Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thu nhận levan từ (bacillus subtilis) và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1 14 ngày tuổi

i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn TS Vũ Kim Dung Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, có nguồn gốc rõ ràng trích dẫn đầy đủ theo quy định Cơng trình chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Người cam đoan Lê Anh Tú ii LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập rèn luyện Trường Đại học Lâm nghiệp, biết ơn kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo nhiệt tình hướng dẫn, giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện đề tài nghiên cứu Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Kim Dung - Bộ môn Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp, người thầy trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ trình thực đề tài Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn sinh viên phịng Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo phận Feed Technology - Công ty Cổ phần Chăn nuôi CP Việt Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội tạo điều kiện cho tham gia học tập, nghiên cứu năm học giúp đỡ việc thực phần ứng dụng đề tài nghiên cứu Một lần xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tuy nhiên điều kiện lực thân hạn chế, luận văn chắn khơng tránh khỏi thiếu sót Kính mong nhận đóng góp ý kiến thầy giáo, bạn bè đồng nghiệp để luận văn tơi hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Học viên Lê Anh Tú iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH .vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan levan 1.1.1 Giới thiệu levan .3 1.1.2 Tính chất 1.1.3 Nguồn thu nhận levan 1.1.4 Một số mơi trường ni cấy kích thích B subtilis sinh levan 1.1.5 Ứng dụng levan 10 1.2 Thức ăn chăn nuôi gà cảnh .12 1.2.1 Giới thiệu số giống gà cảnh 12 1.2.2 Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn - 14 ngày tuổi 15 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu .22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Vật liệu nghiên cứu 22 2.3.1 Vi sinh vật 22 2.3.2 Môi trường .22 2.3.3 Hóa chất 23 2.3.4 Thiết bị dụng cụ 23 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Ảnh hưởng số yếu tố đến trình sinh tổng hợp levan (Jothi cs, 2019) .23 iv 2.4.2 Phương pháp tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna cs, 2013) 24 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan 25 2.4.4 Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan (giai đoạn 1-14 ngày tuổi) 26 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp levan 31 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ sucrose 31 3.1.2 Ảnh hưởng pH ban đầu .32 3.1.3 Ảnh hưởng nguồn nito .33 3.1.4 Ảnh hưởng nồng độ nito 34 3.1.5 Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp 36 3.1.6 Ảnh hưởng tốc độ lắc 36 3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp levan .38 3.3 Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan .41 3.3.1 Ảnh hưởng loại dung môi đến hàm lượng levan thu 41 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi đến hàm lượng levan thu 43 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu .44 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu 45 3.4 Nghiên cứu quy trình sản xuất cám gà cảnh từ chế phẩm levan (giai đoạn 14 ngày tuổi) 46 3.4.1 Xác định tỷ lệ levan phối trộn 46 3.4.2 Nghiên cứu xác định nhiệt độ ép viên 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ B subtilis Bacillus subtilis Ca Canxi CP Cruide Protein CS Cộng Fat Fat FOS Fructo - oligosaccharides Fib Fiber GE Gross Energy GP Glucose trypton M Moisture MTCB Môi trường P Photpho QC&Lab Quality Control & Laboratory TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TGA Trypton Glucose Agar vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độ kết dính số polymer tự nhiên Bảng 2.1 Bảng xác định biến ảnh hưởng, mức khoảng thay đổi biến số .25 Bảng 2.2 Thành phần nguyên liệu công thức cám gà giai đoạn - 14 ngày tuổi 26 Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng sau bổ sung levan theo tỷ lệ 27 Bảng 2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ ép viên đến chất lượng cám viên 27 Bảng 2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ ép viên đến tiêu vi sinh 28 Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hàm lượng levan thu điều kiện nuôi cấy khác 39 Bảng 3.2 Kết phân tích phương sai mơ hình tối ưu phần mềm DX11 .41 Bảng 3.3 Kết phân tích dinh dưỡng cám cơng thức 47 Bảng 3.4 Kết phân tích thành phần dinh dưỡng 48 bổ sung chế phẩm levan 48 Bảng 3.5 Kết kiểm tra cảm quan bổ sung chế phẩm levan công thức thức ăn chăn nuôi 49 Bảng 3.6 Kết phân tích vi sinh bổ sung chế phẩm levan thức ăn chăn nuôi 49 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học levan Hình 1.2 Sản phẩm dưỡng da mặt với Proteolea® Hình 1.3 Sản phẩm dưỡng thể với Slimexir® Hình 1.4 Các sản phẩm levan thị trường (www.realbio.com) Hình 1.5 Gà rừng đỏ miền Trung Tây Nguyên 13 Hình 1.6 Giống gà Quý phi 13 Hình 1.7 Giống gà lai cá 14 Hình 1.8 Giống gà lông xù .14 Hình 1.9 Giống gà Serama .15 Hình 1.10 Quy trình cơng nghệ sản xuất thức ăn chăn ni gà .16 Hình 1.11 Quy trình sản xuất thức ăn chăn ni gà giai đoạn - 14 ngày tuổi 18 Hình 1.12 Lấy mẫu nguyên liệu đầu vào 18 Hình 1.13 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu máy DS2500F 18 Hình 1.14.Kiểm tra nguyên liệu trước lưu silo 19 Hình 1.15 Hệ thống bồn chứa nguyên liệu 19 Hình 1.16 Máy móc hệ thống sản xuất 20 Hình 1.17 Hình ảnh bao cám gà .21 Hình 1.18 Hình ảnh cám gà 21 Hình 3.1 Kết ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả sinh tổng hợp levan 31 Hình 3.2 Canh trường sau nuôi cấy chủng B subtilis với nồng độ sucrose khác 31 Hình 3.3 Kết ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp levan 32 Hình 3.4 Canh trường sau ni cấy chủng B subtilis với nồng độ pH khác 33 Hình 3.5 Kết ảnh hưởng nguồn nito đến khả sinh tổng hợp levan 34 Hình 3.6 Canh trường sau ni cấy chủng B subtilis với nguồn nito khác 34 Hình 3.7 Kết ảnh hưởng nồng độ nito đến khả sinh tổng hợp levan 35 viii Hình 3.8 Canh trường sau ni cấy chủng B subtilis với nồng độ nito khác 35 Hình 3.9 Kết ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp đến khả sinh tổng hợp levan 36 Hình 3.10 Kết ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp levan 37 Hình 3.11 Canh trường sau nuôi cấy chủng B subtilis với tốc độ lắc khác 37 Hình 3.12 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu sinh tổng hợp levan 40 Hình 3.13 Ảnh hưởng yếu tố đến sinh tổng hợp levan .40 Hình 3.14 Kết ảnh hưởng loại dung môi đến hàm lượng levan thu 42 Hình 3.15 Ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dịch chiết levan dung mơi đến hàm lượng levan thu .43 Hình 3.16 Canh trường sau nuôi cấy chủng B subtilis với tỷ lệ thể tích levan dung mơi khác .43 Hình 3.17 Kết ảnh hưởng nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu 44 Hình 3.18 Kết ảnh hưởng thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, nguyên liệu sinh học an toàn dần sử dụng để thay cho nguyên liệu hóa học Chúng sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác sống Các nguyên liệu có khả đáp ứng nhu cầu cần thiết đảm bảo an toàn mục đích sử dụng Vì thế, nhà khoa học tiến hành nghiên cứu thu nhận hợp chất có nhiều tính vượt trội từ vi sinh vật phục vụ cho đời sống người Levan hợp chất polymer sinh học tổng hợp từ vi khuẩn mơi trường có thành phần sucrose Đây polymer fructose tạo liên kết β - (2 - 6) fructo - furanosidic, có mặt nhiều loại thực vật sản phẩm từ vi sinh vật Levan cung cấp nguyên liệu cho hàng loạt ngành công nghiệp nhiều lĩnh vực khác như: y dược, thực phẩm mỹ phẩm Ứng dụng tiềm levan để làm chất nhũ hóa dùng sữa, chất ổn định, chất làm đặc đặc biệt khả phục hồi sức khỏe có giá trị liệu pháp điều trị ung thư Levan polymer fructose sản xuất thực vật, nấm men, nấm vi khuẩn (Jang cs, 2001) Levan tổng hợp từ nguồn vi sinh vật như: Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim cs, 2000), Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima cs, 1998) B subtilis (Shin cs, 2005) Trong chủng B subtilis Natto có khả sinh tổng hợp levan cao với hiệu suất 40,4 g/l môi trường có chứa 200g/l sucrose (Shin cs, 2005) Nhưng nhìn chung, hiệu suất thu levan từ nguồn vi sinh vật chưa cao Vì vậy, nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm nguồn thu nhận có khả thu hàm lượng levan cao Ở Việt Nam, phong trào chơi gà cảnh ngày phát triển Một gà cảnh có trọng lượng 500 g lượng thức ăn tiêu tốn 1/3 gà công nghiệp, giá trị đem lại cao gấp vài chục lần, chí hàng trăm lần gà công nghiệp Việc bổ sung dinh dưỡng chế độ ăn cho gà cảnh hay chế phẩm sinh học phần ăn, đặc biệt giai đoạn - 14 ngày tuổi giai đoạn sức đề kháng kém, nhạy cảm dễ tăng tỷ lệ chết Bổ sung dinh dưỡng giai đoạn cách hợp lý phù hợp với phát triển gà giúp cân dinh dưỡng, tăng sức đề kháng, tăng lợi khuẩn cho đường ruột cân đối ngoại hình phục vụ cho mục đích sử dụng Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn cho gà cảnh giai đoạn - 14 ngày tuổi” 56 30 Jaecho, P N Hee, Y S Jae & L T Ho (2001), Molecular and enzymatic characterization of levan fructotransferase from Microbacterium sp, AL - 210 J Biotechnol, 91 49 - 61 31 Jang, K B Song, C H Kim, B H Chung, S A Kang, U H Chun, R W Choue & S K Rhee (2001), Comparison of characteristics of levan produced by diferent preparations of levansucrase from Zymomonas mobilis, Biotechnology Letter, 23, 339 - 344 32 Jongbloed A.W., Kemme P.A (1990), Effect of pelleting mixed feeds on phytase activity and the apparent absorbability of phosphorus and calcium in pigs Anim, Feed Sci Technol, 28: 233-242 33 Jothi S.C.A.C., Bhuvaneshwari V., Kartik K.S., Krishna P.M., Saravanan R.S., Ponnusami V (2019), Studies on solvent precipitation of levan synthesized using Bacillus subtilis MTCC 441, Heliyon, 5(10): 02678 https://doi.org/10.1016/ j.heliyon.2019.e02414 34 Justin Barone, Maria Medynets (2007), Thermally processed levan polymer(https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S014486170700046X) 35 Kang & I W Cottrell (1979), Polysaccharides In H J Peppler and D Perlman (ed), Microbial technology, 2nd ed Academic Press, Inc, New York, 418 - 481 36 Kang, (2009), "Levan: Applications and Perspectives", Microbial Production of Biopolymers and Polymer Precursors Caister Academic Press, ISBN 978-1904455-36-3 37 Khadiga Abou-taleb, Mohamed Abdel-Monem, Mohamed H Yassin and Amal A Draz (2015), Production, Purification and Characterization of Levan Polymer from Bacillus lentus V8 Strain 38 Ki-Hyo J., Ki-Bang S., Chul H.K., Bong H.C., Soon A.K., Uck-Han C., Ryo W.C., Sang-Ki R (2001), Comparison of characteristics of levan produced by diferent preparations of levansucrase from Zymomonas mobilis Biotechnol Lett, 23: 339 344 39 Kim, J W Seo, K B Song, K H Jang, B H Jung, S K Rhee (2000), Molecular cloning of a gene encoding the thermoactive levansucrase from Rahnella aquatilis and its growth phasedependent expression in Escherichia coli, J Biotechnol, 81, 63 - 72 57 40 Kunst, N Ogasawara, I Moszer, A M Albertini, G Alloni, V Azevedo, M G Bertero, P Bessières, A Bolotin, S Borchert, R Borriss, L Boursier… (1997), The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis, Nature, 390, 249 - 256 41 Lensing M., Klis J., Yoon I., Moore D.T (2012), Efficacy of Saccharomyces cerevisiae fermentation product on intestinal health and productivity of coccidianchallenged laying hens, Poult Sci, 91:1590–7 42 Li J., Kim H (2013), Effects of Levan-type fructan supplementation on growth performance, digestibility, blood profile, fecal microbiota, and immune responses after lipopolysaccharide challenge in growing pigs, Journal of animal science, 91(11):5336-43 doi: 10.2527/jas.2013-6665 43 Manel Z., Taroub B., Sana M., Kaouther Z., Ferid M., Mokhtar H., Claire B.H (2018), Evaluation of the efficiency of ethanol precipitation and ultrafiltration on the purification and characteristics of exopolysaccharides produced by three lactic acid bacteria, BioMed Research International, doi: 10.1155/2018/1896240 44 Mardo K., Visnapuu T., Gromkova M., Aasamets A., Viigand K., Vija H., Alamäe T (2014), High- throughput assay of levansucrase variants in search of feasible catalysts for the synthesis of fructooligosaccharides and levan, Molecules, 19: 84348455; doi:10.3390/molecules19068434 45 Mrudula, Kokila (2009), Production of Thermostable a-amylase by Bacillus cereus MK in solid state fermentation: Partial purification and characterization of the enzyme 46 Ni, D., Xu, W., Bai, Y., Zhang, W., Zhang, T., Mu, W (2018), Biosynthesis of levan from sucrose using a thermostable levansucrase from Lactobacillus reuteri LTH5448, Int J Biol Macromol 113, 29–37 47 Olano, G R E Gibson & R A Rastall (2002), Comp - arison of the in vitro bitidogenic properties of pectin and pectin – oligosaccharides, Journal of Applied Microbiology, 93, 505 – 5111 48 Oliveira, R S Silva, J B Buzato & M A P C Celligol (2007), Study of levan production by Zymomonas mobilis using regional low - cost carbohydrate sources, Biochem Eng J, 37, 177 - 183 58 49 Oner, LazaroHernandez, JoanCombie (2016), Review of Levan polysaccharide: From a century of past experiences to future prospects, 34, 827 – 844 50 Oseguera, L Guereca L & A Lopez - Munguia (1996), Properties of levansucrase from Bacillus circulans, Appl Microbiol Biotechnol, 45, 465 – 471 51 Patricia Bittencourt da Silva, Dionisio Borsato and Maria Antonia Pedrine Colabone Celligoi (2014), Optimization of High Production of Fructooligosaccharides by Sucrose Fermentation of Bacillus subtilis Natto CCT 7712 American Journal of Food Technology, 9: 144-150 52 Poli A., Kazak H., Gürleyendağ B., Tommonaro G., Pieretti G., Toksoy Ö.E (2009), High level synthesis of levan by a novel Halomonas species growing on defined media, Carbohydr Polym 78:651–657 53 Queiroz Santos, Vidiany Aparecida; Garcia Cruz, Crispin Humberto (2016), Ethanol and Levan production by sequential bath using Zymomonas mobilis immobilized on alginate and chitosan beads Acta Scientiarum Technology 38(3):263 June 2016, DOI: 10.4025/ actascitechnol V 38i3.27646 54 Santos, F Melo, W J M Paiva, D Borsato, M Dasilva & M Celligoi (2013), Characterization and optimization of levan production by Bacillus subtilis (Natto), Romanian Biotechnological Letters, 18, 8413 - 8422 55 Selim, Seval, Sirma, Taner (2013), Levan production by Zymomonas mobilis inbatchand continous fermantation system 56 Shin, Y T Yu, C J Shienh & C Y Hsien (2005), Selective Production and Characterization of Levan by Bacillus subtilis (natto) Takahashi J Agric, Food Chem, 53 (21), 8211 - 8215 57 Szwengiel, M Czarnecka, H Roszyk & Z Czarnecki (2004), Levan production by Bacillus subtilis DSM 347 strain, Food Sicence and Technology, 2, 7-12 58 Tamer I.M Ragab, Roslinda Abd Malek, Islam A Elsehemy, Mohamed M.S Farag, Bassem M Salama, Mohamed A Abd EL-Baseer, Amira M Gamal-Eldeen, Hesham A El Enshasy, and Mona A Esawy (2018), Scaling up of levan yield in Bacillus subtilis M and cytotoxicity study on levan and its derivatives, Journal of Bioscience and Bioengineering, DOI: 10.1016/j.jbiosc.2018.09.008 59 59 Tajima, N Uenishi, M Fujiwara, T Erata & M Munekata (1998), The production of a new water - soluble polysaccharide by Acetobacterxylinum NCL 1005 and its structural analysis by NMR spectroscopy, Carbohydr Res, 305, 117 -122 60 Ward N.E, Ayres L.A.E., Moritz J.S (2020), The effect of varying steam conditioning temperature and time on pellet manufacture variables, true amino acid digestibility, and feed enzyme recovery, J Appl Poult Res 29:328-338 61 Xin J.L., Yong M.K., Jae H.P., Dong H.B., Charles M.N., In H.K (2017), Effects of levan-type fructan on growth performance, nutrient digestibility, diarrhoea scores, faecal shedding of total lactic acid bacteria and Coliform bacteria, and faecal gas emission in weaning pig, J Sci Food Agric, 98 (4): 1539-1544.doi: 10.1002/ jsfa.8625 62 Yamamoto Y., Takahashi Y., Kawano M., Iizuka M., Saeki S., Yamaguchi H (1999), In vitro digestibility and fermentability of levan and its hypocholesterolemic effects in rat, J Nutr Blochem, 10:13-18 63 Yan Wang et al (2017), Effect of probiotics on the meat flavour and gut microbiota of chicken 64 Yitbarek A, Echeverry H, Brady J, et al, Innate immune response to yeast derived carbohydrates in broiler chickens fed or-ganic diets and challenged with Clostridium perfringens Poult Sci 2012;91:1105-12 Tài liệu website 65 http://biomedia.vn/review/tua-adn-ethanol-va-isopropanol.html 66 http:// hoisvcvn.org.vn 67 http://giadinh.net 68 http://realbio.co PHỤ LỤC PHỤ LỤC Đặc điểm hình dạng tế bào B subtilis sau 24 hoạt hóa mơi trường lỏng sử dụng làm tiêu nhuộm Gram quan sát kính hiển vi Kết quan sát kính hiển vi cho thấy chủng có dạng hình que ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ thành chuỗi ngắn, bắt màu tím nên vi khuẩn Gram dương Kết ghi lại hình 4.1 Hình 1.1 Hình dạng tế bào chủng B subtilis Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc B subtilis sau 24 hoạt hóa mơi trường L1 nhân giống môi trường L2 pha loãng từ nồng độ 10-1 đến 10-12 Cấy trải dịch pha lỗng lên đĩa pettri chứa mơi trường TGA Nuôi tủ ấm nhiệt độ 37OC 24 Khi khuẩn lạc phát triển tới mức phân biệt mắt thường quan sát thấy nồng độ pha lỗng 10-10 cho khuẩn lạc có số lượng thích hợp, hình thái rõ nét Tính kết quả: Từ số khuẩn lạc ta suy số lượng tế bào (CFU) có ml dung dịch gốc: Trong đó: a = Số lượng khuẩn lạc trung bình đĩa nồng độ pha loãng; K = (10-) độ pha loãng dịch cấy trải đĩa; V = Thể tích dịch pha lỗng cấy trải đĩa Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng B.subtilis Kết thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trường vi khuẩn B subtilis mơi trường L2, nhằm mục đích nghiên cứu định tính vi sinh vật theo thời gian xác định thời điểm tế bào đạt cực từ tiếp giống vào môi trường lên men phù hợp nhằm chuyển hóa sucrose thành levan cho đạt hàm lượng cao Bảng 3.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng B subtilis STT Nồng độ pha loãng 10-7 10-8 10-9 10-10 Mật độ vi sinh vật OD600nm Từ kết thu xây dựng đường cong sinh trường vi khuẩn B Subtilis hình 4.2 Khảo sát hàm lượng levan thu Tiến hành xây dựng đường chuẩn fructose làm sở cho xác định hàm lượng levan Kết thu biểu diễn bảng 4.2 Bảng 4.1 Khảo sát hàm lượng levan thu Ống nghiệm Hóa chất 10 (ml) từ ống gốc 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Thể tích DNS 1 1 1 1 1 OD540(nm) 0,097 0,278 0,396 0,498 0,667 0,834 0,935 1,050 1,161 1,274 Thể tích Fructose 10 mg/ml) Thể tích nước cất (ml) Nồng độ fructose (mg/ml) Hình 4.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng vi khuẩn B subtilis Dựa sở phản ứng tạo màu đường khử fructose với thuốc thử DNS (3,5-Dinitrolicylic acid) Cường độ màu hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định Ta có phương tình đường tuyến tính nồng độ đường khử fructose (g/l) với mật độ quang: OD540 nm y = 0,1301x – 0,0005 Từ phương trình đồ thị đường chuẩn ta tính nồng độ đường khử fructose dung dịch Hàm lượng đường khử fructose: y = 0,1301x – 0,0005 => x = Hàm lượng levan: L = F x 0,9 = =F x 0,9 Phương pháp nuôi cấy bảo quản vi khuẩn Chủng B subtilis hoạt hóa mơi trường L1, ni lắc 120 vịng/phút 37oC 24 Bảo quản giống B subtilis ngăn mát tủ lạnh cấy truyền định kỳ lên môi trường sau - tháng 5.1 Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc Từ việc xác định mật độ tế bào dịch giống, qua ta đánh giá khách quan khả sinh tổng hợp levan chủng vi sinh vật nhờ vào ban đầu cấp thể tích giống mật độ tế bào có dịch giống Các bước tiến hành: - Pha loãng mẫu: Để tách rời tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc mạnh dịch pha loãng; - Cấy trải dịch pha lỗng lên đĩa pettri chứa mơi trường TGA; - Nuôi tủ ấm nhiệt độ 37oC 24 Khi khuẩn lạc phát triển tới mức phân biệt mắt thường tiến hành đếm số khuẩn lạc; - Đếm số khuân lạc mọc đĩa thạch: đếm số lượng khuẩn lạc cách úp sấp đĩa peptri, mặt đáy phía ngồi đĩa, dùng bút viết kính đánh dấu khuẩn lạc đếm Nếu số lượng khuẩn lạc nhiều, dùng bút chia nhỏ đĩa thành phần nhỏ Đếm số khuẩn lạc phần sau cộng lại - Tính kết quả: Theo lý thuyết, khuẩn lạc hình thành từ tế bào riêng rẽ nhiên, thực tế khó xác định khuẩn lạc hình thành từ hay nhiều tế bào Vì vậy, để tính số tế bào đơn vị thể tích người ta thường dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc đơn vị thể tích” (CFU Colony Forming Unit) Như vậy, từ số khuẩn lạc đếm ta suy số lượng tế bào (CFU) có ml dịch ni cấy cách tương đối: CFU/ml = a.1/K.1/V Trong đó: a: Là số lượng khuẩn lạc trung bình đĩa độ pha loãng; K: Độ pha loãng dịch cấy trải đĩa; V: Thể tích dịch pha loãng cấy trải đĩa 5.2 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng chủng B subtilis Chủng B sutilis hoạt hóa mơi trường L1 Ni lắc 120 vịng/phút 37OC 24 Vi sinh vật sau hoạt hóa tiếp giống vào môi trường L2, ủ 37OC, pH lắc 120 vòng phút Tại mốc thời gian khác nhau, lấy dịch nuôi đem đo OD bước sóng 600 nm cấy trải để đếm khuẩn lạc Dịch nuôi cấy mốc thời gian khác nhau, pha lỗng nồng độ pha lỗng thích hợp, sau lấy dịch pha lỗng cấy trải lên đĩa pettri chứa mơi trường L1 có bổ sung thạch Nuôi tủ ấm nhiệt độ 37OC 24 Tiến hành đếm số khuẩn lạc Theo dõi số lượng vi sinh vật theo thời gian kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng B.subtilis Thời gian Mật độ B subtilis (CFU/ml) 12 16 20 24 28 32 36 48 60 72