PHÁT HIỆN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE (APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, 8 BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE (APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, BẰNG KỸ THUẬT PCR Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC NHƯ Ý Lớp: DH08DY Ngành: Dược Thú Y Niên khóa: 2008 – 2013 Tháng 08/2013 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỜ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y **************** PHẠM NGỌC NHƯ Ý PHÁT HIỆN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE (APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, BẰNG KỸ THUẬT PCR Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ thú y Giáo viên hướng dẫn TS NGUYỄN ĐÌNH QUÁT Tháng 08/2013 i XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực tập: Phạm Ngọc Như Ý Tên luận văn: “Phát Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) xác định týp 1, 2, 5, kỹ thuật PCR” Đã hoàn thành khóa luận theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến nhận xét, đóng góp Hội đồng chấm báo cáo tốt nghiệp ngày …/…/2013 Ngày tháng năm 2013 Giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Đình Quát ii LỜI CẢM TẠ Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cơng ơn sinh thành, dưỡng dục hy sinh Ba Mẹ tận tụy lo cho đến ngày hôm nay, người thân yêu thương, giúp đỡ động viên năm qua Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Đình Quát hết lòng giảng dạy, hướng dẫn, giúp đỡ, bảo tơi suốt thời gian thực tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Luôn ghi nhớ cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y tồn thể q thầy tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập vừa qua Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc anh chị Bệnh Xá Thú Y Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực tập tốt nghiệp Cảm ơn tập thể lớp DH08DY chung sức giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực tập tốt nghiệp iii TÓM TẮT Đề tài “Phát Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) xác định týp 1, 2, 5, kỹ thuật PCR”đã tiến hành phòng Phân Tử Ni Cấy Tế Bào thuộc Bệnh Xá Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh từ ngày 02/02/2013 đến 15/06/2013 Mục đích: xây dựng quy trình PCR phát APP týp 1, 2, 5, mẫu phổi heo Kết thu sau: Đã bước đầu xây dựng thành cơng qui trình PCR phát APP mẫu phổi heovới đoạn mồi xuôi: 5’-TAGAACCTTGTAAGCCTCGTCCATA-3’, đoạn mồi ngược: 5’-CGTTTGTTAAGTGGTGTTGAGC-3’ chương trình chạy máy luân nhiệt là: 95 oC phút (biến tính); 35 chu kỳ gồm 95 oC phút (biến tính), 56 oC 45 giây (bắt cặp), 72 oC 45 giây (kéo dài); 72 oC 10 phút (kéo dài cuối) Tỉ lệ mẫu dương tính với APP kỹ thuật PCR 32 % Không xác định týp 1, 2, 5, mẫu dương tính với APP iv MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA i PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm sinh lí hơ hấp heo 2.1.1 Các đường dẫn khí 2.1.2 Cấu tạo phổi 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh đường hô hấp 2.1.3.1 Yếu tố không truyền nhiễm 2.1.3.2 Yếu tố truyền nhiễm 2.2 Bệnh Actinobacillus pleuropneumoniae 2.2.1 Khái niệm 2.2.2 Lịch sử 2.2.3 Căn bệnh học 2.2.4 Độc lực 2.2.5 Dịch tễ v 2.2.6 Cách sinh bệnh 10 2.2.7 Triệu chứng 11 2.2.8 Bệnh tích 12 2.2.8.1 Bệnh tích đại thể 12 2.2.8.2 Bệnh tích vi thể 13 2.2.9 Chẩn đoán 13 2.2.10 Điều trị 13 2.2.11 Phòng bệnh 14 2.2.11.1 Vệ sinh phòng bệnh 14 2.2.11.2 Phòng bệnh vaccine 15 2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 17 2.3.1 Kỹ thuật PCR 17 2.3.2 Phương pháp ly trích DNA 17 2.3.3 Định tính định lượng DNA 18 2.3.4 Thành phần phản ứng PCR 19 2.3.5 Primer 19 2.3.6 Nguyên tắc phương pháp PCR 20 2.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 20 2.3.8 Các hạn chế PCR 22 2.3.9 Giá trị sử dụng PCR 23 2.3.10 Đọc kết 23 2.4 Những cơng trình nghiên cứu có liên quan 24 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Thời gian địa điểm 26 3.1.1 Thời gian 26 3.1.2 Địa điểm thực 26 3.2 Đối tượng nghiên cứu 26 3.3 Nội dung nghiên cứu 26 3.4 Phương pháp nghiên cứu 26 vi 3.4.1 Thiết bị, dụng cụ vật liệu thí nghiệm 26 3.4.2 Thu thập mẫu phổi có bệnh tích viêm màng phổi 27 3.4.3 Qui trình xét nghiệm APP kỹ thuật PCR 28 3.4.3.1 Đoạn mồi 28 3.4.3.2 Qui trình tách chiết DNA 28 3.4.3.3 Qui trình thực PCR 29 3.4.3.4 Phương pháp chạy điện di 29 3.4.4 Qui trình định týp 1, 2, 5, APP mẫu dương tính kỹ thuật PCR 30 3.4.4.1 Đoạn mồi 30 3.4.4.2 Qui trình thực PCR 30 3.4.4.3 Phương pháp chạy điện di 31 3.5 Cơng thức tính 31 Chương 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Xây dựng qui trình xét nghiệm APP kỹ thuật PCR 32 4.2 Xác định tỉ lệ dương tính với APP mẫu phổi thu thập sở giết mổ Nam Phong 35 4.3 Xác định týp 1, 2, 5, APP mẫu dương tính 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APP : Actinobacillus pleuropneumoniae CAMP : Christae Ackins And Much Petersen dATP : deoxyadenosine triphosphate dCTP : deoxycytosine triphosphate dGTP : deoxyguanosine triphosphate dTTP : deoxythimine triphosphate dNTPs : deoxynucleoside triphosphate ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay LPS : Lipopolysaccharide NAD : Nicotinamide Adenin Dinucleotide OD : Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction RTX : Repeats-in-toxin SDS : Sodium Dodecyl Sulphate SPF : Specific Pathogen Free Tm : Melting temperature viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi cho phản ứng PCR xét nghiệm APP Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi cho phản ứng PCR định týp 1, 2, 5, APP Bảng 3.3Chương trình chạy PCR định týp 1, 2, 5, APP Bảng 4.1 Tỉ lệ dương tính với APP kỹ thuật PCR ix Chuyển gel vào bể chạy điện di có dung dịch đệm TBE 0,5X Nhỏ µl (lược nhỏ) hay 10 µl (lược lớn) sản phẩm PCR vào giếng, hiệu chỉnh thời gian điện chạy điện di Chuyển gel vào bàn đèn UV đọc kết chụp hình 3.4.4 Qui trình định týp 1, 2, 5, APP mẫu dương tính kỹ thuật PCR 3.4.4.1 Đoạn mồi Đoạn mồi dùng để chạy phản ứng PCR định týp APP tham khảo từ Schuchert ctv (2004) (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi cho phản ứng PCR định týp 1, 2, 5, APP Týp Đoạn Trình tự mồi Kích Kích thước thước sản phẩm mồi (bp) PCR (bp) Xuôi 5’-AGTGGCTGGATGAGACGAGAC-3’ 21 Ngược 5’-TAGTTTGTTATGGTATTTCTGTA-3’ 23 Xuôi 5’-CGCAGCCGGACAAAAACAAATACACG-3’ 26 1.603 1.725 Ngược 5’-CACCCCATGAATCGACTGATTGCCAT-3’ 26 Xuôi 5’-TTTATCACTATCACCGTCCACACCT-3’ 25 Ngược 5’-CATTCGGGTCTTGTGGCTACTAA-3’ 23 Xuôi 5’-AACGGCTTTTGAACAACTTTATTTATTT-3’ 28 Ngược 5’-TTCATTCCTAAACTCCGTATTGTCA-3’ 25 1.100 977 3.4.4.2 Qui trình thực PCR Cho vào ống eppendorf thành phần sau : - Nuclease-Free Water µl - Green God Taq Master Mix, 2X 10 µl - Mồi xi 0,5 µl - Mồi ngược 0,5 µl 30 - DNA template mẫu dương tính µl Tổng thể tích ống eppendorf cho mẫu 20 µl Chương trình chạy máy ln nhiệt : Chương trình chạy PCR định týp 1, 2, 5, APP tham khảo từ Schuchert ctv (2004) Bảng 3.3Chương trình chạy PCR định týp 1, 2, 5, APP Các týp APP Bước 95 oC : phút 95 oC : phút 95 oC : phút 95 oC : phút Bước (33 chu kỳ) (35 chu kỳ) (31 chu kỳ) (29 chu kỳ) 95 oC : phút 95 oC : phút 95 oC : phút 94 oC : 30 giây 56 oC : phút 60 oC : phút 54 oC : phút 60 oC : 30 giây 72 oC : phút 72 oC : phút 72 oC : phút 72 oC : 40 giây Bước 72 oC : 10 phút 72 oC : 10 phút 72 oC : 10 phút 72 oC : 10 phút 3.4.4.3 Phương pháp chạy điện di Tương tự mục 3.4.3.4 3.5 Cơng thức tính Tỉ lệ dương tính (%) = (Số mẫu dương tính/Tổng số mẫu xét nghiệm)*100 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng qui trình xét nghiệm APP kỹ thuật PCR Cặp đoạn mồi dùng để chạy phản ứng PCR xét nghiệm APP tham khảo từ Schuchert ctv (2004) Tuy nhiên, báo đăng tạp chí Journal of Clinical Microbiology, Schuchert ctv khơng tiết lộ chương trình chạy PCR Do đó, chúng tơi phải tự xây dựng thử nghiệm Dựa vào chương trình chạy PCR định týp APP 1, 2, 5, nhóm tác giả (Bảng 3.3), chúng tơi xây dựng chương trình chạy PCR thử nghiệm bao gồm bước: biến tính khởi đầu với 95 oC phút để đảm bảo sợi DNA mồi làm nóng; 35 chu kỳ, chu bước biến tính với 95 oC phút để đảm bảo mẫu DNA mồi phân tách hoàn tồn dạng sợi đơn, bước bắt cặp với 60oC 45 giây bước kéo dài với 72oC 45 giây; cuối bước kéo dài với 72oC 10 phút Mẫu thử nghiệm gồm vi khuẩn APP gốc phân lập định danh mẫu phổi nghi APP Kết thử nghiệm qui trình thể qua Hình 4.1 Kết Hình 4.1 cho thấy mẫu vi khuẩn APP đối chứng dương cho băng rõ ràng băng vị trí khoảng 489 bp mong đợi Tuy nhiên, mẫu phổi nghi ngờ APP thử nghiệm cho băng mờ vị trí khoảng 489 bp tương tự mẫu đối chứng dương số băng vị trí khác Kết nhận định đoạn mồi tương đối tốt chương trình chạy PCR tương đối ổn, chưa tối ưu nên với mẫu DNA vi khuẩn APP cho kết tốt, với mẫu DNA tách chiết từ mô phổi không nên cho kết nhiều băng 32 L ĐC M 489 bp 100 bp 50 bp 25 bp Hình 4.1 Kết PCR xét nghiệm APP với nhiệt độ ủ bắt cặp 60 oC Giếng (L): thang DNA chuẩn 50 bp, (ĐC): mẫu vi khuẩn APP đối chứng dương, (M): mẫu phổi nghi ngờ APP thử nghiệm qui trình Theo kinh nghiệm nhiều chuyên gia nhà thực hành sinh học phân tử, số giải pháp cho việc giải vấn đề tham khảo như: tăng/giảm nhiệt độ thời gian bước bắt cặp, tăng thời gian bước kéo dài, giảm nồng độ DNA polymerase, tối ưu hóa nồng độ Mg2+, giảm nồng độ đoạn mồi, thiết kế cặp đoạn mồi mới…Đoạn mồi nhận định tương đối tốt, giảm nồng độ DNA polymerase hay tối ưu hóa nồng độ Mg2+ tương đối khó thực chúng tơi sử dụng kít phản ứng PCR thương mại Hiện tại, nồng độ đoạn mồi sử dụng 20 pmol, thường qui Do đó, giải pháp tăng/giảm nhiệt độ thời gian bước bắt cặp chọn để tiếp tục thử nghiệm thực dễ dàng Nếu giải pháp khơng giải vấn đề, chúng tơi tiếp tục thay đổi thời gian bước kéo dài Vì nhiệt độ bước bắt cặp sử dụng cao (60 oC), nên chọn giảm nhiệt độ bước bắt cặp xuống 56oC, bước khác giữ nguyên Kết thay đổi biểu qua Hình 4.2 Kết từ Hình 4.2 cho thấy mẫu đối chứng dương mẫu thử nghiệm cho băng rõ ràng, mẫu thử nghiệm không xuất băng phụ khác Kết giống với kết Schuchert ctv (2004) thử 33 nghiệm cặp đoạn mồi cho 12 serotyp APP khác nhau, cho kết băng Vì mẫu đối chứng dương mẫu canh khuẩn APP sau nuôi cấy phân lập, nên số lượng vi khuẩn APP nhiều mẫu mô phổi bệnh phẩm; đó, rõ ràng thấy băng mẫu đối chứng dương dày mẫu bệnh phẩm thử nghiệm thể tích DNA template đưa vào phản ứng L ĐC M 489 bp 100 bp 50 bp 25 bp Hình 4.2 Kết PCR xét nghiệm APP với nhiệt độ ủ bắt cặp 56 oC Giếng (L): thang DNA chuẩn 50 bp, (ĐC): mẫu vi khuẩn APP đối chứng dương, (M): mẫu phổi nghi ngờ APP thử nghiệm qui trình Với thay đổi nhiệt độ bước bắt cặp, kết thu thỏa kỳ vọng, chưa biết thay đổi tốt chưa ? Chúng không tiếp tục nghiên cứu thêm thay đổi khác để tìm kiếm tối ưu hóa chương trình chạy PCR cho APP tốn chi phí, thời gian phải thử nghiệm thêm loại mô, dịch khác Đây điểm tồn nghiên cứu Nhìn chung, qui trình phát APP phương pháp PCR bước đầu xây dựng hình thành với TAGAACCTTGTAAGCCTCGTCCATA-3’, đoạn mồi xi: 5’- đoạn mồi ngược: 5’- CGTTTGTTAAGTGGTGTTGAGC-3’ chương trình chạy PCR là: 95 oC 34 phút (biến tính); 35 chu kỳ gồm 95 oC phút (biến tính), 56 oC 45 giây (bắt cặp), 72 oC 45 giây (kéo dài); 72 oC 10 phút (kéo dài cuối) 4.2 Xác định tỉ lệ dương tính với APP mẫu phổi thu thập sở giết mổ Nam Phong 50 mẫu phổi heo có bệnh tích viêm màng phổi thu thập sở giết mổ Nam Phong - TP.Hồ Chí Minh để xét nghiệm chẩn đốn bệnh APP kỹ thuật PCR theo qui trình thử nghiệm Kết tỉ lệ dương tính với APP trình bày qua Bảng 4.1 Bảng 4.1 Tỉ lệ dương tính với APP kỹ thuật PCR Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính Tỉ lệ dương tính 50 16 32% Từ kết Bảng 4.1 cho thấy với bệnh tích viêm màng phổi điển hình (đã chọn lọc tương đối kỹ càng) mà thông thường lâm sàng nhà kỹ thuật thú y bác sĩ thú y thường đưa kết luận APP, kết xét nghiệm kỹ thuật PCR cho 32% dương tính Như vậy, điều đồng nghĩa với bệnh tích viêm màng phổi heo chưa khẳng định bệnh APP Việc phù hợp với nghiên cứu Jirawattanapong ctv (2010) Hà Lan, kiểm tra tương quan bệnh tích viêm màng phổi, viêm phổi – màng phổi, viêm phổi rỉ dịch, với việc nuôi cấy phân lập để xác định tác nhân gây bệnh viêm màng phổi heo giết thịt lò mổ, kết nhóm tác giả cho thấy khơng có liên quan đặc hiệu tác nhân gây bệnh phát với biểu bệnh tích đại thể, đặc biệt bệnh tích viêm màng phổi Nhóm tác giả nhận định nhiều tác nhân gây bệnh kết hợp với yếu tố môi trường để gây bệnh tích viêm màng phổi Tuy nhiên, nghiên cứu Fablet ctv (2012) ngược lại, nhóm tác giả khảo sát tương quan bệnh tích đại thể tỉ lệ dương tính với M hyopneumoniae, P.multocida, A pleuropneumoniae, H parasuis S.suis kỹ thuật PCR 3.731 heo giết mổ từ 125 đàn khác Pháp cho thấy bệnh tích viêm màng phổi có liên quan 35 chặt với tỉ lệ dương tính A.pleuropneumoniae cao Như vậy, việc khẳng định bệnh tích viêm màng phổi heo có liên quan chặt đến APP hay không cần phải kiểm chứng qua nhiều nghiên cứu thêm L 489 bp 100 bp 50 bp 25 bp Hình 4.3Kết PCR xét nghiệm APP số mẫu đại diện Giếng (L): thang DNA chuẩn 50 bp, (1-6): mẫu phổi nghi ngờ APP, giếng 6: dương tính, giếng – 5: âm tính Cũng khảo sát APP sở giết mổ Nam Phong, kết Quách Thanh Sinh (2005) cho thấy có 3,33% mẫu phân lập vi khuẩn tổng sổ 60 mẫu có bệnh tích nghi ngờ APP, thấp nhiều so với kết dương tính với APP phương pháp PCR chúng tơi (32%) Có thể độ nhạy phương pháp PCR cao so với phương pháp nuôi cấy phân lập thực tiễn sử dụng kháng sinh điều trị bệnh tràn lan trại chăn nuôi làm cho việc nuôi cấy phân lập vi khuẩn khó khăn hơn, nên tỉ lệ phát APP phương pháp nuôi cấy phân lập thấp Vấn đề phù hợp với nghiên cứu Hricinova ctv (2010) Slovania, phát triển phương pháp mutiplex PCR để xét nghiệm đồng thời tác nhân gây bệnh quan trọng heo A.pleuropneumoniae, P.multocida H.parasuis với sử dụng phương pháp nuôi cấy phân lậpvi khuẩn để so sánh 36 mẫu phổi heo thu thập từ lò mổ; kết cho thấy khác biệt phương pháp PCR (dương tính 20,5%) với ni cấy phân lập(dương tính 14,2%) việc phát APP 4.3 Xác định týp 1, 2, 5, APP mẫu dương tính 16 mẫu dương tính với APP kỹ thuật PCR tiếp tục định týp kỹ thuật PCR theo qui trình tham khảo từ Schuchert ctv (2004) (mục 3.4.4) Kết thử nghiệm cho thấy tất 16 mẫu băng mong đợi (Bảng 3.2) không xuất băng (Hình 4.4, đại diện cho tồn kết chạy PCR 16 mẫu dương tính với APP trên) ĐC L 10 11 12 100 bp 50 bp 25 bp Hình 4.4 Kết PCR đại diện cho xét nghiệm APP định týp 1, 2, 5, âm tính Giếng (L): thang DNA chuẩn 50 bp, (ĐC): mẫu vi khuẩn APP đối chứng dương, (112): mẫu DNA tách chiết từ phổi dương tính với APP Với kết làm chúng tơi khó nhận định Có thể đoạn mồi không chuẩn ? Tuy nhiên giả thuyết không thuyết phục Schuchert ctv thực thành công cặp đoạn mồi nghiên cứu đăng tạp chí khoa học quốc tế có uy tín Có thể mẫu APP dương tính khơng thuộc týp 1, 2, 5, 8? Giả thuyết xảy ra, nhiên cần phải kiểm chứng với số lượng mẫu dương tính với APP nhiều phải sử dụng thêm phản ứng huyết học để đối chiếu, nghiên cứu Lê Văn Dương ctv (2012) 37 Bắc Giang xác định đa số chủng APP thuộc týp (72,92%) chủng 5a (20,83%), 5b (6,25%) phản ứng kết tủa khuếch tán thạch ; hay nghiên cứu Quách Thanh Sinh (2005) mẫu phổi thu thập sở giết mổ Nam Phong xác định 100% chủng APP thuộc biovar (bao gồm týp 2, 3, 4, 6, 12) phản ứng ELISA Vấn đề cốt lõi chỗ chúng tơi khơng có mẫu vi khuẩn APP thuộc týp 1, 2, 5, chuẩn làm đối chứng dương để loại suy số yếu tố lỗi thao tác, đoạn mồi không đặc hiệu, mẫu âm tính, kít khơng phù hợp … Đây điều tồn nghiên cứu 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã bước đầu xây dựng thành cơng qui trình phát APP heo phương pháp PCR đoạn với TAGAACCTTGTAAGCCTCGTCCATA-3’, đoạn mồi mồi xi: 5’- ngược: 5’- CGTTTGTTAAGTGGTGTTGAGC-3’ chu trình nhiệt là: 95 oC phút (biến tính); 35 chu kỳ gồm 95 oC phút (biến tính), 56 oC 45 giây (bắt cặp), 72 oC 45 giây (kéo dài); 72 oC 10 phút (kéo dài cuối) Tỉ lệ mẫu dương tính với APP kỹ thuật PCR 32 % cho thấy mức độ tương quan APP bệnh tích viêm màng phổi điển hình khơng cao Số lượng mẫu dương tính với APP xác định âm tính (0 %) với týp 1, 2, 5, kỹ thuật PCR 5.2 Đề nghị Cần tiếp tục tiến hành thử nghiệm đối chứng dương týp 1, 2, 5, phản ứng huyết học để đối chiếu nhằm chuẩn hóa quy trình xác định týp 1, 2, 5, APP Cần mở rộng nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều để xác định mối tương quan APP bệnh tích viêm màng phổi heo 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN TIẾNG VIỆT Phan Quang Bá, 2007 Cơ thể học gia súc Tủ sách Trường Đại Học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử NXB Nông Nghiệp Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử NXB Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Thu Hằng, Đỗ Ngọc Thúy, Cù Hữu Phú, Trương Văn Dung, Nguyễn Xuân Huyên Vũ Ngọc Quý, 2009 Kết thiết lập phản ứng PCR để giám định nhanh vi khuẩn Actinobacilluspleuropneumoniae phân lập từ lợn số tỉnh phía Bắc Việt Nam Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, XVI (3): 45 – 49 Nguyễn Thị Thu Hằng, Đỗ Ngọc Thúy, Cù Hữu Phú, Trương Văn Dung, Âu Xuân Tuấn Lê Thị Minh Hằng, 2009 Ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định độc tố (APX) có vi khuẩn Actinobacilluspleuropneumoniae phân lập từ lợn bệnh số tỉnh phía Bắc Việt Nam Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, XVI (4): 51 – 57 Nguyễn Quới Minh Hiền, 2003 Bước đầu chẩn đoán Actinobacillus pleuropneumoniae heo Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Phạm Minh Hiền, 2005 Chẩn đoán Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) heo thịt giết mổ sở chế biến thực phẩm Nam Phong TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Văn Hiệp, 2011 Khảo sát hiệu vaccine Coglapix® việc phòng bệnh viêm phổi màng phổi doActinobacilluspleuropneumoniae heo thịt Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Đặng Huy Hoàng, 2011 So sánh hiệu phòng bệnh vi trùngActinobacilluspleuropneumoniae tiêm phòng vaccine Coglapix® sử dụng kháng sinh Pulmotil®G200 premix heo thịt Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 10 Lâm Thị Thu Hương, 2005 Mô phôi gia súc NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh, 126 – 132 40 11 Ngơ Phương Nghi, 2003 Chẩn đốn Actinobacilluspleuropneumoniae bệnh tích phổi, kĩ thuật ELISA nuôi cấy phân lập Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y Đại Học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 12 Nguyễn Phú Phong, 2010 Hiệu phòng bệnh viêm phổi – màng phổi doActinobacilluspleuropneumoniae tiêm vaccine Coglapix® heo thịt Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 13 Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo Tủ sách Trường Đại Học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, 176 trang 14 Quách Thanh Sinh, 2005 Chẩn đoán Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) heo thịt giết mổ sở chế biến thực phẩm Nam Phong TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 15 Phạm Hùng Vân, 2009 PCR real-time PCR vấn đền thường gặp NXB Y học, TP Hồ Chí Minh, 192 trang 16 Yoshikazu Iritani, Nguyễn Thị Bích Thủy, Nguyễn Thúy Quyên Cù Hữu Phú, 2005 Tinh chế kháng nguyên đặc hiệu serotype Actinobacillus pleuropneumoniae số đặc tính chúng Khoa học Kỹ thuật Thú y, XII (1): 12 – 18 PHẦN TIẾNG NƯỚC NGOÀI 17 Belanger M., Duberuil D., Harel J., Giraard C., and Jacques M., 1990 Role of lipopolysaccharides in adherence of Actinobacillus pleuropneumoniae to porcine tracheal rings Infect Immun 58: 3523 – 3530 18 Chiers K., Overbeke I.V., Donné E., Baele M., Ducatalle R., Baera T.D., and Haesebrouck F., 2001 Detection of Actinobacilluspleuropneumoniae in cultures from nasal and tonsillar swabs of pigs by a PCR assay based on the nucleotide sequence of a dsbE-like gene Vet Microbiol 83: 147 – 159 19 Christensen G., J M., 1992 Respiratory system In Disease of Swine 7th edition (A.D Leman, E.S Barbara, L.M William, S D’Allaire, J.T David) Iowa State Uni.Press/Ames, Iowa, USA P 138 – 162 20 Fablet C., Marois C., Dorenlor V., Eono F., Eveno E., Jolly J P., Le Devendec L., Kobisch M., Madec F andRose N., 2012 Bacterial pathogens associated with lung lesions in slaughter pigs from 125 herds.Res Vet Sci., 93(2): 62730 41 21 Fenwick B.W and Osburn B.L., 1986 Immune respones to the lipopolysaccharides and capsular polysaccharides of Haemophiluspleuropneumoniae in comvalescent and immunized Infect Immun (54): 575 – 582 22 Fenwick B.W and Henry S., 1994 Porcine pleuropneumoniae JAVMA 204: 1334 – 1340 23 Fittipaldi N., Broes A., Harel J., Kobisch M., and Gottschalk M., 2003 Evaluation and field validation of PCR tests for detection of Actinobacilluspleuropneumoniaein subclinically infected pigs, J of Clin.Microbiol 41(11): 5085 – 5093 24 Frey J., 1995 Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and the RTX toxins Trends in Micro 3: 257 – 261 25 Hricrinova M., Holoda E., Mudronova D and Ondrasovicova S., 2010 Multiplex PCR assay for detection of Actinobacilluspleuropneumoniae, Pasteurellamultocida and Haemophilusparasuis in lungs of pigs from a slaughterhouse Folia Microbiol (Praha) 55(6): 635-40 26 Inzana T.J and Mathison B., 1987 Type-specificity and immunogenicity of the capsular polymer of Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae Infect Immun 55: 1580 – 1587 27 Inzana T.J., Iritani B., Gogolewski R.P and Anderson P., 1988 Virulence properties and protective efficacy of the capsular polymer of Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae serotype Infect Immun 56: 1880 – 1889 28 Inzana T.J., 1991 Virulence properties of Actinobacillus pleuropneumoniae Microb Path 11: 305 – 316 29 Jacobsen M.J and Nielsen J.P., 1995 Development and evaluation of a selective and indicate medium for isolation of Actinobacilluspleuropneumoniae from tonsils Vet Microbiol 47: 191 – 197 30 Jensen A.E and Bertram T.A., 1986 Morphological and biochemical comparison of virulent isolates of Haemophiluspleuropneumoniae serotype Infect Immun 51: 419 – 424 42 31 Jirawattanapong P., Stockhofe-Zurwieden N., van Leengoed L., Wisselink H., Raymakers R., Cruijsen T., van der Peet-Schwering C., Nielen M andvan Nes A., 2010 Pleuritis in slaughter pigs: relations between lung lesions and bacteriology in 10 herds with high pleuritis Res Vet Sci., 88(1): 11-5 32 Lo T., M., 1997 Detection and indentification of Actinobacilluspleuropneumoniae serotype by multiplex polymerase chain reaction, MSc Thesis, Virginia Polytechnic Institute and State University, pp 92 33 Lopez A., 1995 Special Veterinary Pathology (Eds: William W Carlton and M Donald McGavin) Mosby – Year Book, Inc P 116 – 174 34 Macinnes J.I., and Rosendal S., 1988 Prevetion and control of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae infection in swine : A review Can Vet J 29: 572 – 573 35 Macinnes J.I and Smart N.L., 1993 Pathogenesis of Bacterial infections in animals Iowa States University Press, Ames P 188 – 197 36 Mireya de la Garza Amaya Dr., 2004 Department of Cell Biology CinvestavIPN DPI&F’s website www Dpi Qld Gov au 37 Nicolet J., Paroz P., and Bruggmann S., 1980 Tween 20 soluble proteins of MH as antigen for an enzyme linked immino-sorbent assay, Res Vet Sci 29: 305 38 Nicolet J., 1992 Actinobacillus pleuropneumoniae In Disease of swine (Eds: A.D Leman, B.E Straw, W.L Mengeling, S D’Allaire and D.J Taylor) Iowa State University Press, Ames 401 – 408 39 Ohba T., Shibahara T., Kobayashi H., Takashima A., Nagoshi M., Araki M., Takizawa K andKubo M., 2009 Prevalence of granulomatous pleuropneumonia associated with Actinobacilluspleuropneumoniae serotype in slaughter pigs.J Vet Med Sci., 71(8): 1089-92 40 Perry M.B., Altman E., Brisson J.R., Beynon L.M., and Richards J.C., 1990 Structural characteristics of antigenic capsular polysaccharides and lipopolysaccharides involved in the serological classification of Actinobacillus pleuropneumoniae straina Serodiag Immun In Infect Dis 4: 299 – 308 43 41 Pohl S., Bertschinger H.U., Frederiksen W., and Mannheim W, 1983 Tranfer of Haemophiluspleuropneumoniae and pasteurella haemolytica-like organism causing porcine necrotic pleuropneumoniae to the genus Actinobacillus (Actinobacillus pleuropneumoniae comb Nov.) on the basis of phenotypic and deoxyribonucleic acid relatedness Int J Syst Bacteriol 33: 510 – 514 42 Robert J., 2003 Respiratory Disease of Swine, VMF 964 43 Rosendal S., and Mitchell W.R., Weber M., Wilson M.R., Zaman M.R., 1980 Haemophiluspleuropneumoniae lung lesions induced by sonicated bacteria and sterile culture supernatant Proc Int Pig Vet Soc 5: 211 44 Schaller A., Kuhn R., Kuhnert P., Nicolet J., Anderson T.J., MacInnes J.I., Segers R.P and Frey J., 1999 Characterization of ApxIVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae Microbiology, 145: 2105 – 2116 45 Schuchert J A., Inzana T J., Angen O andJessing S., 2004 Detection and identification of Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes 1, 2, and by multiplex PCR J Clin Microbiol., 42(9): 4344-8 46 Taylor D.J., 1999 Actinobacillus pleuropneumoniae Diseases of Swine, 8th edition Iowa State University Press, Ames, Iowa U.S P 343 – 350 44 ... tài: Phát Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) xác định týp 1, 2, 5, kỹ thuật PCR 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xây dựng quy trình phát APP mẫu phổi heo giết thịt xác định týp 1, 2, 5,. .. phản ứng PCR xét nghiệm APP Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi cho phản ứng PCR định týp 1, 2, 5, APP Bảng 3.3Chương trình chạy PCR định týp 1, 2, 5, APP Bảng 4.1 Tỉ lệ dương tính với APP kỹ thuật PCR ix... KHOA CHĂN NI THÚ Y **************** PHẠM NGỌC NHƯ Ý PHÁT HIỆN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE (APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, BẰNG KỸ THUẬT PCR Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Bác sỹ thú