Khảo sát tác động điều hòa miễn dịch in vitro của cây sậy phragmites australis (cav ), poaceae trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ) BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN QUỐC VIỆT KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÂY SẬY PHRAGMITES AUSTRALIS (CAV.), POACEAE TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ) BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN QUỐC VIỆT KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÂY SẬY PHRAGMITES AUSTRALIS (CAV.), POACEAE TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI NGÀNH: DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 8720205 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ MINH THUẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Minh Thuận Số liệu đề tài thu thập sử dụng cách trung thực Kết nội dung trình bày luận văn không chép luận văn chưa trình bày hay cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Trần Quốc Việt KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA MIỄN DỊCH IN VITRO CỦA CÂY SẬY PHRAGMITES AUSTRALIS (CAV.), POACEAE TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI Trần Quốc Việt Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Thuận Tổng quan: Ở Việt Nam, Sậy Phragmites australis (Cav.) sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa bệnh viêm dày, viêm phế quản mạn tính, viêm thận cấp, phát ban Tuy nhiên, nghiên cứu tác dụng dược lý trên hệ miễn dịch Sậy hạn chế Do đề tài tiến hành nhằm khảo sát tác động cao chiết toàn phần cao phân đoạn Sậy tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi người (PBMCs) Phương pháp nghiên cứu: Đánh giá tác động cao chiết toàn phần ethanol 96% Sậy cao phân đoạn (n-hexan, chloroform, ethyl acetat, nước) tỉ lệ sống PBMCs sau 24 giờ, 48 giờ, 72 với thuốc thử MTT Khảo sát tác động cao chiết lên khả sản xuất IL-1β IL-2 tế bào PBMCs sau 48 nuôi cấy phương pháp ELISA Khảo sát thay đổi tỉ lệ tế bào T CD4+ T CD8+ tác động phân đoạn chloroform n-hexan Sậy 48 phương pháp đo dịng chảy tế bào Kết quả: Sau 24 ni cấy, cao toàn phần ức chế tăng sinh PBMCs với IC50 21,39 ppm Phân đoạn n-hexan chloroform ức chế tăng sinh PBMCs sau 48 với IC50 > 200 ppm Sự sản xuất IL-1β PBMCs bị ức chế tác động cao chiết Sậy Cao toàn phần, phân đoạn n-hexan chloroform ức chế PBMCs tiết IL-2 với giá trị IC50 102,2 ppm ; 0,9 ppm ; 36,14 ppm Tỉ lệ tế bào T CD4+ CD8+ bị thay đổi tác động phân đoạn chloroform n-hexan sau 48 nuôi cấy Kết luận: Các cao chiết Sậy ức chế tăng sinh chức PBMCs in vitro Từ khóa: Cây Sậy, PBMCs, IL-1β, IL-2 , điều hòa miễn dịch IN VITRO IMMUNOMODULATATORY ACTIVITY OF PHRAGMITES AUSTRALIS (CAV.), POACEAE ON HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS Tran Quoc Viet Supervisor: PhD Nguyen Thi Minh Thuan Background: In Viet Nam, Phragmites australis (Cav.) is used empirically to treat gastritis, chronic bronchitis, acute nephritis and rash However, studies on the pharmacological effects on the immunomodulatory effects of Phragmites australis are limited The objective of this study was to investigate the in vitro immunomodulatory activity of Phragmites australis extracts on cell proliferation, cytokine production (IL-1β, IL-2) of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and the change in CD4+/CD8+ ratio of T cell Materials and methods: The effects on PBMCs proliferation of 96% ethanol crude extract and its fractions (n-hexan, chloroform, ethyl acetat) after 24, 48, 72 hours were evaluated using MTT reagent IL-1β and IL-2 concentrations secreted by PBMCs under effects of Phragmites australis extracts for 48 hours were quantified by ELISA method Percentage of human CD4+ and CD8+ T cell after 48 hours exposure to chloroform and n–hexan fractions of Phragmites australis was analysed by flow cytometry Results: After 24 hours, crude extract inhibited PBMCs proliferation with IC50 at 21,39 ppm N–hexan and chloroform fractions inhibited PBMCs proliferation after 48 hours with IC50 > 200 ppm Phragmites australis extracts inhibited IL-1β production after 48 hours Crude extract, n–hexan and chloroform fractions inhibited IL-2 production secreted by PBMCs after 48 hours of incubation The ratio of CD4+/CD8+ T-cells was changed after 48 hours exposure to chloroform and n–hexan fractions Conclusion: Phragmites australis extracts have effects on the proliferation and function of PBMCs Keywords: Phragmites australis, PBMCs, IL-1β, IL-2 , immunomodulatory MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Sậy .3 1.1.1 Vị trí phân loại thực vật 1.1.2 Đặc điểm thực vật .3 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Bộ phận thường dùng 1.1.5 Tính vị, tác dụng 1.1.6 Tình hình nghiên cứu Việt Nam giới 1.2 Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMCs) 1.2.1 Thành phần 1.2.2 Vai trò tế bào PBMCs hệ miễn dịch lympho T .6 1.2.3 Cytokin .9 1.2.4 Ứng dụng dòng tế bào PBMCs nghiên cứu in vitro 12 1.3 Các phương pháp đánh giá độ sống tế bào 14 1.3.1 Đánh giá độ sống tế bào phương pháp nhuộm màu 14 1.3.2 Đánh giá độ sống tế bào phương pháp đo màu 15 1.3.3 Đánh giá độ sống tế bào phương pháp đo huỳnh quang 17 1.3.4 Đánh giá độ sống tế bào phương pháp phát quang 18 1.4 Kỹ thuật định lượng interleukin 19 1.4.1 Phương pháp miễn dịch hấp phụ gắn men (ELISA) 19 1.4.2 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio Immuno Assay – RIA) 19 1.4.3 Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (Electrochemiluminescence immunoassay – ECLIA) .19 1.5 Kỹ thuật định lượng CD4, CD8 20 1.5.1 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20 1.5.2 Phương pháp đếm tế bào dòng chảy 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu .21 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, thuốc thử 21 2.2.1 Thiết bị .21 2.2.2 Dụng cụ 22 2.2.3 Hóa chất 22 2.3 Dược liệu 23 2.3.1 Xác định độ ẩm, độ tro toàn phần dược liệu 23 2.3.2 Điều chế cao chiết toàn phần Sậy 24 2.3.3 Điều chế cao phân đoạn .25 2.3.4 Sơ định tính thành phần hóa học cao chiết dược liệu 26 2.3.5 Chuẩn bị mẫu cao chiết theo thang nồng độ 26 2.4 Chiết PBMCs từ máu ngoại vi người .26 2.4.1 Nguyên tắc 26 2.4.2 Cách tiến hành 27 2.5 Khảo sát độ sống tế bào PBMCs tác động in vitro cao chiết Sậy phương pháp MTT 28 2.5.1 Nguyên tắc 28 2.5.2 Cách tiến hành 28 2.6 Đánh giá tác động cao chiết toàn phần cao phân đoạn lên sản xuất IL-1β in vitro PBMCs .29 2.6.1 Nguyên tắc 29 2.6.2 Tiến hành 29 2.7 Đánh giá tác động cao chiết toàn phần cao phân đoạn lên sản xuất IL-2 in vitro PBMCs .30 2.7.1 Nguyên tắc 30 2.7.2 Tiến hành 30 .i 2.8 Khảo sát tác động cao chiết Sậy tế bào lympho T .31 2.8.1 Nguyên tắc 31 2.8.2 Tiến hành 31 2.9 Xử lý thống kê 32 2.10 Đạo đức nghiên cứu 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 33 3.1 Dược liệu 33 3.1.1 Thử độ tinh khiết dược liệu 33 3.2 Khảo sát độ sống tế bào PBMCs tác động in vitro cao chiết Sậy phương pháp MTT 37 3.2.1 Kết sau 24 nuôi cấy .37 3.2.2 Kết sau 48 nuôi cấy .40 3.2.3 Kết sau 72 nuôi cấy .43 3.3 Khảo sát tác động cao toàn phần cao phân đoạn sản xuất IL 1β tế bào PBMCs 45 3.3.1 Xây dựng đường tuyến tính nồng độ IL-1β .45 3.3.2 Kết tác động cao toàn phần cao phân đoạn sản xuất IL-1β 46 3.4 Khảo sát tác động cao toàn phần cao phân đoạn sản xuất IL-2 tế bào PBMCs 48 3.4.1 Xây dựng đường tuyến tính nồng độ IL-2 .48 3.4.2 Kết tác động cao toàn phần cao phân đoạn sản xuất IL-2 tế bào PBMCs 48 3.5 Khảo sát tác động cao toàn phần cao phân đoạn Sậy lên tế bào lympho T CD4+ CD8+ .50 CHƯƠNG BÀN LUẬN .52 4.1 Chuẩn bị cao chiết Sậy cho thử nghiệm 52 4.2 Khảo sát độ sống tế bào PBMCs tác động in vitro cao chiết Sậy phương pháp MTT 53 4.3 Tác động cao chiết Sậy lên sản xuất IL-1β PBMCs 55 4.4 Tác động cao chiết Sậy lên sản xuất IL-2 PBMCs 56 4.5 Đánh giá thay đổi tỉ lệ CD4+ CD8+ quần thể lympho T tác động cao chiết Sậy 57 4.6 Hạn chế đề tài 57 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Kiến nghị .58 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Vai trò số cytokin trình miễn dịch 11 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.3 Hóa chất, thuốc thử sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.4 Độ ẩm dược liệu .33 Bảng 3.5 Độ tro dược liệu 33 Bảng 3.6 Độ ẩm độ tro toàn phần cao toàn phần 34 Bảng 3.7 Hiệu suất chiết cao toàn phần 34 Bảng 3.8 Hiệu suất chiết cao phân đoạn 35 Bảng 3.9 Kết sơ định tính hóa thực vật cao toàn phần cao phân đoạn dược liệu Sậy 36 Bảng 3.10 Tóm tắt kết tác động cao chiết Sậy lên tỉ lệ sống PBMCs sau 24 37 Bảng 3.11 Tóm tắt kết tác động cao chiết Sậy lên tỉ lệ sống PBMCs sau 48 40 Bảng 3.12 Tóm tắt kết tác động cao chiết Sậy lên tỉ lệ sống PBMCs sau 72 43 Bảng 3.13 Kết định lượng IL-1β mẫu tế bào nuôi cấy sau 48 .46 Bảng 3.14 Kết định lượng IL-2 mẫu tế bào nuôi cấy sau 48 49 Bảng 3.15 Sự thay đổi tỉ lệ tế bào lympho T CD4+ CD8+ sau 48 .51 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 59 - Nghiên cứu thay đổi biểu gen, protein, mARN tế bào miễn dịch để hiểu rõ chế tác động dược liệu tăng sinh in vitro PBMCs - Tiến hành nghiên cứu đánh giá tác động cao chiết chức nhóm tế bào Th1, Th2 thơng qua định lượng số cytokin IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α,… - Tiến hành nghiên cứu đánh giá tác động cao chiết hợp chất tinh khiết thay đổi thành phần tế bào T CD4+ T CD8+ quần thể lympho T thời điểm khác Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đại học Y Hà Nội, (2006), Miễn dịch học, NXB Y học, Võ Văn Chi, (1991), Cây thuốc An Giang, Ủy ban khoa học kỹ thuật An Giang, An Giang, tr 477 Võ Văn Chi, (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tập 2, tr 635 Nguyễn Cẩm Hoàng, (2020), Khảo sát hoạt tính kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxi hóa độc tính Sậy non Phragmites australis (Cav.) Trin., Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, Lê Thị Thảo Nguyên, (2018), Sàng lọc dược liệu tác động lên tăng sinh in vitro tế bào máu ngoại vi người hoạt tính chống oxy hóa, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, Phạm Hồng Phiệt, (2010), Miễn dịch - Sinh lý bệnh, NXB Y học, Hồ Chí Minh, tr 1-100 Nguyễn Thị Minh Thuận, Nguyễn Cẩm Hoàng, (2019), Khảo sát độc tính cấp khả chống oxy hoá sậy Phragmites australis (Cav.) Trin, 17, Tạp chí Y Dược học, tr 42-48 Nguyễn Thanh Thy, Nguyễn Thị Bảo Anh, Nguyễn Thị Minh Thuận, (2018), Tối ưu hóa điều kiện ni cấy in vitro tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi người, 55 (1), Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, tr 71-78 Trần Thị Phương Uyên, (2018), Khảo sát hoạt tính độc tính tế bào ung thư vú cao chiết Hồng quân (Flacourtia indica (Burm.f.) Merr.) dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, Tiếng Anh 10 Almeida V., Avelar-Freitas B., Santos M., Costa L., et al, (2017), "Inhibitory effect of the Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng) RM King & H Rob Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh aqueous extract on human lymphocyte proliferation and IFN-γ and TNF-α production in vitro", Brazilian Journal of Medical Biological Research, 50 (8), 11 Amirghofran Z., Hashemzadeh R., Javidnia K., Golmoghaddam H., et al, (2011), "In vitro immunomodulatory effects of extracts from three plants of the Labiatae family and isolation of the active compound (s)", Journal of immunotoxicology, (4), pp 265-273 12 Andreotti P E., Cree I A., Kurbacher C M., Hartmann D M., et al, (1995), "Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma", Cancer research, 55 (22), pp 5276-5282 13 Aslantürk Ö S., (2018), "In vitro cytotoxicity and cell viability assays: principles, advantages, and disadvantages", Genotoxicity-A predictable risk to our actual world, pp 64-80 14 Chen S., Ju M., Luo Y., Chen Z., et al, (2013), "Hepatoprotective and antioxidant activities of the aqueous extract from the rhizome of Phragmites australis", Zeitschrift für Naturforschung C, 68 (11-12), pp 439-444 15 Cherng J.-M., Chiang W., Chiang L.-C., (2008), "Immunomodulatory activities of common vegetables and spices of Umbelliferae and its related coumarins and flavonoids", Food chemistry, 106 (3), pp 944-950 16 Chiang L.-C., Ng L T., Chiang W., Chang M.-Y., et al, (2003), "Immunomodulatory activities of flavonoids, monoterpenoids, triterpenoids, iridoid glycosides and phenolic compounds of Plantago species", Planta medica, 69 (07), pp 600-604 17 Chrzanowska C., Hunt S., Mohammed R., Tilling P., "The use of cytotoxicity assays for the assessment of toxicity", 18 de Abreu Costa L., Henrique Fernandes Ottoni M., Dos Santos M G., Meireles A B., et al, (2017), "Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Decreases Cell Proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 Cytokines Production in Cultures Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh of Peripheral Blood Lymphocytes", Molecules (Basel, Switzerland), 22 (11), pp 1789 19 Denizot F., Lang R., (1986), "Rapid colorimetric assay for cell growth and survival Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability", J Immunol Methods, 89 (2), pp.271-277 20 Denny T N., Jensen B D., Gavin E I., Louzao A G., et al, (1995), "Determination of CD4 and CD8 lymphocyte subsets by a new alternative fluorescence immunoassay", Clinical diagnostic laboratory immunology, (3), pp 330-336 21 Derouiche S., Manel A., Hamida A., (2017), "Effect of extracts aqueous of phragmites australis on carbohydrate metabolism, some enzyme activities and pancreatic islet tissue in alloxaninduced diabetic rats", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, (6), pp 54-58 22 Gaffen S L., Liu K D., (2004), "Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications", Cytokine, 28 (3), pp 109-123 23 Gasparini L S., Macedo N D., Pimentel E F., Fronza M., et al, (2017), "In vitro Cell Viability by CellProfiler(®) Software as Equivalent to MTT Assay", Pharmacognosy magazine, 13 (Suppl 2), S365-S369 24 Gilbert D F., Friedrich O., (2017), Cell viability assays, Springer, New York, 25 Grigore A., (2017), Plant phenolic compounds as immunomodulatory agents., London, UK: IntechOpen, pp 75-98 26 Hanlon P R., Robbins M G., Scholl C., Barnes D M., (2009), "Aqueous extracts from dietary supplements influence the production of inflammatory cytokines in immortalized and primary T lymphocytes", BMC complementary alternative medicine, (1), pp 1-11 27 Hoffman R D., Li C.-Y., He K., Wu X., et al, (2020), "Chinese herbal medicine and its regulatory effects on tumor related T cells", Frontiers in pharmacology, 11, pp 492 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 28 Hougee S., Sanders A., Faber J., Graus Y M., et al, (2005), "Decreased proinflammatory cytokine production by LPS-stimulated PBMC upon in vitro incubation with the flavonoids apigenin, luteolin or chrysin, due to selective elimination of monocytes/macrophages", Biochemical pharmacology, 69 (2), pp 241-248 29 Jenny M., Klieber M., Zaknun D., Schroecksnadel S., et al, (2011), "In vitro testing for anti-inflammatory properties of compounds employing peripheral blood mononuclear cells freshly isolated from healthy donors", Inflammation Research, 60 (2), pp.127-135 30 Kim S I., Kim H J., Lee H.-J., Lee K., et al, (2016), "Application of a nonhazardous vital dye for cell counting with automated cell counters", Analytical biochemistry, 492, pp 8-12 31 Klich M A., (2007), "Aspergillus flavus: the major producer of aflatoxin", Molecular plant pathology, (6), pp 713-722 32 List P H., Horhammer L., (1969-1979), Hager's handbuch der pharmazeutischen praxis, Vols.2-6, Springer-Verlag, Berlin, 33 López-Lázaro M., (2015), "A simple and reliable approach for assessing anticancer activity in vitro", Current Medicinal Chemistry, 22 (11), pp 13241334 34 Maji A K., Mahapatra S., Banerji P., Banerjee D., (2015), "Immunomodulatory effect of Wedelia chinensis and demethylwedelolactone by interfering with various inflammatory mediators", Oriental Pharmacy Experimental Medicine, 15 (1), pp 23-31 35 Miliotou A N., Papadopoulou L C., (2018), "CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy", Curr Pharm Biotechnol, 19 (1), pp 5-18 36 Mosmann T., (1983), "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays", Journal of immunological methods, 65 (pp 1-2), pp 55-63 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 37 Mueller H., Kassack M U., Wiese M., (2004), "Comparison of the usefulness of the MTT, ATP, and calcein assays to predict the potency of cytotoxic agents in various human cancer cell lines", Journal of biomolecular screening, (6), pp 506-515 38 Pourahmad J., Salimi A., (2015), "Isolated Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC), a Cost Effective Tool for Predicting Immunosuppressive Effects of Drugs and Xenobiotics", Iran J Pharm Res, 14 (4), pp 979 39 Reaume T., (2011), "Common Reed Grass Phragmites australis Poaceae— Grass family", Nature Manitoba, 40 Riss T L., Moravec R A., Niles A L., Duellman S., et al, (2016), "Cell viability assays", Assay Guidance Manual, 41 Sabu V., Peter J., Sasidharan Nair A I B., Krishnan S., et al, (2019), "Combinatorial Action of Triterpenoid, Flavonoid, and Alkaloid on Inflammation", Natural Product Communications, 14 (8), 42 Sachdeva N., Asthana D., (2007), "Cytokine quantitation: technologies and applications", Front Biosci, 12 pp 4682-4695 43 Salim E., Kumolosasi E., Jantan I., (2014), "Inhibitory effect of selected medicinal plants on the release of pro-inflammatory cytokines in lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells", Journal of natural medicines, 68 (3), pp 647-653 44 Santos N C., Figueira-Coelho J., Martins-Silva J., Saldanha C., (2003), "Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects", Biochemical pharmacology, 65 (7), pp 1035-1041 45 Sellal A., Belattar R., Bouzidi A., (2019), "Heavy metals chelating ability and antioxidant activity of Phragmites australis stems extracts", Journal of Ecological Engineering, 20 (2), Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 46 Sennikov S V., Krysov S V., Injelevskaya T V., Silkov A N., et al, (2003), "Quantitative analysis of human immunoregulatory cytokines by electrochemiluminescence method", Journal of immunological methods, 275 (1-2), pp 81-88 47 Shaltout K H., Al-Sodany M., Eid M., (2006), "Biology of common reed Phragmites Australis (cav.) trin ex steud: review and inquiry", Assiut University Center for Environmental Studies (AUCES), 48 Singh N., Tailang M., Mehta S., (2016), "A review on herbal plants as immunomodulators", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, (9), pp 3602 49 Singh V K., Sharma P K., Dudhe R., Kumar N., (2011), "Immunomodulatory effects of some traditional medicinal plants", J Chem Pharm Res, pp 675-684 50 Stone V., Johnston H., Schins R P., (2009), "Development of in vitro systems for nanotoxicology: methodological considerations", Crit Rev Toxicol, 39 (7), pp 613-626 51 Van Der Velden V H., (1998), "Glucocorticoids: mechanisms of action and anti-inflammatory potential in asthma", Mediators of inflammation, (4), pp 229-237 52 Vega-Avila E., Pugsley M K., (2011), "An overview of colorimetric assay methods used to assess survival or proliferation of mammalian cells", Proc West Pharmacol Soc, 54 (54), pp 10-40 53 Verhoeckx K., Cotter P., López-Expósito I., Kleiveland C., et al, (2015), The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models, Springer Nature, pp.161-165 54 Xu W., Wang X., Tu Y., Masaki H., et al, (2019), "Plant‐derived alkaloid sinomenine potentiates glucocorticoid pharmacodynamics in mitogen‐ activated human peripheral blood mononuclear cells by regulating the translocation of glucocorticoid receptor", 33 (1), pp.187-196 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 55 Yao X., Li G., Bai Q., Xu H., et al, (2013), "Taraxerol inhibits LPS-induced inflammatory responses through suppression of TAK1 and Akt activation", International immunopharmacology, 15 (2), pp 316-324 56 Zhang M., Huang B., (2012), "The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells", Stem Cell Res Ther, (6), pp 48 57 Zhang X., WHO, (2000), "General guidelines for methodologies on research and evaluation of traditional medicine", World Health Organization, (1), pp.71 58 Zhu L., Zhang D., Yuan C., Ding X., et al, (2017), "Anti-Inflammatory and antiviral effects of water-soluble crude extract from Phragmites australis in vitro", Pakistan journal of pharmaceutical sciences, 30 (4), pp 1357-1362 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-1 PHỤ LỤC Phụ lục Kết phân tích CD3+CD4+ CD3+CD8+ (chạy phần mềm BD FACSDiva 9.0) - Mẫu chứng: - Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn n-hexan 200 ppm: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-1 - Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn chloroform 200 ppm: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-2 Phụ lục 2: Kết tác động cao chiết Sậy lên PBMCs sau 24 Loại cao chiết Nồng độ (ppm) 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 TP H CF EA N Chứng Tỉ lệ tế bào sống so với mẫu chứng (%) nồng độ 72,24 ± 7,65 64,49 ± 7,38 57,14 ± 11,38 52,24 ± 9,27 45,31 ± 2,12 40,41 ± 9,80 39,18 ± 1,22 41,63 ± 1,22 47,14 ± 7,96 82,04 ± 6,12 99,18 ± 11,02 123,06 ± 4,29 45,92 ± 4,29 44,49 ± 5,10 62,04 ± 2,55 60,61 ± 3,06 88,98 ± 5,79 33,67 ± 1,84 76,73 ± 7,78 60,00 ± 8,57 77,96 ± 6,96 55,51 ± 15,50 50,20 ± 9,80 53,88 ± 4,90 79,59 ± 3,24 86,33 ± 4,29 57,14 ± 6,74 52,65 ± 3,24 36,73 ± 2,45 57,55 ± 9,72 100 ± 3,74 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Giá trị p 0,03 0,018 0,025 0,014 < 0,0001 0,01 0,001 0,002 0,009 0,023 0,914 0,006 < 0,0001 0,001 0,001 0,001 0,07 0,001 0,043 0,018 0,017 0,04 0,014 0,001 0,006 0,025 0,002 < 0,0001 < 0,0001 0,019 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-3 Phụ lục 3: Kết tác động cao chiết Sậy lên PBMCs sau 48 Loại cao chiết Nồng độ (ppm) 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 TP H CF EA N Chứng Tỉ lệ tế bào sống so với mẫu chứng (%) nồng độ 62,50 ± 6,25 46,25 ± 5,00 54,58 ± 15,53 58,33 ± 2,60 67,92 ± 6,17 79,17 ± 3,82 128,13 ± 1,88 105,00 ± 13,05 80,00 ± 14,20 64,17 ± 13,77 73,33 ± 11,61 58,75 ± 5,00 127,50 ± 1,25 126,25 ± 3,75 78,75 ± 5,00 80,00 ± 13,17 67,92 ± 4,39 58,75 ± 11,25 77,92 ± 3,15 78,33 ± 4,02 71,25 ± 4,51 62,08 ± 8,32 76,67 ± 15,83 78,75 ± 3,75 65,83 ± 10,41 60,83 ± 5,05 55,83 ± 9,04 64,38 ± 9,37 54,58 ± 5,20 62,92 ± 9,38 100 ± 3,31 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Giá trị p 0,003 0,001 0,038 < 0,0001 0,004 0,006 0,001 0,586 0,141 0,048 0,062 0,001 0,005 0,003 0,009 0,125 0,002 0,026 0,004 0,005 0,003 0,018 0,13 0,005 0,032 0,002 0,015 0,025 0,001 0,023 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-4 Phụ lục 4: Kết tác động cao chiết Sậy lên PBMCs sau 72 Loại cao chiết Nồng độ 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 TP H CF EA N Chứng Tỉ lệ tế bào sống so với mẫu chứng (%) nồng độ 78,95 ± 7,37 61,05 ± 8,42 88,42 ± 8,42 61,05 ± 8,42 66,32 ± 11,58 137,89 ± 7,37 73,68 ± 4,21 80,00 ± 8,42 62,11 ± 3,16 41,05 ± 7,37 67,37 ± 12,63 58,95 ± 10,53 63,16 ± 6,32 66,32 ± 7,37 54,74 ± 8,42 71,58 ± 4,21 95,79 ± 5,26 125,26 ± 9,47 91,23 ± 11,59 58,95 ± 13,15 83,51 ± 9,95 80,00 ± 8,42 89,82 ± 14,94 56,84 ± 12,63 104,21 ± 5,26 111,58 ± 6,32 104,21 ± 7,37 110,53 ± 1,05 117,89 ± 12,63 134 ± 8,42 100 ± 3,16 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Giá trị p 0,045 0,017 0,156 0,017 0,04 0,015 0,003 0,061 < 0,0001 0,006 0,049 0,023 0,012 0,018 0,013 0,003 0,32 0,048 0,334 0,034 0,112 0,061 0,368 0,029 0,32 0,105 0,459 0,032 0,14 0,022 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-5 Phụ lục 5: Kết tác động cao chiết Sậy lên sản xuất IL – 1β PBMCs sau 48 Loại cao chiết Nồng độ (ppm) Nồng độ IL - 1β (pg/ml) 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 98,06 ± 0,43 135,28 ± 0,38 101,11 ± 0,32 96,09 ± 0,32 100,90 ± 0,44 104,06 ± 0,16 113,67 ± 0,43 86,90 ± 0,43 110,83 ± 0,37 136,44 ± 0,48 81,67 ± 0,32 110,86 ± 0,46 113,64 ± 0,47 117,04 ± 0,34 119,78 ± 0,34 119,14 ± 0,26 128,51 ± 0,47 98,30 ± 0,26 125,39 ± 0,28 126,44 ± 0,48 121,18 ± 0,21 113,18 ± 0,38 102,79 ± 0,37 104,76 ± 0,42 118,20 ± 0,26 95,67 ± 0,26 121,00 ± 0,32 109,49 ± 0,48 120,86 ± 0,28 100,97 ± 0,32 136,10 ± 1,34 Cao TP H CF EA N Chứng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tỉ lệ ức chế sản xuất IL - 1β trung bình so với mẫu chứng (%) 27.95 0.60 25.71 29.40 25.86 23.54 16.48 36.15 18.57 39.99 18.54 16.50 14.00 11.99 12.46 5.57 27.77 7.87 7.09 10.96 16.84 24.47 23.03 13.15 29.70 11.09 19.55 11.19 25.81 Giá trị p 0.001 0.419 < 0,001 0.001 0.001 < 0,001 0.001 < 0,001 0.001 < 0,001 0.001 < 0,001 0.012 0.002 0.002 0.002 0.001 0.001 0.001 0.001 0.003 0.007 0.005 0.001 0.003 0.001 0.003 < 0,0001 0.002 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-6 Phụ lục 6: Kết tác động cao chiết Sậy lên sản xuất IL-2 PBMCs sau 48 Loại cao chiết Nồng độ (ppm) Nồng độ IL-2 (ng/ml) 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 0,1 10 50 100 200 471,39 ± 2,17 220,92 ± 1,09 178,89 ± 1,07 102,23 ± 1,09 99,96 ± 1,29 12,82 ± 0,62 525,32 ± 3,09 178,06 ± 0,74 48,42 ± 0,55 48,42 ± 0,55 16,99 ± 1,25 19,85 ± 0,55 122,70 ± 0,74 140,92 ± 0,41 128,42 ± 0,55 30,20 ± 0,41 16,51 ± 1,09 17,23 ± 0,21 512,70 ± 3,20 207,94 ± 0,21 241,63 ± 1,09 317,23 ± 1,44 173,54 ± 0,62 22,82 ± 0,62 230,68 ± 0,71 222,11 ± 0,36 318,54 ± 1,56 222,58 ± 0,74 388,18 ± 1,24 198,89 ± 0,36 241,87 ± 5,05 Cao TP H CF EA N Chứng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tỉ lệ ức chế sản xuất IL-2 trung bình so với mẫu chứng (%) 8,66 26,04 57,73 58,67 94,70 26,38 79,98 79,98 92,98 91,80 49,27 41,74 46,91 87,51 93.17 92,88 14,03 0,10 28,25 90,56 4,63 8,17 7,97 17,77 Giá trị p 0,02 0.002 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,002 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,001 0,001 0,001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,007 0,944 0,002 < 0,0001 0,06 0,021 0,023 0,005