homo dimer PCV2R - ORF2 -9,28, liên kết cấu trúc không nằm Nu đầu 3’, cấu trúc thứ cấp không ảnh hưởng đến hoạt động cặp mồi Các cặp mồi kiểm tra độ đặc hiệu cho PCV2, APP, HP công cụ BLAST NCBI Chương trình dò tìm sở liệu ngân hàng gene để tìm tất gen có trình tự tương đồng với mồi Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi PCV2 F – ORF2 PCV2 R – ORF2, APP F - cpxA APP R cpxA, HP R – cysS HP F – cysS cho biết có trình tự có vị trí tương đồng hồn tồn với cặp mồi nằm vùng gen mã hóa cho ORF2, cpxA, cysS 4.2 Kết thực phản ứng s-PCR phát HP Kết mơ tả hình 4.1 cho thấy sản phẩm giếng cho sản phẩm rõ nét khơng có sản phẩm phụ, kích thước sản phẩm phù hợp với kích thước 821 bp HP HP (821bp) 500bp Hình 4.1 Kết s-PCR phát HP.(1) ladder, (2) (3) sản phẩn s-PCR đối chứng dương HP, (4) đối chứng âm 28 Đoạn trình tự nucleotide giải tiến hành so sánh mở rộng với toàn genome lồi khác cơng cụ BLAST, kết trình bày theo độ tương đồng giảm dần, 100 trình tự có độ tương đồng cao với đoạn gen cysS có 85 trình tự tương đồng 100% 15 trình tự tương đồng 99% Hình 4.2 Kết BLAST sản phẩm phản ứng s-PCR phát HP Kết BLAST thể hình 4.2 cho thấy có lồi mang gen tương đồng với trình tự cysS đề tài Haemophilus parasuis (HP) vị trí tương đồng nằm vùng gen mã hóa cysS HP Như kết luận trình tự mà phản ứng s-PCR phát HP khuếch đại với trình tự cysS hồn tồn đặc hiệu với HP 29 4.3 Kết thực phản ứng s-PCR phát PCV2 Kết mơ tả hình 4.3 cho thấy sản phẩm điên di giếng (2) cho band rõ nét, kích thước sản phẩm phù hợp với kích thước 264 bp PCV2 500bp PCV2 (264bp) Hình 4.3 Kết s-PCR phát PCV2.(1) ladder, (2) sản phẩn s-PCR đối chứng dương PCV2, (3) đối chứng âm Phương pháp xử lý kết giải trình tự PCV2 thực giống xử lý kết giải trình tự HP Kết giải trình tự sản phẩm PCR thu đoạn 254 bp, tín hiệu huỳnh quang máy thu bị nhiễu nên lấy đoạn trình tự đáng tin cậy dài 142 bp xác định phần mềm BioEdit để tiến hành so sánh với trình tự cơng bố GenBank, từ khẳng định trình tự ORF2 PCV2 Kết BLAST thể hình 4.4 cho biết có lồi mang gen tương đồng với trình tự thu được, trí tương đồng nằm gen mã hóa ORF2 PCV2 Như kết luận trình tự mà đề tài thu trình tự ORF2 đặc hiệu vói PCV2 30   Hình 4.4 Kết BLAST sản phẩm phản ứng s-PCR phát PCV2 4.4 Kết thực phản ứng s-PCR phát APP APP (498bp) 500bp Hình 4.5 Kết s-PCR APP (1) sản phẩn s-PCR đối chứng dương APP,(2) đối chứng âm, (3) ladder Kết mơ tả hình 4.5, cho thấy sản phẩm phản ứng PCR giếng rõ nét, khơng có sản phẩm phụ kích thước sản phẩm hoàn toàn phù hợp 498bp Sản phẩm phản ứng PCR phát APP chưa tiến hành giải trình tự để kiểm tra độ đặc hiệu sản phẩm APP 31 4.5 Kết xây dựng quy trình m-PCR phát đồng thời PCV2, APP, HP 4.5.1 Kết kiểm tra khả hình thành cấu trúc thứ cấp mồi Bảng 4.3 Các cấu trúc thứ cấp mồi mang lượng tự thấp Delta G Cấu trúc hetero dimer (kcal/mole) PCV2R - ORF2 PCV2F - ORF2   5' -6,01 CCGCACCTTCGGATATACTG :: |||| 3' TTCCGGTGTCGGGATTGGAT 5' CCGCACCTTCGGATATACTG : ||| 3' ATACCTGCTCCGAATGTTCCAAGAT   PCV2F - ORF2 APPF – cpxA   PCV2F - ORF2 APPR – cpxA PCV2F - ORF2 HPF – cysS  PCV2F - ORF2 HPR – cysS -4,64 5' -6,37 5' -3,61 5' TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT ||||| 3' ATACCTGCTCCGAATGTTCCAAGAT -3,14 5' TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT || : 3' CGTTTGTTAAGTGGTGTTAGGC -6,37 5' TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT :: |||| 3' GGCTTCGTCACCCTCTGT -6,61 5' TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT |||| 3' GTGATGAGGAAGGGTGGTGT -5,02 5' ATACCTGCTCCGAATGTTCCAAGAT ||| 3' CGGATTGTGGTGAATTGTTTGC PCV2R - ORF2 HPF – cysS PCV2R - ORF2 HPR – cysS APPF – cpxA APPR – cpxA APPF – cpxA HPF – cysS 5' -7,13 APPF – cpxA HPR – cysS -6,59 APPR – cpxA HPF – cysS HP – cysS R ATACCTGCTCCGAATGTTCCAAGAT : |||| 3' TGTCTCCCACTGCTTCGG 5' ATACCTGCTCCGAATGTTCCAAGAT : : |||| 3' TGTGGTGGGAAGGAGTAGTG 5' -6,37 APPR – cpxA HPR – cysS CCGCACCTTCGGATATACTG : ||||| :: 3' TGTGGTGGGAAGGAGTAGTG -7,95 PCV2R - ORF2 APPR – cpxA CCGCACCTTCGGATATACTG || : : 3' TGTCTCCCACTGCTTCGG 5' -8,19 PCV2R - ORF2 APPF – cpxA CCGCACCTTCGGATATACTG |||| : : :: 3' CGGATTGTGGTGAATTGTTTGC CGGATTGTGGTGAATTGTTTGC |||| : 3' GGCTTCGTCACCCTCTGT 5' -1,94 CGGATTGTGGTGAATTGTTTGC : || : 3' GTGATGAGGAAGGGTGGTGT 5' -11,01 TGTCTCCCACTGCTTCGG : |||||| : 3' GTGATGAGGAAGGGTGGTGT 32 HPF – cysS Trước tiến hành thiết kế thí nghiệm để xây dựng quy trình m – PCR phát đồng thời PCV2, APP, HP cần thực kiểm tra khả hình thành cấu trúc thứ cấp mồi (hetero dimer), khả bắt cặp mồi xi mồi ngược trình tự khác nhau, làm ảnh hưởng lớn đến kết phản ứng PCR Kết khảo sát thể sau Tất cấu trúc thứ cấp kể có lượng tự lớn -9 kcal/mole nên khơng gây ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động cặp mồi phản ứng m – PCR 4.5.2 Kết đánh giá khả hoạt động mồi 1  HP(821bp) 500bp APP(498bp) PCV2(264bp) Hình 4.6 Kết đánh giá khả hoạt động mồi (1) sản phẩm PCR sử dụng mồi PCV2-ORF2, (2) sản phẩm PCR sử dụng mồi APP-cpxA, (3) sản phẩm PCR sử dụng mồi HP-cysS , (4) sản phẩm m-PCR sử dụng mồi trên, (5) ladder Kết mơ tả hình 4.6 cho thấy giếng (1), (2), (3) kết phản ứng s – PCR phát PCV2, APP, HP cho kích thước sản phẩn phù hợp với trình tự đích Ở giếng (4) sản phẩm phản ứng m – PCR cho kết band với kích thước tương ứng với kích thước APP, HP Điều có nghĩa phản ứng m – PCR khơng có khuếch đại sản phẩm PCV2 33 Kết phản ứng s-PCR xuất sản phẩm có kích thước phù hợp với kích thước kiểm tra, cặp mồi hoạt động bình thường với chu trình luân nhiệt, khuếch đại trình tự mục tiêu Tuy nhiên với sản phẩm phản ứng m-PCR với cặp mồi khơng có sản phẩm mồi PCV2-ORF2 Giả thiết đặt mồi HP-cysS APP-cpxA hoạt động tốt có khả ức chế mồi PCV2-ORF2 Đây sở để điều chỉnh nồng độ mồi cho thí nghiệm tiếp sau khảo sát nồng độ mồi tối ưu cho PCV2 4.5.3 Kết xác định nồng độ mồi tối ưu Việc kết hợp nhiều mồi hỗn hợp phản ứng khác khuếch đại đồng thời nhiều locus phản ứng đòi hỏi tối ưu thơng số phản ứng Theo Yale (1997), phản ứng m-PCR có số sản phẩm PCR mạnh (band DNA đậm rõ) số sản phẩm PCR khác yếu (band DNA khơng rõ) nên tăng nồng độ mồi sản phẩm yếu giảm nồng độ mồi sản phẩm mạnh Vì sau xác định cặp mồi hoạt động tốt phản ứng s – PCR chu trình luân nhiệt này, để kiểm tra giả thiết từ thí nghiệm đánh giá khả hoạt động mồi, thí nghiệm thực với nồng độ mồi PCV2 tăng dần nghiệm thức 1,2,3 0,5; 0,75; µM, nồng độ mồi APP, HP thành phần phản ứng khác không đổi HP(821bp) APP(498bp) 500bp PCV2(264bp) Hình 4.7 Kết xác định nồng độ mồi tối ưu (1) ladder, (2) nghiệm thức 1,(3) nghiệm thức 2, (4) nghiệm thức 3, (5) nghiệm thức 4, (6) nghiệm thức 34 Kết mơ tả hình 4.7 thấy rằng, nghiệm thức cho kết tốt nhất, nghiệm thức 1,2,3 nồng độ mồi PCV2-ORF2 tăng dần, lượng sản phẩm PCV2 tăng dần Từ cho thấy giả thiết mồi HP-cysS APP-cpxA hoạt động tốt ức chế mồi PCV2-ORF2 điều kiện phản ứng Ở nghiệm thức 4, bố trí nồng độ mồi HP-cysS PCV2-ORF2 µM, nồng độ mồi APP-cpxA 0,5 µM kết khơng có sản phẩm mồi PCV2-ORF2, nghiệm thức bố trí nồng độ mồi APP-cpxA PCV2-ORF2 1µM, nồng độ mồi HP-cysS 0,5 µM có sản phẩm band sản phẩm PCV2-ORF2 mờ nghiệm thức Từ nghiệm thức suy mồi PCV2-ORF2 bị ức chế mồi HP-cysS Tuy nhiên, để thuận lợi cho trình thực phản ứng nghiệm thức chọn để thực thí nghiệm Từ kết thí nghiệm đánh giá khả hoạt động mồi xác định nồng độ mồi tối ưu cho thấy khả hoạt động mồi PCV2-ORF2 yếu hẳn mồi lại kết hợp lúc mồi phản ứng m-PCR, yếu tố ảnh hưởng đến khả ứng dụng quy trình mẫu thực địa 4.5.4 Kết xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu Nhiệt độ nóng chảy chung mồi từ 54oC đến 58oC, để xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nhiệt độ bắt cặp khảo sát 52oC, 54oC, 56oC, 58oC, 60oC, thành phần phản ứng giữ nguyên HP(821bp) APP(498bp) 500bp PCV2(264bp) Hình 4.8 Kết xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu nhiệt độ bắt cặp (1) 52oC, (2) 54 oC, (3) 56 oC, (4) 58 oC, (5) 60 o C , (6) ladder 35 Dựa vào kết tổng kết hình 4.8 cho thấy nhiệt độ bắt cặp nhiệt độ 54oC, 56oC, 58oC, 60oC cho sản phẩm rõ nét tương đương nhau, 52oC cho sản phẩm HP Như m-PCR sử dụng nhiệt độ bắt cặp từ 54oC đến 60oC, nhiệt độ bắt cặp tối ưu lựa chọn để thực thí nghiệm 56oC 4.5.5 Kết xác định nồng độ DNA tối thiểu phát phản ứng m-PCR Sau xây dựng xong quy trình m-PCR với chu trình luân nhiệt thành phần phản ứng tối ưu, áp dụng quy trình vào thí nghiệm xác định nồng độ DNA tối thiểu nồng độ DNA khác thể bảng 3.13 HP(821bp) 500b APP(498bp) PCV2(264bp) Hình 4.9 Kết xác định nồng độ DNA rối thiểu phát phản ứng m-PCR.(1) ladder, (2) nghiệm thức 1, (3) nghiệm thức 2, (4) nghiệm thức 3,(5) nghiệm thức 4, (6) nghiệm thức 5, (7) nghiệm thức 6.  Dựa theo kết hình 4.9, ngưỡng DNA khn mà phản ứng m-PCR phát HP ng/µl, PCV2 450 ng/µl APP với nồng độ DNA khn ng/µl phản ứng m-PCR phát Ở có chênh lệch lớn nồng độ giới hạn phát PCV2 với HP APP, mẫu DNA đối chứng PCV2 ly trích từ mẫu mơ nội quan heo nên mẫu DNA dùng làm đối chứng nên chứa lượng nhỏ DNA PCV2 tổng số DNA Và mẫu DNA đối chứng APP HP ly trích từ khuẩn lạc nên tồn DNA đối chứng DNA APP, HP 4.5.6 Kết áp dụng quy trình m-PCR mẫu bệnh Khi xác định thành phần phản ứng chu trình luân nhiệt phù hợp để phát đồng thời HP, APP, PCV2, tiến hành thực phản ứng m-PCR mẫu mô heo bệnh chạy s-PCR 36 10 11 821bp 498bp 264bp 500bp Hình 4.10 Kết áp dụng quy trình m-PCR mẫu thực địa (1) ladder, (2)đối chứng dương, (3) đến (12) mẫu thực địa.  Bảng 4.4 Kết phản ứng m-PCR s-PCR mẫu thực địa Kết s- Kết m- Kết s- Kết m- Kết s- Kết PCR PCR PCR PCR PCR m-PCR PCV2 PCV2 APP APP HP HP A-3 + - + + + + B-4 + - + + + + C-5 + - + + - - D-6 + + - - - - E-7 + - + + - - F-8 + - + + - - G-9 + - + + + + H-10 + - + + + + I-11 + - + + - - Mẫu X 1/9 8/8 4/4 Các mẫu từ A đến I tương ứng với giếng từ đến 11 hình 4.10, (+): dương tính, (-): âm tính, X: tỉ lệ mẫu dương tính với phản ứng m-PCR số mẫu dương tính với phản ứng s-PCR Dựa vào kết hình 4.10 bảng 4.4 cho thấy kết phản ứng m-PCR phát APP, HP hoàn toàn trùng hợp với kết phản ứng s-PCR phát APP, HP Tuy nhiên, kết m-PCR phát PCV2 dương tính với mẫu tổng số mẫu dương tính phản ứng s – PCR Kết phù hợp với giả thiết đặt thí nghiệm đánh giá khả hoạt động mồi xác định nồng độ mồi tối ưu, mồi PCV2 hoạt động yếu hẳn mồi lại, mẫu có hoạt 37 động mạnh mồi APP HP có khả ức chế hoạt động mồi PCV2 Từ yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng m-PCR, đề tài đề hướng nghiên cứu giải là: giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 54oC để phản ứng xảy đặc hiệu, tăng nồng độ mồi PCV2, hay thêm chất bổ trợ BSA (hoặc DMSO) Tuy nhiên giới hạn đề tài, giải vấn đề đòi hỏi nhiều thời gian kinh phí thực nên đề tài chưa thực việc   38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Xây dựng kiểm tra ba quy trình s-PCR phát PCV2, APP, HP hoàn toàn đặc hiệu Tối ưu thành phần phản ứng m-PCR phát hiên PCV2, APP, HP với nồng độ mồi HPF-cysS; HPR-cysS; APPF-cpxA; APPR-cpxA; PCV2F-ORF2; PCV2RORF2 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM;1 µM;1 µM Chu trình nhiệt phản ứng m-PCR sau: tiền biến tính 95 oC phút; biến tính 94 oC 30 giây; bắt cặp 56 oC phút; kéo dài 72 oC phút; giai đoạn kéo dài cuối 72 oC phút Quy trình m-PCR có tiềm ứng dụng cần nghiên cứu thêm để đưa vào thực nghiệm 5.2 Đề nghị Tiếp tục phát triển nghiên cứu hoàn thiện quy trình để sản xuất kít Multiplex PCR chuẩn đoán nhanh tác nhân HP, APP, PCV2 gây hô hấp phức hợp heo Nghiên cứu nồng độ dNTP, Taq polymerase, Mg2+ tối ưu cho phản ứng mPCR để phát HP, APP, PCV2 Mở rộng quy trình m-PCR với đối tượng khác thường gây bệnh hô hấp phức hợp heo porcine parvovirus (PPV), psaudorabies virus (PRV) 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Thị Hương Linh 2013 Khảo sát mô bệnh học phân lập số vi trùng gây bệnh phổi heo cai sữa bị bệnh hô hấp phức hợp số trại heo tỉnh phía Nam Khóa luận tốt nghiệp khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bùi Thị Kim Hằng 2010 Đánh giá dòng Porcine circovirus đàn heo số trại chăn nuôi kỹ thuật PCR Đề tài thạc sỹ khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm – Phương Pháp Ứng Dụng) Nhà xuất Giáo Dục Thành Phố Hồ Chí Minh Lê Kim Sơn 2004 Chẩn đoán Actinobacillus pleuropneumoniae heo thu thập sở giết mổ Nam Phong TP Hồ Chí Minh Khóa luận tốt nghiệp khoa Chăn Nuôi Thú y, trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Lê Thị Ngọc Bích 2011 Xây dựng quy trình chẩn đốn vius gây hội chứng còi cọc heo cai sữa - Porcine circovirustype II (PCV2) kỹ thuật lamp Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ngơ Phương Nghi 2003 Chẩn đoán Actinobacillus pleuropneumoniae dựa bệnh tích phổi, kỹ thuật elisa ni cấy phân lập Khóa luận tốt nghiệp khoa Chăn Ni Thú Y, trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học thú y Trường đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 66 - 67 Nguyễn Trung Ngoan 2005 Chẩn đoán Haemophilus parasuis từ phổi heo có bệnh tích nghi ngờ lò quay thuộc huyện Hóc mơn TP Hồ Chí Minh Khóa luận tốt nghiệp khoa Chăn Ni Thú Y, trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 10 Phạm Đức Hiền 2005 Chẩn đoán Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) heo thịt giết mổ sở chế biến thực phẩm Nam Phong TP HCM Khóa luận tốt nghiệp khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 11 Phạm Thanh Hồng 2012 Tạo dòng gen PRF2 mã hóa protein capsid Porcine circovirustype II (PCV2 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 12 Quách Thanh Sinh 2005 Chẩn đoán Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) heo thịt giết mổ sở chế biến thực phẩm Nam Phong Thành Phố Hồ Chí Minh Khóa luận tốt nghiệp khoa Chăn Ni Thú Y, trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 13 Trần Thanh Phong 1996 Bệnh truyền nhiễm heo Trường đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 40 Tài liệu nước 14 Allam G.M., McNeilly F., Kennedy S., Daft B., Clarke E.G., Ellis J.A., Haines D.M., Meehan B.M and Adair B.M., 1998 Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 10: 3-10 15 Dietze K., Pinto J., Wainwright S and Hamilton C 2011 Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virulence jumps and persistent circulation in Southeast Asia, Focus on :8 16 Hamel A.L., Lin L.L and Nayer G.P.Sl 1998 Nucleotide sequence of porcine circoviruses associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs Journal Virology, 72: 5262-5267 17 Harding J.C.S., Clark E.G and Strokappe J.H 1998 Post-weaning multisyscwasting syndrome (PMWS): preliminary epidemiology and clinical presentation Swine Health and Production, 6: 249-254 18 Henegariu O., Hirschmann P., Kilian K., Kirsch S., Lengauer C., Maiwald R., Mielke K and Vogt P 1994 Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis Andrologia, 26: 97-106 19 Jennifer A.S 2004 Detection and Identification of Actinobacillus pleuropneumoniae Serotypes 1, 2, and by Multiplex PCR Journal of Clinical Microbiology, 42: 4344-4348 20 Larochelle R., Magar R and D’Allaire S 2000 Genetic characterization and phylogenetic analysis of porcine circovirus type (PCV2) strains from cases presenting various clinical conditions Virus Research, 90: 101-112 21 Liu J., Chen I and Kwang J 2005 Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis Journal virology, 79: 8262-8274 22 Hricínová M., Holoda E., Mudronova D and Ondrasovicová S 2010 Multiplex PCR assay for Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Haemophilus parasuis in Lungs of Pigs from a Slaughterhouse Folia Microbiol, 55: 635-640 23 Mahe’ D., Blanchard P., Truong C., Arnauld C., Le Cann P., Cariolet R., Madec F., Albina E and Jestin A 2000 Differential recognition of ORF2 protein from type porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes Journal of General Virology, 81: 1815-1824 24 Meehan B.M., McNeilly F and McNair I., 2001 Isolation and charaterixation of porcine circivirus from cases of sow abortion and porcine dermatitis and nephropathy syndrome Archives Virology, 146: 835-842 25 Meehan B.M., McNeilly F., Todd D., Kennedy S., Jewhurst V.A., Ellis J.A., Hassard L.E., Clark E.G., Haines D.M and Allan G.M 1998 Characterization of novel circovirus and associated with wasting syndromes inpigs Journal of General virology, 79: 2171-2179 26 Nawagitgul P., Harms P.A., Morozzov I., Sorden S.D and Paul P.S 2002 Modified indirect PCV2 based and recombant capsid protein (ORF2) – based enzyme linkied ummunosorbent assays for detection of antibodies to PCV Clinical and diagnostic Lab Immunology American Society for Microbiology, 7: 33-40 41 27 Nawagitgul P., Morozzov I., Bolin S.R., Harms P.A., Sorden S.D and Paul P.S 2000 Open reading frame of porcine circovirus type encodes a major capsid protein Journal of General Virology 81: 2281-2287 28 Opriessnig T., Ramamoorthy S., Madson D.M., Patterson A.R., Pal N., Carman S., Meng X.J and Halbur P.G 2008 Differences in virulence among porcine circovirus type isolates are unrelated to cluster type 2s or2b and prior infection provides heterologous protection Journal of General Virology, 89: 2482-2491 29 West K.H., Bystrom J.M., Wojnarowicz C., Shantz N., Jacobson M., Allan G.M., Haimes D.M., Clark E.G., Krakowka S., McNeilly F., Konoby C., Martin K and Ellis J.A., 1999 Myocarditis and abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus Journal of Veterinary Diagnostic Investigati, 11: 530-532 Internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2481/ http://www.heo.com.vn/?x/=newsdetail&n=3248&/c/=49&/g/=1&/4/3/2010/philippinnhap-khau-1-500-tan-thit-heo philippine-imports-1-500-tons-of-pork.html http://www.heo.com.vn/?x/=newsdetail&n=3453&/c/=49&/g/=1&/17/5/2011/vuongquoc-anh tang-nhap-khau-thit-heo-tuoi-va-dong-lanh-united-kingdom-%E2%80%93increase-in-imports-of-fresh-and-frozen-pork.html   42 ... N ng Lâm th nh phố H Chí Minh Nghi n cứu nh m x y d ng quy tr nh Multiplex -PCR phát đ ng thời mầm b nh Porcine circovirus type (PCV2), Haemophilus parasuis (HP), Actinobacillus pleuropneumoniae... ph n ng s -PCR phát HP 19 B ng 3.3 Chu tr nh lu n nhiệt ph n ng s -PCR phát HP 19 B ng 3.4 Th nh ph n ph n ng s -PCR phát PCV2 20 B ng 3.5 Chu tr nh lu n nhiệt ph n ng s -PCR phát... thực đề tài X y d ng quy tr nh multiplex PCR phát Porcine circovirus type , Actinobacillus pleuropneumoniae , Haemophilus parasuis g y h h p phức h p heo 1.2 Y u cầu đề tài Tìm quy tr nh multiplex